INFORMACIÓN SOBRE LA BASE MECANÍSTICA DE LA RESISTENCIA A

COLISTINA MEDIADA POR PLÁSMIDOS A PARTIR DE ESTRUCTURAS DE

CRISTAL DEL DOMINIO CATALÍTICO DE MCR-1

La polimixina colistina es un antibiótico de "última línea" contra bacterias Gram negativas

extensamente resistentes. Recientemente, el gen mcr-1 se identificó como un mecanismo de
resistencia mediado por plásmidos en Enterobacteriaceae humanos y animales, con una
amplia distribución geográfica y muchas cepas productoras resistentes a otros antibióticos
múltiples. mcr-1 codifica una enzima unida a la membrana que cataliza la transferencia de
fosfoetanolamina al lípido bacteriano A. Aquí presentamos estructuras cristalinas que revelan
que el dominio catalítico perlasmático MCR-1 es una metaloproteína de zinc con un
plegamiento de fosfatasa / sulfatasa alcalina que contiene tres enlaces disulfuro. Una
estructura captura una forma fosforilada que representa el primer intermedio en la reacción de
transferencia. La mutación de residuos implicados en la unión de zinc o fosfoetanolamina, o
actividad catalítica, restaura la susceptibilidad a la colistina de E. coli recombinante. La
privación de zinc reduce las CIM de colistina en E. coli de laboratorio, ambiente, animal y
humano productoras de MCR-1. Por el contrario, la sobreexpresión de la disulfuro isomerasa
DsbA aumenta la colistina MIC del laboratorio de E. coli. Los cálculos preliminares de la teoría
funcional de la densidad en los modelos de clúster sugieren que un solo ion de zinc puede ser
suficiente para respaldar la transferencia de fosfoetanolamina. Estos datos demuestran la
importancia de los enlaces de zinc y disulfuro para la actividad de MCR-1, sugieren que los
ensayos bajo condiciones limitantes de zinc representan una ruta para la identificación
fenotípica de E. coli productora de MCR-1 e identifican características clave del probable
mecanismo catalítico.

La resistencia a los antibióticos, particularmente en bacterias Gram-negativas (GNB) es una

amenaza global seria y creciente. Los GNB constituyen una proporción creciente de
infecciones nosocomiales, que contribuyen a un aumento de la morbilidad y la mortalidad en
grupos de pacientes vulnerables, como pacientes de cirugía, trasplante y quimioterapia1. Las
enterobacteriáceas como Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae son patógenos versátiles
que causan sepsis, heridas, sitios quirúrgicos, infecciones respiratorias, del tracto urinario e
infecciones asociadas al dispositivo2,3. El tratamiento de las infecciones por GNB se complica
por su resistencia intrínseca a muchas clases de antibióticos y la fácil adquisición de
resistencia a agentes adicionales4. La diseminación generalizada de plásmidos que contienen
múltiples determinantes de resistencia ha erosionado las opciones de tratamiento dejando
pocos antibióticos confiables para la terapia empírica, una situación agravada por la continua
escasez de nuevos antibacterianos efectivos contra GNB5. La polimixina colistina es una
terapéutica clave para las infecciones por GNB, ya que la propagación de la resistencia a los
antibióticos en los dispositivos móviles aumenta el fracaso del tratamiento para las
cefalosporinas o carbapenémicos de tercera generación6. Hasta hace poco, la resistencia a la
colistina en Enterobacteriaceae se consideraba poco común, y se originaba principalmente de
mutaciones cromosómicas en K. pneumoniae cepas7. Sin embargo, recientemente se
identificó un determinante de resistencia a colistina codificado por plásmido, MCR-1, en una
cepa de E. coli asociada a un animal, y posteriormente se encontró en plásmidos
multirresistentes de carne animal, E. coli humana y K. pneumoniae8. La diseminación de
MCR-1, que ya es global9, ahora amenaza la efectividad continua de la colistina contra las
infecciones por GNB. En particular, los plásmidos portadores de GNB que expresan
conjuntamente MCR-1 y carbapenemasas junto con otros determinantes de resistencia
pueden ser efectivamente intratables con los antibióticos convencionales10,11. MCR-1
confiere resistencia modificando el objetivo colistina, catalizando la transferencia de
fosfoetanolamina (PEA) sobre el sacárido glucosamina del lípido A en la membrana externa
bacteriana (Fig. 1) 8. Esto reduce la carga negativa neta del grupo de cabeza de lípido A y, en
consecuencia, la unión de colistina12. El mecanismo catalítico de MCR-1 (y otras PEA-
transferasas bacterianas) aún no se ha establecido. Aquí presentamos dos estructuras
cristalinas del dominio catalítico soluble de MCR-1, que revela que se trata de una
metaloproteína de zinc que contiene tres enlaces disulfuro intramoleculares. Los ensayos de
susceptibilidad a colistina respaldan la importancia propuesta de la formación de enlaces
disulfuro y zinc para la actividad de MCR-1, mientras que los modelos de teoría funcional
funcional de estados clave en la vía de reacción propuesta indican que las formas mono y di
zinc de la enzima pueden soporte de transferencia PEA.

