AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

A PARTIR DE UN FRUTO CITRICO

OBJETIVO.-

Aislar el Aspergillus Níger a partir de un fruto cítrico y seleccionar por la cantidad de ácido
cítrico, los niveles de esporas, temperatura y el pH que se modifican a lo largo de varias horas
o días a medida que aumenta la producción de ácido cítrico.

Determinar el ácido cítrico que forma a partir de la formación de zonas amarillas

Obtener resultados que se verifiquen con la bibliografía de esta cepa en cuanto a sus
características microscópicas como ser los cambios de color cuando estas se forman, de
apariencia filamentosa y textura suave.

Describir los procedimientos para la identificación de las cepas de Aspergillus Níger

Conocer y verificar la forma del Aspergillus Níger mediante la tinción y posterior observación
en el microscopio.

JUSTIFICACION.-

La obtención del ácido cítrico a partir de la fermentación representa una de las industrias más
grandes dentro del ámbito biotecnológico. Esto se debe a la importancia que tiene el ácido cítrico
dentro de la industria alimentaria y farmacéutica, ya que es un ácido con una alta solubilidad, sabor
agradable, de muy baja toxicidad.

En la producción de ácido cítrico con Aspergillus Níger, los niveles de nutrientes y las condiciones
ambientales, como pH, agitación, temperatura, iones metálicos, concentración de fosfato, fuente de
nitrógeno, carbono, alcoholes y aditivos son muy importantes que regulan la morfología del
microorganismo.

En el presente proyecto se pretende aislar e identificar las cepas de Aspergillus Níger productoras
de ácido cítrico, para su posterior selección y realización.

FUNDAMENTO TEORICO

El género del aspergillus comprende alrededor de 180 especies, son hongos filamentosos, hiliados y
ubicuos.

Se reproducen asexualmente por conilios que se originan de grupos de filiados localizadas en un

ensanchamiento terminal del conidióforo
El aspergillus Níger es un hongo que produce un moho negro en vegetales muy común en la
lechuga, el tomate, acelga y limón. Es una de las especies más corriente del aspergillus.

PATOLOGIAS PRODUCIDAS:

Aspergillus Níger no causa tantas enfermedades como las otras especies del aspergillus, pero en
altas concentraciones puede producir aspergilosis, que provoca alteraciones pulmonares.

DIAGRAMA DE FLUJO:

AISLAMIENTO:

CONSERVAR EN LA
OSCURIDAD POR 2 a 3 DIAS
INICIO
LIMON PICADO
(HONGO VISIBLE)
TOMAR CON EL ASA DE Contiene ácido cítrico,
PLATINO AL HONGO calcio, magnesio, pectina y
vitamina C

SEMBRAR MEDIO SOLIDO

(EN CAJAS PETRI) EXTRACTO DE MALTA

TEMPERATURA DE
22-25 ⁰C INCUBAR
TIEMPO DE 4-5 DIAS

FORMACION
SI
DE ESPORAS
OSCURAS

PREPARAR EL FROTIS (2
GOTAS DE AZUL DE
REALIZAR LA TINCION LACTOFENOL) Y
OBSERVAR EN EL
MICROSCOPIO
PREPARAR (AGAR PAPA
DEXTROSA) EN TUBOS TRANSFERIRI LAS COLONIAS
(INCLINADOS JÓVENES COMPARAR
(BIBLIOGRAFIA)
TEMPERATURA DE 22-25 ⁰C
TIEMPO DE 4-5 DIAS INCUBAR
 SI
ESPORULACION
ABUNDANTE

CONSERVAR LOS
TUBOS 4⁰C

FIN

SELECCIÓN DE CEPAS:

INICIO

TRANSFEREIR (0.5 ml) DE LA PLACAS CON MEDIO

SUSPENSIÓN DE ESPORAS DE LOS CZAPEK-DOX
TUBOS

TEMPERATURA DE
INCUBAR 22-25 ⁰C
TIEMPO DE 4-5 DIAS

FORMACION DE
SI
ZONAS AMARILLAS

FORMACION DE
FORMACION DE
ZONAS AMARILLAS
ACIDO CITRICO (ACIDO CITRICO)

