BIOQUIMICA BACTERIANA

I) OBJETIVO
- Aprender a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones metabólicas que
tienen frente a los diferentes reactivos o medios de cultivo.

II) MARCO TEORICO

BIOQUIMICA BACTERIANA
El conocimiento de la actividad bioquímica de la bacteria es indispensable para una
adecuada caracterización de la especie. En los cultivos bacterianos diferentes pueden
tener las características morfológicas y culturales muy similares pero se diferencian por
sus reacciones metabólicas.
Los resultados positivos o negativos del ensayo se verificara mayormente con el cambio
de color del medio o algún otro cambio en el aspecto del indicador utilizado

PRUEBAS:
1. PRUEBA DE LA OXIDASA
El sistema de citocromos está compuesto por una serie de proteínas conjugadas, los
citocromos, cada uno de los cuales contiene firmemente unido un grupo prostético
llamado hemo. Los hemos son compuestos que contienen hierro.
Los citocromos desprenden los electrones transferidos a los componentes siguientes de
la cadena, hasta que el último de ellos la enzima citocromo c. oxidasa los cede al
oxígeno.
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la
oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidación
del citocromo el cual es reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o
peróxido de hidrógeno según

2. PUEBA DE LA CATALSA
Según Bach, en las células existe un sistema oxidativo que consta de la oxigenada que
con el oxígeno molecular y peroxidasa producen peróxidos que transportan el oxígeno
activado al sustrato oxidable.
La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen
citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en
agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta
prueba es separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp.
(Negativa).
 3. REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS
Una propiedad distintiva de muchos microorganismos es el poder para reducir varias
sustancias. Algunas bacteria pueden reducir el nitrito hasta amoniaco pero el producto
final es la reducción del nitrógeno molecular.
Una propiedad distintiva de muchos microorganismos es el poder para reducir varias
sustancias. Algunas bacteria pueden reducir el nitrito hasta amoniaco pero el producto
final es la reducción del nitrógeno molecular.
La reducción de nitrato en nitrito está indicada por la aparición de color cuando el
nitrito reacciona con los dos reactivos. La reacción de color resultante se debe a la
formación de un compuesto diazoico, p-sulfobenceno-azo-alfa-naftilamina. Bernard D.
(1978).

4. PRUEBA DE INDOL
El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar
tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético. Diversas enzimas
intracelulares que intervienen en éste proceso reciben el nombre de triptofanasa, lo que
implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la producción del indol. El
principal intermediario en la degradación del triptófano es el ácido indol pirúvico. La
degradación del triptófano libera indol, ácido pirúvico, amoniaco y energía. El ácido
pirúvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucolítico o entrar en
el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran producción de energía. El NH3
puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminoácidos empleando la energía que se
encuentra para la reacción anabólica
La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de
fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentación de
la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibirla enzima. El agregado
de triptófano estimula la producción de indo mientras que la glucosa la inhibe

5. DESCARBOXLIACION DE LA LISINA
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina
y arginina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.
La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas
descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo
carboxilo dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico. La descomposición de
los aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de descarboxilación es
irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima común, el fosfato de piridoxal. El
aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina y CO2por acción de
la enzima específica lisina-descarboxilasa
 6. PRUEBA DEL CITRATO DE SIMMONS
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de
carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El medio incluye
citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como
única fuente de nitrógeno.
Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la
coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato
comprende un sistema enzimático sin la intervención de la coenzima A. Esta enzima se
denomina citritasa o citrato desmolasa

7. PRUEBA DEL ACIDON FENIL PIRUVICO-APP

Determina la capacidad de un organismo de desaminar la fenilalanina en ácido fenil
pirúvico por su actividad enzimática, con la consiguiente acidez resultante. El
aminoácido aromático fenilalanina sufre una desaminación oxidativa catalizada por un
aminoácido oxidasa para producir el ácido cetónico. La desaminación oxidativa da
como resultado la extracción del grupo amino del aminoácido para formar un doble en
la cealfa-cetoácido y libre de amoniaco

8. REACCIÓN DE LA UREASA
La capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de
amoniaco por la acción de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el
medio. La hidrólisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos moléculas de
amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la
descomposición de los compuestos orgánicos

9. HIDROLISIS DE LA GELATINA
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico
(gelatinasas) que licuan la gelatina. Las proteínas que se producen naturalmente son
demasiado grandes para entrar en una célula bacteriana; por lo tanto, para que una
célula utilice las proteínas, primero deben ser catabolizadas en componentes más
pequeños. Las enzimas exonucleares de tipo protelítico, gelatinasas, son secretadas por
ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación
bacteriana. Geneser, F. (1986).