Figura 1. Reacción de transferencia de fosfoetanolamina catalizada por MCR-1. El panel muestra una
estructura de lípido A de E. coli hexaacilada51 con grupos fosfato 1 'y 4'. MCR-1 cataliza la
transferencia de fosfoetanolamina desde un sustrato donador de fosfatidiletanolamina al lípido A. La
figura muestra la adición de fosfoetanolamina a la posición 1 'del lípido A, consistente con la actividad
propuesta de Salmonella PmrC14.

Resultados
Estructura cristalina del dominio catalítico MCR-1. Bacterial lipooligosaccharide PEA-transferasas tales
como MCR-1 se organizan en dos dominios: un dominio N-terminal de la membrana interna unida que
se predice que contiene 5 hélices α transmembrana y un dominio periplásmico soluble que contiene el
supuesto centro catalítico8,13-15. Por lo tanto, como un primer paso para comprender el mecanismo
molecular de la resistencia a la colistina mediada por MCR-1, buscamos obtener información
estructural de alta resolución para el dominio catalítico de MCR-1. Para facilitar tales estudios,
diseñamos MCR-1 para que carezca de las cinco hélices transmembrana, generando una construcción
que contiene los residuos 219-541 (MCR1ΔTM) que se purificó y cristalizó. Las fases calculadas a partir
de conjuntos de datos recogidos en o cerca del borde de absorción de rayos X de cinc finalmente
produjeron estructuras para dos formas cristalinas diferentes en los grupos espaciales P41212
(resolución 1,75Å) y P21 (resolución 1,55Å) (Tabla S1 complementaria). Las dos estructuras son
esencialmente idénticas (RMSD 0.37Å más de 311 átomos Cα, Figura complementario S1) y revelan un
pliegue global α-β-α, que contiene tres enlaces disulfuro intramoleculares, típico de enzimas fosfatasa
o sulfatasa alcalinas, con el N-terminal que indica la posición probable de las cinco hélices
transmembrana (Fig. 2A, B). Ambos grupos espaciales contienen una forma dimérica idéntica, a través
de interacciones entre monómeros en la unidad asimétrica (P21) o moléculas relacionadas con la
simetría (P41212) (Figura S2 complementaria). Sin embargo, los experimentos de cromatografía de
exclusión por tamaño muestran que MCR1ΔTM es monomérico en solución (Figura Suplementaria S2),
lo que nos lleva a concluir que esta forma dimérica es poco probable que sea fisiológicamente
relevante. Ambas estructuras contienen densidad de electrones clara para iones metálicos unidos en el
sitio activo putativo, asignados como zinc sobre la base de la presencia de exceso de zinc en los
amortiguadores de purificación y una señal fuerte en el borde de absorción de zinc en las
exploraciones de fluorescencia de rayos X. de cristales de MCR-1 (Figura Suplementaria S3). La
consistencia con estructuras optimizadas para DFT (ver a continuación) también respalda su
identificación como iones de zinc. Sin embargo, los dos cristales las formas difieren en el contenido de
zinc, con la estructura P21 que contiene un ion de zinc (Zn1), coordinado por Asp465, His466, Glu246 y
Thr285 en una geometría tetraédrica (Fig. 2C, Tabla Suplementaria S2), mientras que la estructura
P41212 contiene densidad para un , también tetraédrico, sitio de zinc (Zn2) coordinado por His395,
His478, una molécula de agua (Wat1) y Glu300 de una molécula relacionada con la simetría (Fig. 2D,
Tabla Suplementaria S2). Además, el sitio activo de la estructura P21 contiene densidad electrónica
que corresponde a la presencia de un grupo fosfato unido a Thr285, el residuo conservado que se cree
que actúa como aceptor para el grupo PEA durante la reacción de transferencia13,15. Esta
autofosforilación aparente fue confirmada por espectrometría de masas de muestras de cristalización
MCR1ΔTM, que mostró una población mixta de proteínas con una diferencia de masa (78 Da)
consistente con la presencia de formas fosforiladas y no fosforiladas (Figura Suplementaria S4). El sitio
activo de MCR-1 ocupa una depresión superficial en una cara relativamente plana de la molécula,
permitiendo potencialmente la unión del grupo de cabeza de lípido A relativamente grande en más de
una orientación y permitiendo la modificación en más de una posición16. Los diagramas de
hidrofobicidad superficial y distribuciones de carga (Figura Suplementaria S5) muestran que esta
región es tanto más hidrofóbica como menos cargada que el resto de la proteína, consistente con una
ubicación adyacente a la superficie de la membrana desde la cual se espera que sobresalgan los
sustratos. Además de Thr285 y los residuos que componen el sitio Zn1, la región del sitio activo
contiene un número de residuos conservados entre las transferasas PEA bacterianas8. En particular,
además de sus posibles papeles como ligandos de Zn2 (estructura P41212), en la estructura P21, tanto
His395 como His478 están bien posicionados para interactuar con Thr285 fosforilado, mientras que la
proximidad de Lys333 a Thr285 sugiere un posible papel de este residuo en el sustrato. (PEA)
vinculante. También notamos la presencia de un fuerte enlace de hidrógeno entre ND1 de His478 y
OE1 del Glu468 conservado, una interacción que podría orientar o polarizar plausiblemente esta
histidina como parte de un rol mecanicista.