SELECCIONAR COLONIAS
 SEMBRAR EN TUBOS (AGAR PAPA DEXTROSA)
(INCLINADOS)

TEMPERATURA DE 22-25 ⁰C
INCUBAR TIEMPO DE 4-5 DIAS

SI
ESPORULACION
ABUNDANTE

CONSERVAR LOS
TUBOS 4⁰C

FIN

MATERIALES:  1 Balanza digital

 1 Hornilla eléctrica
 5 Matraz Erlenmeyer de 500 ml (con
REACTIVOS:
tapa)
 2 Probeta de 100 ml  Extracto de malta (1)
 Algodón
 Azul de lacto fenol (2)
 Tijeras
 Papel aluminio  Medio czapex-dox (3)
 Autoclave  Agar
 5 Cajas Petri  Ácido clorhídrico
 2 Asa de platino  Hidróxido de sodio
 5 Pipetas de 1 ml  Agar papa dextrosa
 15 Tubos de ensayo con tapa rosca  Sacarosa
 3 Vasos de precipitado 100 ml
 Nitrito de sodio
 3 Matraz aforado de 100 ml
 1 Piceta plástica  Fosfato acido de potasio
 1 Espátula  Sulfato de magnesio heptahidratado
 1 Cepillo  Cloruro de potasio
 1 Gradilla  Sulfato de hierro
 4 Mecheros  Verde de bromocresol
METODOLOGÍA:
 (1) Preparación del medio solido de extracto de malta (EM):

Disolver 2g de extracto de malta en 85 ml de agua destilada, ajustar el pH a 4.8 con una

solución de HCl 0.1 N o de NaOH 0.1 N, agregar 2 g de agar y completar el volumen a 100
ml con agua destilada, calentar el medio para fundir el agar, agitar suavemente. Esterilizar
15 min 121 ºC y vaciar a las cajas petri.

(2) Preparación del medio AGAR PAPA DEXTROSA (PDA):

Seguir el procedimiento del envase, esterilizar 15 min a 121 ºC y colocarlos en los tubos.

(3) Preparación del medio CZAPEK-DOX

Disolver en 80 ml de agua destilada:

 Sacarosa 3g
 Nitrito de sodio 0.2g
 Fosfato acido de potasio 0.1g
 Sulfato de magnesio heptahidratado 0.05g
 Cloruro de potasio 0.05g
 Sulfato de hierro 0.001g
 4ml de bromocresol 1%

Ajustar el pH a 6, adicionar el agar (2 g) y ajustar al volumen de 100 ml con agua, calentar

y esterilizar 15 min a 121 ºC.

(4) Preparación del azul de lacto fenol:

En 20 ml de agua destilada colocar:

 cristales de fenol 20 g
 de ácido láctico 20 ml
 de glicerina 20 ml
 Azul de algodón 0.05g

Calentar a 70ºC.

Tinción con azul de lacto fenol(prueba confirmatoria)

Colocar el material a observar en el portaobjetos y añadir entre 1 a 2 gotas de azul de

lacto fenol y después de 2 min observar en el microscopio.

¿Cómo identificar al Aspergillus Níger?

El Aspergillus Níger se encuentra en el grupo de los aspergillus negros, el cual se clasifica
dentro de la familia moniliaceae, orden moniliales, clase hyphomicetes, filum
deuteromycota.

Es importante conocer las características del grupo de Aspergillus niger para su

identificación, las cuales son: cabezas conidiales de tonos negro a negro grisáceo, negro
café, negro púrpura o negro carbón, son globosas, radiadas o divididas formando
columnas de cadenas de conidios irregulares o bien definidos. Los conidióforos son de
color hialino a café, típicamente lisos o en pocas especies ligeramente granulares, de
paredes robustas, quebradizas, dividiéndose longitudinalmente al ser trituradas. Vesículas
globosas o casi globosas, hialinas o de color café claro a oscuro. Esterigmata en una o dos
series dependiendo de las especies, con frecuencia profundamente coloreadas. Los
conidios son globosos o subglobosos, elípticos o achatados horizontalmente, lisos o casi
lisos, espinosos, o con estriaciones longitudinales marcadas. Esclerotia globosa o
subglobosa, de coloración crema cuando es joven, tornándose rosada, gris o café.

