FACULTAD DE CIENCIAS

ESPECIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

MODULO DE:
INSTRUMENTACIÓN QUIMICA AVAMZADA II
Y METODOS DE SEPARACIÓN

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE AMINOACIDOS EN ORINA

PRESENTADO POR:
HERNAN MAURICIO RIVERA ESCOBAR

PRESENTADO A:
JAIME CASAS

Bogotá, agosto 12 de 2008

 INTRODUCCIÓN

Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque
son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay
métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos
aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptófano; reacción con el ácido glioxílico), un anillo
fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados (cisteina; reacción con nitroprusiato sódico). En general, en
todos los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar
cualitativa o si es el caso cuantitativamente por espectroscopía visible.

De todos los métodos mencionados anteriormente, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La
ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación
de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a nidrindantina. La nidrindantina reacciona a su vez
con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-
púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está
sustituido). Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de la composición de
las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más
confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia.

Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es
posible identificar si una determinada fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína
debe degradarse hasta liberar los aminoácidos que la componen y luego estos se separan en una placa de gel de sílica. La
placa se gira 90o y se desarrolla con un segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo
de ácido fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas direcciones
se conocen como TLC bidimensional.

Objetivo 1. Reconocer la técnica cromatográfica de capa fina como una técnica de separación empleada en
bioquímica.

La cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography”, en terminología inglesa), es una variante de la
cromatografía en columna. Se basa en el principio del reparto entre dos fases.
En ésta se puede utilizar como soporte, cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse
uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas,
silicato de magnesio, etc.) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la
separación de compuestos no polares, por ejemplo lípidos. En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de
espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales
suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender
sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente
agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización.

• Aplicación de la muestra

En cromatografía, las muestras, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de
la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar la resolución (separación de los componentes de una
mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones
concentradas bastará una cantidad muy pequeña, usualmente en microlitros, esto permite aplicar suficiente cantidad de los
solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas,
deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios µl) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de
interés. En este caso conviene hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva
adición hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy grande,
distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de aplicación).
 Figura 1. Aplicación de las muestras en la placa

Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque o cámara cromatográfica) y uno de
los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el
fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por
capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas
(coeficientes de reparto).

Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las
manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se
determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de
referencia. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus
propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La
identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus referencias con los de patrones, de naturaleza química
conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden
eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado.

Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar
formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes
acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola
dirección, la CCF puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una única muestra, que se
dispone en uno de los vértices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones
perpendiculares.

• Ventajas de la CCF respecto a cromatografías alternativas

1. Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas.

2. Una mayor velocidad de separación.
3. Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes.
4. Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple.

La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que pueden formarse partículas muy finas del soporte, por lo que la relación
superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran área superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la
cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografía en
papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de las
moléculas.

Objetivo 2. Utilizar la cromatografía de capa fina para separar los aminoácidos presentes en una muestra problema.

Para identificar los aminoácidos y carbohidratos presentes en la muestra de orina, se dispuso de placas grandes y pequeñas,
comerciales y artesanales, tratadas con sílica y yeso (Ver foto 1) sobre las cuales se aplicó fluido biológico (orina), en una
patrones de aminoácidos y en otras de carbohidratos.
 Patrones de CHO

Patrones de aa

Foto 1. Placas pequeñas artesanales (con sílica y yeso).

La tabla que se presenta a continuación (Tabla 1) esquematiza la distribución de las placas pequeñas artesanales,
aminoácidos y solventes para cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio.

NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 1 PRUEBA 2 PRUEBA 3

Ninna S1* S1 S4* ppa1 Arg Ala Met Glu Val
Alejandra S1 S1* S2 ppa Glut Ala ILe Tre Cis Prop
Mauricio S1 S3 S3* ppa Lis Ser ILe Tre Val Prop Cit His Trp
Yara S1 S1 S2 ppa Arg Lis Ala Met Iso Asp Glu Cis Val
Tabla 1. Disposición de aminoácidos en placas para cromatografía en capa fina.

S1* Mezcla de Butanol – Ac. Acético – Agua (8:2:2)

S1* Mezcla de Butanol – Ac. Acetico – Agua (60:20:20)
S3* Mezcla de Butanol – Ac. Acetico – Agua (10:5:2)
S4* Mezcla de Etanol –NH3 34% (7:3)

1
ppa (placa pequeña artesanal)
De igual manera, para identificar los carbohidratos presentes en la muestra de orina, se dispuso de placas pequeña
artesanales tratadas con silica y yeso sobre las cuales se aplicaron los carbohidratos, solvente y muestra. La tabla 2 resume
dicho procedimiento.

NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 4

Ninna S5* Ppa Maltosa Sacarosa
Alejandra S5 Ppa Sacarosa Manosa
Mauricio S5 Ppa Maltosa Glucosa
Yara S5 Ppa Glucosa Ribosa
Tabla 2. Disposición de carbohidratos en placas para cromatografía en capa fina.

S5* Mezcla de Butanol – Ac. Acético- Éter etílico – Agua (9:6:3:1)

En la tabla 3 se sintetiza la distribución de las placas grandes para la corrida 1 (corrida bidimensional) y la corrida 2 (corrida
única).

Tipo
de NOMBRE SOLVENTE PLACA PRUEBA 5
corrida
2
1 Ninna S1 PGA Cis Gly Ser Met Fen
3
Mauricio PGC Lis ILe Glu Val His
2 Alejandra S5* PGA Maltosa Sacarosa Maltosa Ribosa Glucosa Arabinosa
Yara PGC Maltosa Sacarosa Maltosa Ribosa Glucosa Arabinosa
Tabla 3. Cromatografía de aminoácidos y carbohidratos en placa grande.

Luego se procedió a la preparación de los solventes tanto para cámaras pequeñas como para las grandes.

2
Placa grande artesanal
3
Placa grande comercial
 Foto 2. Cámaras de cromatografía con su respectivo solvente.

Acto seguido, se realizó el montaje de las placas y luego se incubaron, (pequeñas artesanales y grandes comerciales y
artesanales) en cámaras saturadas con el solventes. (Foto 3 y 4)
 Foto 3. Placas pequeñas artesanales en Foto 4. Placas grandes artesanales y comerciales en corrida.
corrida.

Terminado el tiempo de corrida se extrajeron las placas de las cámaras. (Ver foto 5). Se secaron, se rociaron con ninihidrina
(aminoácidos) y orcinol (carbohidratos) para lograr revelar la corrida.
 Foto 5. Placas pequeñas artesanales después de la corrida (proceso de secado)

En las reacciones que aparecen a continuación (Figura 2 y 3), se evidencian las funciones de la ninihidrina y el orcinol en el
revelado de la cromatografía de aminoácidos y carbohidratos respectivamente.

Figura 2. Reacción de aminoácidos con ninihidrina.

 Figura 3. Reacción de carbohidratos con orcinol.

La formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es
indicativo de que no está presente. Aunque en la presente práctica se llevo a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos
(ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación
cuantitativa de dichas biomoléculas.

Objetivo 3. Identificar los aminoácidos presentes en fluidos biológicos (orina)

Para identificar los aminoácidos presentes en la muestra de orina se calentaron las placas sobre una plancha de calentamiento
como se muestra en la foto 6. Al calentar el complejo nihinidrina-aminoacidos se evidencia la presencia patrones de
aminoacidos y en la muestra por la formación de color sobre la placa (morado) a diferentes distancias de acuerdo al
aminoácido. (Ver fotos 7, 8, 9 y 10).
 Foto 6.

Muestra Patron
a

Foto 7. Foto 8.
Placa B. Treonina- Valina - Muestra Placa 1. Arginina y Muestra problema (arginina presente)
Placa C. Triptófano – Muestra problema Placa 2. Alanina – Metionina - Muestra
 Foto 9. Foto 10.
Placa Grande Comercial aminoácidos Placa Grande Comercial aminoácidos
Placa Grande Artesanal aminoácidos

Foto 11. Foto 12.

Placa Grande Comercial Carbohidratos Placa Grande Artesanal de Carbohidratos

Objetivo 4. Comprobar, empleando los valores de referencia, la posible presencia de los aminoácidos separados.
Se observa una banda de arginina en la muestra, ubicada a la misma altura del patrón. (Ver foto 8).

Al analizar la cromatografía en las placas grandes comerciales y artesanales se evidenció la calidad cromatográfica en las
primeras (fotos 9,placa izquierda), se expresaron los aminoácidos elegidos según la tabla 2 tanto en los patrones como en la
muestra de orina falseada para la cromatografía.

A nivel de carbohidratos se observa una banda de glucosa en la muestra, pues está ubicada a la misma altura del patrón de
ésta. (Ver foto 13).

Muestra
Patron

Foto 13 Placa Grande Comercial

BIBLIOGRAFIA

Jorrín J., Nieves M., Bárcena J. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción
con ninhidrina. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo
Ochoa, 14071-Córdoba