Figura 2. Estructura del dominio periplásmico MCR-1. (A) La organización de MCR-1 que muestra 5
hélices α que abarcan la membrana predichas y el dominio periplásmico soluble (residuos 219-541)
cristalizó aquí. (B) Pliegue global del dominio catalítico de MCR-1. Los enlaces disulfuro
intramoleculares están etiquetados y el centro del metal (sitio activo) está enmarcado. (C) El sitio
activo de la forma cristalina P21 que muestra un solo ion de cinc unido (esfera gris) y la fosforilación de
Thr285. (D) Sitio activo de la forma de cristal P41212 que muestra el centro de zinc dinuclear y la
coordinación de Zn2 por el residuo Glu300 (rosa) de una molécula adyacente en la red cristalina.

Requisitos para la actividad de MCR-1. Los resultados cristalográficos indican que MCR-1 es una
metaloproteína de zinc que contiene al menos un ion de zinc, con un residuo Thr conservado (Thr285)
capaz de autofosforilarse en E. coli recombinante y una red de enlaces disulfuro intramoleculares. Por
lo tanto, buscamos probar la hipótesis de que el zinc es importante para la actividad de MCR-1 en el
huésped bacteriano, que los aminoácidos conservados participan en la unión zinc / sustrato o en la
reacción de transferencia de fosfo (etanolamina) y que la formación del enlace disulfuro en el el
periplasma es importante para la actividad de MCR-1. Evaluamos los efectos de la privación de zinc, la
modificación de aminoácidos específicos (Fig. 3A) o la formación mejorada de enlaces disulfuro, sobre
la actividad de MCR-1 in situ medida por concentraciones mínimas inhibitorias de colistina (MIC) para
bacterias positivas para mcr-1. La eliminación de zinc mediante la inclusión del quelador EDTA en
experimentos de MIC redujo las CMI de colistina de E. coli de laboratorio que expresan MCR-1
recombinante de longitud completa desde 2 μg / ml hasta los controles de vector solamente (0,25 μg /
ml). También se observaron reducciones profundas en la colistina MIC (hasta 5 diluciones) en la
exposición al EDTA cuando estos experimentos se extendieron a un panel de 68 cepas de E. coli de
origen ambiental, animal y humano (Fig. 3B, Figura Suplementaria S6, Tabla Suplementaria S3 )
apoyando un requerimiento de zinc (o posiblemente otros cationes divalentes) en la función MCR-1. Es
importante destacar que el tratamiento con EDTA tuvo poco efecto sobre el crecimiento o la
susceptibilidad a colistina de un panel (12 cepas incluyendo una cepa de tipo) de E. coli mcr-1 negativo
recolectado durante las mismas operaciones de muestreo. En ausencia de EDTA, estas muestras de
control negativo variaron en su susceptibilidad a la colistina (CIM ≤ 0,25 a 1 μg / ml) hasta niveles en
los que las reducciones significativas en la CIM son fácilmente mensurables. Sin embargo, para estas
cepas los aumentos en la susceptibilidad a colistina en el tratamiento con EDTA fueron como máximo
una dilución, lo que indica que EDTA no afecta la permeabilidad de la membrana a colistina y que las
reducciones de MIC en cepas MCR-1 positivas se deben más bien a una pérdida de MCR-1 actividad.

