PRACTICA N°4 DE MICROBIOLOGIA

NUMERACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

I. INTRODUCCION:

La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, no exigentes,

catalasa positivos, con agrupación en racimos, aerobios o anaerobios facultativos. De
los tres géneros que la integran, Micrococos, Planococcus y Staphylococcus
, este último es el único de importancia médica. Se caracteriza por
ser aerobio – anaerobio facultativo, capaz de fermentar la glucosa en
anaerobiosis; poseer ácidos teicoicos en su pared, y ser sensible a la enzima
lisostafina .Dentro del género Staphylococcus se conocen más de 20
especies, de las cuales S. aureus es la más importante. Otras especies
como S. epidermidis y S. saprophyticus
son actualmente reconocidas como capaces de actuar como patógenos bajod
eterminadas circunstancias.La infección estafilocócica es conocida desde la
antigüedad. En la actualidad el género Staphylococcus y, en especial, la
especie tipo S. aureus tiene una alta incidencia como agente de infección,
tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. Es la primera como
agente de infecciones, desde superficiales como el forúnculo, a profundas
como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel
nosocomial se destaca como primer agente de infección de heridas
operatorias y de prótesis. Asimismo. Aureus es capaz de causar cuadros
TÓXICOS por producción de potentes exotoxinas tales como intoxicación
alimentaria, síndrome de piel escaldada y shock tóxico. Además cabe
destacar la gran capacidad de adaptación y supervivencia de esta bacteria,
su aumento progresivo de resistencia a los antimicrobianos, en especial en el
medio hospitalario, que plantea serios problemas epidemiológicos y terapéuticos. Del
punto de vista de sus factores de virulencia, tanto bioquímicos como
estructurales,s e l o p u e d e d e f i n i r c o m o u n " p a t ó g e n o p e r f e c t o " ,
m a g n í f i c a m e n t e e q u i p a d o p a r a colonizar, invadir, diseminarse y
causar enfermedad grave. No obstante, normalmente convive en armonía
con el huésped humano o animal, formando parte de su flora sin
causar daño. Inclusive en algunos casos se encuentran personas
sanas pesadamente colonizadas, definiéndose como "portadores" y
pudiendo en ocasiones ser reservorio y fuente de infección.
 II. OBJETIVOS

 Determinar la numeración de staphylococcus aureus en muestras de

alimentos.
 Diferenciar dentro del género de staphylococcus las especies no
patógenas y la patógena.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Morfología
El S. aureus es un coco inmóvil, de 0.8 a 1 micrómetro de diámetro, que se
divide en tres planos para formar grupos de células irregulares semejantes a
racimos de uvas. En extendidos de pus los cocos aparecen solos, en pares, en
racimos o en cadenas cortas. Los racimos irregulares son característicos de
extendidos tomados de cultivos que se desarrollan en medios sólidos,
mientras que en otros cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en
cadenas cortas. Unas pocas cepas producen una capsula o capa de baba que
incrementa la virulencia del microorganismo.
El S. aureus es un microorganismo Gram positivó pero las células viejas y los
microorganismos fagocitados se tiñen como gramnegativos.

Staphylococcus aureus (pronunciación: /ˌstafiloˈkokus ˈawrews/), conocido

como estafilococo áureo, o comúnmente estafilococo dorado, es
una bacteria anaerobia facultativa, gram positiva, productora
de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente
distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se
hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella.1
Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones
cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis,
forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como
celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis
o neumonía. Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya
sea por presencia física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de
la enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria.
En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante
de las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho
de que esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres
humanos, lo que permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda
penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio del contacto directo
o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con
otro paciente.2
Las cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina,
dejando como los antibióticos más eficaces para combatirlos a
los aminoglucósidos, las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina.3 Además de
la administración del tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser
conveniente, en función del caso, la eliminación de puertas de entradas como
catéteres venosos permanentes o drenajes quirúrgicos.
IV. EQUIPOS Y MATERIALES:

 Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la muestra

de alimento
 Placas de Petri de vidrio (100x 15mm) o de plástico de 90 x 15mm.
 Pipetas de1ml graduadas al 0.1
 Extensores de vidrio
 Baño de agua regulado a 44-46ºC
 Incubadora regulada a 35º-37ºC
 AGAR SAIR- PARKER
 Caldo de cerebro-corazón
 Tubos de 75 x 10mm contenido 0.3ml de plasma de conejo.
V. PROCEDIMIENTO

1. Desmenuzar la muestra de queso y pesarlo

2. Añadirle agua peptonada y filtrarlo

3. Preparar diluciones 10−1 , 10−2 , 10−3 , y 10−4

4. Pipetear 0. 1ml del homogenizado y las diluciones por duplicado en la
superficie de las placas de Agar BAIRD PARKER previamente secadas
y, distribuir cada inoculo con un extensor de vidrio hasta que la
superficie del medio aparezca seca.