10. HIDRLISIS DEL ALMIDON

La molécula del almidón es muy compleja y para su asimilación por las bacterias, estas
deben descomponerla (hidrolizarla) en sustancias más simples y fácilmente asimilables.
Un gran número de bacterias son capaces de elaborar una enzima amilasa que hidroliza
el almidón con formación de maltosa. La maltosa puede ingresar a la célula para ser
utilizada. La enzima amilasa es también una enzima extracelular, por lo tanto la
demostración de la hidrólisis del almidón puede hacerse tanto en medio líquido como en
medio sólido.

III) PARTE EXPERIMENTAL

3.1.- Materiales, equipos y reactivos
- Tubos de ensayo
- Aguja de kolle
- Mechero
- Estufa a 37 ºC
- Placa Petri
- Papel filtro whatman
- Caldo de Urea
- Sol. De dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina
- Sol. De peróxido de hidrogeno
- Agar nutritivo
- Caldo nitrato
- Ácido sulfanìlico
- Ac. Tartárico
- Reactivo de kovac’s
- Agar citrato de Simmons
- Cloruro férrico
- Agar LIA
- Agar gelatina
- Agar almidón
- Lugol
- Solución clorhídrica

3.2.- Metodología
a) Prueba de la oxidasa
- Se colocó el papel de filtro whatman en una lámina porta objetos e impregnamos con
la solución de dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina.
- Con una aguja de kolle, tomamos una porción de cultivo en agar nutritivo y
realizamos una estría sobre la superficie del papel.

Imagen Nº 1
 b) Prueba de la catalasa
- Embebamos un pedazo de papel filtro whatman con 0.5 ml de peróxido de hidrogeno
de 20 volúmenes.
- Tomamos una asada a partir de cultivo puro y llevamos a la zona embebida.

Imagen Nº 2

c) Reacción de nitratos a nitritos

- Sembramos la cepa en un medio de caldo nitrato, luego incubamos a 37 ºC durante
24 horas.
- Finalmente se leyó los resultados añadiéndolo al tubo el reactivo (1 % de alfa-
naftalamina, 10 % de ácido sulfanilico y 89 % acido tartárico)

Imagen Nº 3
 d) Hidrolisis de la UREA
- Sembramos la cepa en un tubo con caldo de UREA, luego incubamos a 37 ºC durante
24 horas.
Imagen Nº 4

e) Pruebas del Indol

- Sembramos la cepa en un tubo de caldo de triptona, incubamos a 37 ºC por 24 horas.
- Finalmente se leyó los resultados añadiéndole gotas del reactivo de kovac’s.

Imagen Nº 5
 f) Prueba del citrato de Simmons
- Sembramos la cepa en un tubo con Agar citrato de Simmons, incubamos el tubo por
24 h – 48 h.
Imagen Nº 6

g) Prueba del ácido fenil pirúvico – APP

- Sembramos la cepa en un tubo con agar nutritivo con medio inclinado, incubamos a
37 ºC por 24 h – 48 h.
- Finalmente se leyó los resultados añadiéndole gotas de cloruro férrico.
Imagen Nº 7
 h) Descarboxilaciòn de la lisina
- Sembramos la cepa en un tubo con agar LIA, incubamos a 37 ºC por 24 horas.

Imagen Nº 8

i) Prueba de la oxidación – fermentación O/F

- Sembramos la cepa en los tubos en forma de picadura, a uno de ellos se agregó
parafina estéril y se llevó a incubar a 37 ºC por 24 horas.
Imagen Nº 9 y 10
 j) Hidrolisis del almidón
- Sembramos la cepa por el método francés de las 21 líneas sobre un agar almidón
(agar nutritivo con 1 % de almidón) en placa Petri, incubamos a 37 ºC por 24 horas.
- Finalmente se leyó los resultados con la adición de gotas del reactivo de lugol.

Imagen Nº 11

k) Hidrolisis de la gelatina
- Sembramos la cepa por el método francés de las 21 líneas sobre un agar gelatina en
placa Petri, incubamos a 37 ºC por 24 horas.
- Finalmente se leyó los resultados con la adición de gotas de solución clorhídrica.