Figura 3. Efecto de la mutación y la privación de zinc sobre la actividad de MCR-1. (A) Sitio activo de
MCR-1 (forma de cristal P21) con colores que identifican las posiciones de las sustituciones de alanina.
(B) Efecto de la privación de zinc sobre concentraciones mínimas inhibitorias de colistina (MIC) para
MCR-1-negativo (12 aislamientos, azul) y MCR-1-expresando (68 aislamientos, rojo) E. coli. Las CIM se
determinaron mediante microdilución en caldo en presencia y ausencia de EDTA (250 μg / ml) como se
describe. (C) Las CIM de colistina (determinadas por dilución de agar, los datos mostrados son modos
para dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado) para las sustituciones de
alanina en las posiciones que se muestran en (A).

Estos resultados implican que los cationes divalentes, específicamente el zinc, son
importantes para la actividad de MCR-1. Esta conclusión se confirma con la observación de
que la sustitución del ligando de zinc Glu246 por alanina reduce la CIM de colistina de E. coli
recombinante a la del control de solo vector (Fig. 3C, Tabla Suplementaria S4), un efecto
equivalente a la sustitución del aceptor treonina (Thr285). Sin embargo, los efectos de las
mutaciones en otros residuos del sitio activo son más variables. Mientras que el reemplazo
del His395 conservado, parte del sitio Zn2 (estructura P41212), reduce la CIM de colistina a
niveles basales, las sustituciones del His478 adyacente, o su compañero de enlace de
hidrógeno Glu468, proporcionan reducciones más pequeñas (3 a 4 diluciones). Del mismo
modo, la mutación de alanina de Lys333 reduce sustancialmente la colistina MIC, pero no a
niveles basales. Por lo tanto, en posiciones distintas de His395, los mutantes de alanina que
se alejan del sitio Zn1 retienen cierta capacidad para proteger las cepas que expresan la
acción de la colistina. Por lo tanto, si bien es importante, estos residuos no son absolutamente
esenciales para la función de MCR-1. Por el contrario, se ha demostrado que la formación
mejorada de enlaces disulfuro a través de la sobreexpresión de la ditiol disulfuro-
oxidorreductasa periplásmica DsbA aumenta la expresión y la actividad de N. meningitidis
LptA en E. coli17 recombinante. Por lo tanto, probamos si la coexpresión de DsbA también
podría aumentar la actividad de MCR-1, y estableció que esto condujo a un aumento modesto
pero reproducible en la colistina MIC para E. coli TOP10 que expresa MCR1 (de 4 a 8 μg /
ml). Tomados en conjunto, estos datos indican que el zinc, los residuos del sitio activo
conservados y la formación de enlaces disulfuro son todos importantes para la estructura y
actividad de MCR-1.

Figura 4. Teoría funcional de la densidad (DFT) Modelado del sitio activo MCR-1 (forma mono-zinc). (A)
Posible mecanismo para la adición de fosfoetanolamina (2) a MCR-1 Thr285 de MCR-1 mono-zinc (1)
para formar el aducto Thr285 (3). (B) Estructura cristalina del sitio activo MCR-1 (forma P21) que
muestra los residuos utilizados en el modelo de agrupamiento. (C) Geometría optimizadas de DFT de
fosfoetanolamina unida no covalentemente al sitio activo de MCR-1 (2 en el panel (A) anterior. (D)
Geometría optimizada por DFT del sitio activo de MCR-1 en la forma unida a fosfoetanolamina (3 en el
panel (A) anterior). (Consulte la Información complementaria para obtener detalles completos de
cómputo y una discusión de los resultados).