IMÁGENES CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION

MORFOLOGÍA DEL ASPERGILLUS NÍGER

 Las especies del genero Aspergillus se desarrollan con formas micelinas hialinas en
cultivo
 En el examen macroscópico las colonias puede ser negras, verdes, amarillas,
blancas o de otro color en función de la especie y condiciones de crecimiento
 Se puede observar la presencia de hifas dentro de los vasos sanguíneos
(angioinvasion) lo que provoca trombosis.
 Las cabezas rara vez se encuentran en tejidos pero pueden desarrollarse en el
interior de cavidades
 Las hifas de las demás especies patógenas de Aspergillus no se
diferencian a nivel morfológico
 Los Aspergillus forman hifas tabicadas ramificadas que
producen cabezas conidiales cuando se exponen al aire
 Cada cabeza conidial se compone de un conidióforo con una
vesícula terminal la cual porta capas de fialides
 Las fialides alargadas generan columnas de conidias esféricas
que constituyen los propagulos infecciosos a partir de la cual
se desarrollla la fase micelial del hongo
 En parte de identificación de especies depende de las diferencias en sus cabezas
conidiales asi como la morfología y disposición de las conidias
 En el tejido las hifas se tiñen débilmente con tinción de H-E pero se visualizan bien
con tinciones micoticas de PAS, GMS y Gridley
 Las hifas son uniformes y muestran:
Una anchura uniforme de 3-6 um
Contornos paralelos
Tabiques regulares
 Y un patrón progresivo de ramificación arboriforme. Las ramas son dicotómicas y
suelen surgir a angulos agudos -45°

CRONOGRAMA:

Considerando como el DÍA 0 al inicio de la práctica.

DIA 1: AISLAMIENTO:

Extraer el hongo de la fruta y conservarlo en un lugar oscuro por 3 días.

DIA 4:

Sembrar en las Cajas Petri (medio solido extracto de malta), incubar temperatura de 30 ⁰c
por tiempo de 4-5 días.

DIA 7-8:
Realizar la tinción, Colocar el material a observar en el portaobjetos y añadir entre 1 a 2
gotas de azul de lacto fenol y después de 2 min observar en el microscopio y comparar la
forma con las imágenes de referencia y sacar conclusiones.

Preparar (agar papa dextrosa) en tubos inclinados, transferir las colonias jóvenes (coloración
crema cuando es joven) y sembrar e incubar a una temperatura de 30 ⁰C un tiempo de 4-5
días.

DIA 11-12: SELECCIÓN DE CEPAS:

Conservar los tubos a 4 ⁰C.

Transferir (0.5 ml) de la suspensión de esporas de los tubos en un medio placas con medio
Czapek-dox, incubar a una temperatura de 30 ⁰C un tiempo de 4-5 días.
DIA 15-16:

Observar la formación de zonas amarillas (ácido cítrico).

Seleccionar colonias, sembrar en (agar papa dextrosa) en tubos inclinados, incubar a una
temperatura de 30 ⁰C un tiempo de 4-5 días.

DIA 18-19:

Conservar los tubos a 4 ⁰C.

BIBLIOGRAFIA.

PRACTICAS-BIOTECNOLOGIA- UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA

MANUAL DE PRACTICAS MICROBIOLOGIA GENERAL- UNAM

AISLAMIENTO DE CEPAS-LABORATORIO DE ALTA TECNOLOGIA DE XALAPA-INSTITUTO DE

CIENCIAS BASICAS-UNIVERSIDAD VERACRUZANA

CARACTERIZACION DE UNA ZEPA DE ASPERGILLUS NÍGER- REVISTA Universidad EAFIT