IV) RESULTADOS

Prueba de la oxidasa Prueba de la catalasa

Reacción positiva por la aparición del

color característico de la reacción Reaccion positiva por la presencia de
indicando que si se puede teñir a la efervescencia de oxigeno.
Pseudomona Aeruginosa.
Reacción de nitratos a
nitritos
La reacción fue positiva
agregando el polvo de zinc,
esto indica que la bacteria
pseudomona Aeruginosa
tiene la enzima nitrato-
reductasa por lo que puede
reducir el nitrato.
Prueba del citrato de
Simmons
Reacción positiva por el
cambio de color de verde a
azul, indicando que la
Pseudomona Aeruginosa es
capaz de utilizar citrato
como única fuente de
carbono para el
metabolismo y crecimiento,
provocando alcalinidad.
Hidrolisis de la UREA
Reacción negativa,
mantuvo su color
indicando que la bacteria
Pseudomona Aeruginosa
no tiena la capacidad de
desdoblar la urea.
Prueba del ácido fenil
pirúvico – APP
Reacción negativa,
indicado por el color
amarillo que se formó con
el cloruro férrico, la
Pseudomona Aeruginosa
no tiene la capacidad de
desaminar la fenilalanina
en ácido fenil pirúvico por
su actividad enzimática.
Pruebas del Indol
Reacción negativa, los
anillos obtenidos fueros
de color amarillo,
indicando que la
Pseudomana Aeruginosa
no es capaz de fermentar
los hidratos de carbono.
Descarboxilaciòn de la
lisina
Reacción negativa,
mantiene su color indicando
que la Pseudomona
Aeruginosa no tiene la
capacidad enzimática para
descarboxilar un
aminoácido (lisina y
arginina) para formar una
amina.
Prueba de la oxidación – Hidrolisis del almidón Hidrolisis de la gelatina
fermentación O/F

O/F oxidativa porque solo Reacción negativa, Reacción negativa,

reacciono con la que está a
condiciones aeróbicas
cambiándolo de color a
amarillo, degradando la
glucosa hasta acido.
Pseudomona Aeruginosa
no es capaz de elaborar
una enzima amilasa que
hidroliza el almidón con
formación de maltosa.
Pseudomona Aeruginosa no
tiene la capacidad de
producir enzimas de tipo
proteolítico (gelatinasas)
que licuan la gelatina.

V) DISCUSIONES
-(Bernard, 1978) El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa
al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es
menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo
(reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro.
En nuestra práctica se trabajó con solución acuosa de Dihidrocloruro de tetrametil
parafenilendiamina el cual también tiñe las colonias oxidasa positiva de color lavanda
que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
-(Bernard, 1978) El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa. El
peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria del azúcar por vía
oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan
mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).
En nuestra practica se pudo comprobar este proceso debido a la efervescencia de
oxigeno indica la prueba positiva.
-(Bernard, 1978) El indol es uno de los productos de degradación metabólica del
aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoníaco. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo
cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído.
En nuestra práctica se trabajó con un medio de cultivo el cual no era rico en triptofano
ya que resulto una prueba negativa porque no se pudo observar el anillo rojo grosella.
VI) CONCLUSIONES
-Se aprendió a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones metabólicas que
tienen frente a los diferentes reactivos o medios de cultivo. Con los resultados de la
prueba oxidasa que resultó positiva, concluimos que hay presencia de citocromos en la
Pseudomona Aeruginosa. Con los resultados de la prueba Catalasa que resultó positiva,
concluimos que la Pseudomona Aeruginosa contiene la enzima catalasa, ya que al
colocarlo en peróxido de hidrógeno, éste burbujeo. Con los resultados de la hidrólisis de
la urea que resultó negativa, concluimos que la Pseudomona Aeruginosa no posee la
capacidad de hidrolizar la urea ya que no contiene la enzima ureasa. Con los resultados
de la prueba de Indol que resultó negativa, concluimos que la Pseudomona Aeruginosa
no tiene la capacidad de degradar al triptófano produciendo indol. Con los resultados de
la reducción de nitritos a nitratos (NO-2) que resultó positiva, concluimos que la
Pseudomona Aeruginosa para su respiración es capaz de utilizar el O2 atrapado en las
moléculas de nitrato y lo reducen a nitrito. Con los resultados de la prueba del Ácido
fenol pirúvico (APP) que resultó negativo, concluimos que la Pseudomona Aeruginosa
no puede transformar a la fenilalanina en APP. Con los resultados de la asimilación de
citrato (C) que resultó positiva, concluimos que la Pseudomona Aeruginosa tiene la
capacidad de crecer en un medio donde la única fuente de carbono se encuentra en
forma de citrato de sodio. Con los resultados de la hidrólisis de almidón que resultó
negativa, concluimos que la Pseudomona Aeruginosa no degrada el almidón en amilasa.
Con los resultados de la hidrólisis de la gelatina que resultó negativa, concluimos que la
Pseudomona Aeruginosa no posee la enzima gelatinasa capaz de degradar a la gelatina.

VII) REFERENCIAS
-Bernard D. (1978). Tratado de microbiología: con inclusión de inmunología y genética
molecular 2a. ed., Barcelona: Ed. Salvat.
-Geneser, F. (1986). Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.