Teoría funcional de la densidad Modelos de transferencia de PEA catalizada por MCR-1. Propuestas
mecanicistas para la transferencia de fosforilo por ej. la fosfatasa alcalina típicamente involucra dos18
o tres19 iones metálicos. Mientras que nuestras estructuras identifican inequívocamente un sitio de
zinc (Zn1) en MCR-1 adyacente al Thr285 esencial, el sitio de Zn2 en la forma cristalina P41212 implica
contactos cristalográficos y puede no ser relevante en la solución. Esta posibilidad se ve respaldada por
otra estructura cristalina recientemente liberada del dominio catalítico MCR-1 con fosfo-Thr285 (PDB
5K4P20) que se cristalizó a partir de condiciones de alta concentración de zinc que contiene iones de
zinc en el sitio Zn1 y en varias posiciones adicionales, de los cuales ninguno es directamente
equivalente al sitio de Zn2 identificado aquí. En consecuencia, para examinar la probable
estequiometría de zinc requerida para la transferencia de PEA, y como un estudio preliminar del
mecanismo MCR-1, utilizamos la teoría funcional de densidad computacional (DFT) 21,22 para
investigar las formas mono y di zinc de MCR-1 , que corresponden a las estructuras cristalinas P21 y
P41212, respectivamente, con el objetivo de probar el grado en que cada una puede soportar la
reacción de transferencia de fosforilo (es decir, la adición de PEA a Thr285). Los cálculos DFT se
realizaron en modelos de clúster para el centro de metal MCR-1 derivado de las dos estructuras,
utilizando modelos simplificados, es decir, sustituyendo [P (O) O (OMe) 2] - en lugar de
fosfatidiletanolamina (sustrato 1) y [ P (O) (OMe) OO] 2- para los sustratos de lípido A (sustrato 2) (los
procedimientos se describen completamente en la Información complementaria).

Las estructuras de energía mínima podrían ubicarse para todos los intermedios a lo largo de supuestas
vías mecanísticas que requieren ya sea uno (Fig. 4A) o dos (Figura Suplementaria S9A) iones de zinc.
Para el mecanismo mono-zinc, un modelo que contiene Glu246, Thr285, Asp465 e His466, con ambos
Glu246 y Asp465 desprotonado, proporcionó el mejor acuerdo con la estructura cristalina
experimental (Tabla Suplementaria S6). La geometría de coordinación observada sobre el centro de
zinc en este modelo se mantiene en todo el mecanismo postulado (Tabla Suplementaria S7), indicando
que esto es estructuralmente razonable. Tanto Glu246 como Asp465 son geométricamente accesibles
para actuar como bases generales para activar Thr285, y los intermedios generados por transferencia
de protones a Glu246 y Asp465 (1Zn-3E, 1Zn-D, Esquema S1, Información Complementaria) eran
isoenergéticos dentro de las limitaciones de la computación enfoque utilizado (Tabla Suplementaria
S8), lo que indica que cualquiera de los residuos puede activar Thr285. Similar al mecanismo de zinc
superior, las geometrías optimizadas en fase gaseosa para el centro metálico de zinc son razonables, y
consistentes con la estructura cristalina, alrededor de los dos iones de cinc a lo largo de la vía de
reacción postulada (Tabla S7 complementaria), confirmando que esto mecanismo putativo puede ser
acomodado por el sitio activo observado cristalográficamente. Sin embargo, a diferencia del caso del
mecanismo mono-zinc, la activación de Thr285 por transferencia de protones a Asp465 dio como
resultado un cambio estructural significativo en el sitio activo que implica la disociación de este
residuo del ion metálico Zn1. En contraste, se requirió un cambio estructural más pequeño para la
transferencia de protones a Glu246, y se pudo ubicar un estado de transición para la reacción de
Thr285 activado por Glu246 con el sustrato de diéster de fosfato 1. Las energías potenciales relativas
(Tabla S10 complementaria) calculadas para el di-zinc mecanismo fueron considerablemente más altos
que los obtenidos para la reacción de mono-zinc (Tabla S8A Suplementaria), aunque hubo una
sensibilidad considerable al modelo de solvatación y las restricciones utilizadas. Sin embargo, estos
cálculos iniciales indican que un mecanismo mono zinc para la transferencia de PEA puede ser factible
y demuestran que las estructuras presentadas aquí pueden servir como puntos de partida adecuados
para una exploración computacional más extensa del mecanismo MCR-1.