ABP ABP ABP ABP ABP

5. Incubar las placas en posición invertida a 37±1ºC durante 30-48horas.

6. Después de 30 horas de incubación seleccionar las placas que

representan entre 20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias
negras y brillantes con borde blanco angosto rodeadas de zonas claras
que contrastan con el medio opaco. Estas colonias corresponden a
Staphylococcus aureus.
7. Marcar la posición de las colonias a incubar las placas durante 18 horas
adicionales.
8. Al final del periodo de incubación (48horas) contar todas las colonias
con las características descritas anteriormente y además aquellas
colonias negras brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras.
Someter un número significativo de colonias sospechosas (no menor a
5) la prueba de la coagulasa. Algunas cepas de S. aureus pueden
aparecer rodeadas de zona opaca después de 30 horas de incubación
de 35-37ºC, para un gran número de cepas a veces no muestra esta
apariencia después de 48 horas y someter a un número equivalente de
ellas a la prueba de la coagulasa. esta prueba servirá para distinguir
aquellos cultivos de S. aureus (coagulasa positivo) de S. epidermidis
(coagulasa negativa) que puedan dar una apariencia similar
 VI. RESULTADOS:

Numeración de staphylococcus aureus

MUESTRA -3 -4 -5

Carne molida 470000 400000

Queso fresco 2100000 100000

Queso de chancho 3400000 1000000

VII. CONCLUSIONES

En base a los resultados obtenidos en el laboratorio, concluimos que el queso

es contiene una gran cantidad de Staphylococcus aureus coagulasa positivo,
pero se ve amplificado muchas veces debido al mal uso que hace el hombre
de las BPM para poder controloar esta propagación de Staphylococcus
aureus coagulasa positivo.

VIII. RECOMENDACIONES

Como medidas vitales de control se recomienda:

1. Manipular lo menos posible los alimentos cocinados semiterminados y

terminados. Especial cuidado se tendrá con los alimentos cocinados
calientes que preferentemente deberán enfriarse a 18º C cuando se
tengan que manipular posteriormente (roti de pavo).
 2. Las personas con lesiones sépticas no deben manipular los alimentos;
debido al alto porcentaje de portadores nasales humanos sería
impracticable prohibir a estos portadores que manipulasen los
alimentos por lo que todos los operarios deben emplear guantes de un
solo uso, mascarillas y gorros de malla.
3. Cuando los alimentos hayan de conservarse es imprescindible un
tratamiento térmico adecuado, seguido de una rápida refrigeración a
10º C o menos.
4. Debe minimizarse la contaminación cruzada de los alimentos cocinados
con los crudos y con las superficies, equipo y utensilios sucios.

IX. CUESTIONARIO

1.-¿Cómo se aplica este indicador microbiológico en la producción de

la leche y productos lácteos?

Se impone entonces un especial control de los manipuladores, con el

empleo de gorros y mascarillas. En este último caso, hay que cuidar que
se tape la entrada de la nariz. En muchas ocasiones, como es incómodo,
los manipuladores dejan libres sus fosas nasales, lo que permite la salida
de S. aureus. Hay que evitar este foco de contaminación y forzar a tapar
completamente boca y nariz.

2.-¿Cómo se aplica este indicador para evaluar la calidad del aire de

los talleres de producción de alimentos?

La calidad del aire está determinada por su composición. La presencia o

ausencia de varias sustancias y sus concentraciones son los principales
factores determinantes de la calidad del aire en los talleres de
producción. Debido a esto, la calidad del aire se expresa mediante la
concentración o intensidad de contaminantes, la presencia de
microorganismos, o la apariencia física.

3.-¿Cómo se aplica este indicador para evaluar la calidad de comidas

preparadas y productos de pastelería?

La causa principal de esta forma de toxiinfección alimentaria son los

alimentos cocinados, manipulados por portadores de S. aureus (entre el
30 y el 40 % de las personas sanas son portadoras), especialmente por los
 que presentan lesiones sépticas, que después se han almacenado mucho
tiempo estando todavía calientes. Las carnes curadas cocidas,
especialmente jamón, con las que se preparan bocadillos y otros tipos de
menú para consumir en frío son las más corrientemente implicados, lo
mismo que otras carnes frías incluidas las de las aves.

Otros alimentos implicados con menor frecuencia en brotes de esta

naturaleza son los ovoproductos, como natillas, productos de pastelería
rellenos de crema artificial, pasteles de crema y gambas cocidas peladas.
Los manipuladores de alimentos son unos de los más implicados en la
aparición de intoxicaciones alimentarias de este tipo. Por este motivo, los
productos que requieren un grado de preparación importante, y por tanto
de manipulación, son los más implicados.

4.-Indique como se realiza la prueba de la coagulasa

La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus

del coagulase-negative staphylococcus. S.aureus produce 2 formas de
coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa
ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar
mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre
con una prueba de coagulasa de tubo.

Prueba de portaobjetos

Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo

para descartar auto aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en un
portaobjetos rotulado con el número de muestra, Test (T) y control (C). Las
2 gotas son emulsionadas con el organismo de prueba mediante el uso de un
cable de lazo, cable recto, o un palo de madera. Se pone una gota de plasma
(plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)1) en la gota de solución salina
inoculada correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de
madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.
Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroscópica en el plasma en
los 10 segundos, mientras que no se observará aglutinación en la gota de
solución salina.
Si es negativo: No se observara aglutinación.
NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberìa
hacerse una prueba de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos
gotas es un indicativo de auto aglutinación y por lo tanto debemos descartar
la prueba de tubo.

Prueba del tubo de ensayo

Coágulos formados por la reacción de la coagulasa en un tubo de ensayo

La prueba se utiliza plasma que ha sido inoculado con una colonia de
staphylococcal (por ejemplo, con un coco gram positivo catalasa positivo).
Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1½ horas. Si es negativo
entonces continuamos la incubación por unas 18 horas.
Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero
coagulará,2 dando como resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan
desarrollado que el líquido se solidifica completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece líquido. Un resultado negativo podría
indicar que se podría tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas
más precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o
métodos de BBL CRYSTAL.

X. BIBLIOGRAFIA

1.- Bourgeois C.M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental S.A.1995.

2.-Frazier ,W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España 2000.
3.- Mossel.D.Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000.
4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Análisis Microbiológico de
Alimentos.
7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la
agricultura y la Alimentación. Roma.