Discusión

La identificación inicial de mcr-1 en una cepa de E. coli de origen animal en China ha provocado
extensos análisis de colecciones de cepas bacterianas nuevas y existentes que han establecido que
este gen tiene una amplia distribución geográfica en E. coli humana, animal y ambiental9. Dado esto, y
la creciente importancia de la colistina como último recurso antibiótico para las infecciones por cepas
multiresistentes de GNB, hemos tratado de investigar las bases moleculares para la actividad de MCR-
1 como un primer paso hacia la comprensión de su posible impacto en todo el rango de GNB y
identificando posibles rutas para superar su actividad. Aunque la elucidación completa de los medios
por los cuales MCR-1 modifica los LPS bacterianos requiere una descripción estructural de la proteína
completa, incluyendo el dominio de membrana, las estructuras de alta resolución y los datos
microbiológicos y computacionales asociados que hemos podido obtener. información importante que
permite extraer algunas conclusiones sobre la base estructural de la actividad de MCR-1.
Consistente con las relaciones de secuencia previamente reconocidas8, las búsquedas basadas en
estructura23 identifican una clara similitud entre el pliegue global y la arquitectura del sitio activo
entre MCR-1 y otras PEA-transferasas bacterianas caracterizadas (Neisseria meningitidis LptA15
(dominio catalítico, PDB 4KAV, 40% de identidad de secuencia, RMSD) 1,9Å sobre 302 C \ alpha);
Campylobacter jejuni EptC13 (dominio catalítico, 4TN0, 41% de identidad de secuencia, RMSD 1,5 \
ring {A}, 284C \ alpha)). Esta relación se extiende además a otras supuestas PEA-transferasas
bacterianas, así como a sulfasas y fosfatasas (colina sulfatasa (PDB 4UG4, RMSD 2.9, 270Cα),
arilsulfatasa (3ED4, RMSD 3.2, 259Cα), N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa24 (4MIV, RMSD 3.0, 262Cα)
y fosfatasa alcalina (2x98, RMSD 3.0, 229Cα)). Por lo tanto, al igual que LptA y EptC, MCR-1 se puede
asignar como un miembro de la superfamilia de metaloenzima fosfatasa alcalina (AP). Además, tanto
las comparaciones con estructuras previas como nuestra observación de la fosforilación en una de
nuestras dos estructuras identifican claramente a Thr285 como el probable nucleófilo y aceptor de PEA
en el mecanismo catalítico. Las enzimas AP caracterizadas varían en la naturaleza y el número de iones
metálicos requeridos para la actividad y, en consecuencia, la arquitectura del sitio activo difiere
sustancialmente entre los de la estructura conocida25. Nuestras comparaciones estructurales
identifican los ligandos del sitio MCR-1 Zn1, Asp465, His466, Glu246 y Thr285, que se conservan bien
entre MCR-1, LptA y EptC y entre MCR-1 y otros miembros de la familia AP, aunque la identidad del
nucleophile difiere entre las enzimas.

Sin embargo, es evidente una conservación menos completa cuando se comparan los supuestos sitios
Zn2, mientras que los ligandos Zn2 His395 e His478 y el Glu468 adyacente también están bien
conservados entre MCR-1, LptA y EptC, estas posiciones varían en miembros de la familia menos
relacionados como como colina sulfatasa (Figura Suplementaria S7) que sugiere que un sitio Zn2
intacto no es un requisito previo para la actividad en todas las enzimas. También es notable que el sitio
Zn2 no está ocupado en la estructura de EptC, mientras que para LptA Zn2 se observó solo después de
la exposición a altas concentraciones de zinc15. De manera similar, una estructura recientemente
liberada del dominio catalítico MCR-1 (PDB 5K4P20, (Figura Suplementaria S8), cristalizada en
presencia de ZnSO4 0,2 M, contiene un total de 10 iones de zinc unidos a una molécula MCR-1,
incluyendo 4 en el bolsillo del sitio activo, y difiere de las estructuras presentadas aquí específicamente
en el sitio Zn2. Mientras que los pliegues globales de las estructuras P21 y P41212 son muy similares a
los de 5K4P (RMSDs 0.286 Å (324 Cα) y 0.432 Å (311 Cα ), solo el sitio Zn1 es similar en las tres
estructuras (Figura Suplementaria S8). En 5K4P los iones de zinc adicionales en el sitio Zn2 (ZnB, ZnC y
ZnD) están coordinados por His395 y el grupo fosfato de fosfo-Thr285 ( ZnB), por una red de moléculas
de agua (ZnC) e His478 y Glu405 de una molécula adyacente en la red cristalina (ZnD). En comparación
con la estructura P21 fosforilada (Figura S8 complementaria), la unión adicional de zinc causa la
rotación del fosforilo Thr285 grupo y pérdida de interacción de His478 con el fosforilo-oxígeno. Esto
también da como resultado un cambio en la posición de ZnD en comparación con Zn2 en nuestra
estructura MCR 1-P41212 (Figura Suplementaria S8). Estas comparaciones indican primero que las
conformaciones de residuos de sitios activos en MCR-1 son sensibles a condiciones de alto contenido
de zinc (como en 5K4P), exigiendo precaución al realizar cualquier interpretación mecanicista y, lo que
es más importante, los datos estructurales disponibles no definen claramente un sitio único de Zn2 en
MCR-1.
Tomados en conjunto, estos datos hacen incierto el papel de este ion metálico en la reacción de
transferencia de PTE. Sin embargo, el efecto de las sustituciones de alanina en His395 e His478 sobre
la susceptibilidad a la colistina de las cepas productoras indica que, independientemente de su papel
en la posible unión a metales, estos dos residuos son importantes para la estructura o actividad de
MCR-1. Se observaron efectos similares para las mutaciones equivalentes de EptC13. Esta conclusión
se ve reforzada por la observación de que la mutación de Glu468, un residuo posicionado para
interactuar con la cadena lateral de His478 y cuya función funcional hasta la fecha no se ha
investigado, también es perjudicial para la función de MCR-1. A pesar de los diferentes contenidos de
metal de las estructuras de MCR-1, la presencia de zinc en un sitio conservado adyacente a Thr285
fosforilado proporciona una fuerte evidencia de su importancia para la función de MCR-1. Esta
conclusión está respaldada por experimentos microbiológicos en los que se investigó el efecto del
quelador EDTA sobre la colistina MIC para una colección de cepas de E. coli. Estas incluyeron muestras
de pacientes humanos hospitalizados (China) y voluntarios humanos sanos (Tailandia); heces de pollos
(China, Tailandia) y otros animales de granja y domésticos (Tailandia); y el entorno más amplio
(principalmente fuentes de agua (embalses, ríos, canales, Tailandia, Tabla Suplementaria S3)). Para las
cepas MCR-1 positivas, se observaron reducciones claras en la CIM de colistina en el tratamiento con
EDTA, lo que apoya la conclusión de que se requiere zinc para la actividad de MCR-1 en el huésped. La
interpretación de estos experimentos podría complicarse por el efecto conocido de quelantes tales
como EDTA sobre la membrana externa Gram-negativa. El tratamiento con EDTA sensibiliza E. coli y
otros GNB a colistina, así como una variedad de antibióticos que no penetran en las células Gram-
negativas, muy probablemente debido al secuestro de iones de magnesio unidos que normalmente
mantienen LPS dentro de la membrana externa26. Si bien no podemos descartar por completo tales
efectos, los experimentos de control respaldan la afirmación de que las diferencias observadas en la
susceptibilidad a la colistina se relacionan con la pérdida de la actividad de MCR-1 en lugar de cambios
no específicos en la integridad de la membrana externa.

Específicamente para E. coli negativo para MCR-1 con concentraciones elevadas de colistina (0,5 o 1,0
μg / ml), el EDTA redujo estos valores como máximo en una dilución, en comparación con los cambios
de hasta cinco diluciones en aislados MCR-1 positivos, lo que sugiere que en estas cepas, los efectos no
específicos solos no pueden explicar las diferencias observadas. Estos resultados justifican una mayor
evaluación de este enfoque como una posible ruta para la detección fenotípica de la producción de
MCR-1 en E. coli. El mecanismo AP se ha estudiado ampliamente para varios miembros de la familia y,
antes de este estudio, las estructuras cristalinas estaban disponibles para dos PEA-transferasas
conocidas (LptA y EptC). Sin embargo, hasta la fecha, el mecanismo catalítico de estas enzimas, u otras
PEA-transferasas conocidas de esta familia, ha sido poco explorado. En consecuencia, como una
investigación inicial del mecanismo de transferencia de PEA, utilizamos DFT para construir una serie de
modelos que representan posibles estados a lo largo de la vía de transferencia de PEA catalizada por
MCR-1 en formas tanto de mono como de zinc. Curiosamente, aunque se podrían generar modelos
estructurales plausibles para los estados a lo largo de estas dos vías, las energías para las especies a lo
largo de la ruta del mono-zinc fueron consistentemente más bajas que las obtenidas para el
mecanismo de di-zinc. Mientras que las energías calculadas permanecieron sensibles a la configuración
del modelo (para detalles ver Información Complementaria), estos datos apoyan la hipótesis de que un
solo ion de zinc puede ser suficiente para soportar al menos la primera etapa de la reacción catalizada
por MCR-1, es decir, transferencia de PEA a Thr285 . Es importante destacar que las estructuras de
cristal que presentamos aquí facilitarán los estudios computacionales más extensos requeridos para
abordar esta y otras propuestas mecanísticas. En la reacción catalizada por AP, la función probable del
segundo ion zinc (Zn2) es orientar el sustrato entrante para que sea atacado por el nucleófilo (MCR-1
Thr285), estabilizando el estado de transición resultante y activando una molécula de agua entrante
que degrada el covalente intermedio27. Los miembros de la familia mono-zinc tales como fosfonato
monoester hidrolasa (PMH) pueden cumplir algunas de estas funciones mediante la sustitución de
residuos básicos por zinc en ausencia de un segundo sitio de metal28. Por lo tanto, es plausible que
MCR-1 y otras LPS PEA-transferasas funcionen con un solo equivalente de zinc.

Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad planteada anteriormente15 de que la unión al

sustrato, particularmente del aceptor de lípido A, proporcione la coordinación adicional necesaria para
unir un ion de zinc adicional y que se requiera un segundo metal para completar la reacción de
transferencia de PEA. En resumen, nuestros datos proporcionan estructuras de resolución casi
atómicas del dominio catalítico MCR-1 que definen la arquitectura de la proteína e identifican las
características clave de su actividad. El cinc, los enlaces disulfuro y los residuos del sitio activo
conservados, incluidos los ligandos de zinc, el aceptor Thr285 y las posiciones adicionales adyacentes
al centro metálico, son todos importantes para la función de MCR-1 en E. coli. En particular, la
investigación del efecto del EDTA sobre la susceptibilidad a la colistina en cepas productoras apoya
este enfoque como potencialmente adecuado para la discriminación fenotípica de E. coli productora
de MCR-1. Los cálculos de DFT indican que, a diferencia de la mayoría de las enzimas de tipo fosfatasa
alcalina (AP), MCR-1 puede requerir solo un único equivalente de zinc para catalizar la reacción de
transferencia de PEA. Estos datos identifican a MCR-1 (y otras PEA-transferasas bacterianas
relacionadas) como un subconjunto distinto dentro de la familia de enzimas AP y proporcionan puntos
de partida para investigaciones más extensas del mecanismo e inhibición de MCR-1, en particular para
el diseño basado en estructuras de inhibidores para uso en posibles terapias combinadas basadas en
colistina.

Métodos

Expresión del dominio catalítico MCR-1.

Para expresar el dominio soluble de MCR-1 que carece de las cinco hélices predichas transmembrana
(TM) 8 (MCR1ΔTM), se sintetizaron los codones 219-541 (Eurofins) y se subclonaron en el vector de
expresión pOPINF29 T7 con cebadores directo e inverso (MCR-1soluble F y MCR-1soluble R, Tabla
Suplementaria S5)). El plásmido resultante, pOPINF-MCR1ΔTM, codifica para la proteína etiquetada
His6 N-terminal escindible con 3C proteasa. Las células E. coli SoluBL21 (DE3) (Genlantis) que portan
pOPINF-MCR1ΔTM se cultivaron a 37ºC en medio 2xTY que contenía 50 μg ml-1 carbenicilina hasta
A600 0.6, cuando se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y crecimiento celular continuó
durante 18 horas a 18 ° C. Las células cosechadas por centrifugación (6500 × g, 10 min) se
resuspendieron en HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol 2 mM, ZnCl2 0,1 mM,
inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche), y se rompieron en dos 30 000 pasajes psi a través de un
disruptor celular. Todos los pasos posteriores se realizaron a 4 ° C. Las células intactas se eliminaron
mediante ultracentrifugación a 100.000 xg durante 1 hy el sobrenadante (más 10 mM de imidazol) se
incubó durante 2 h con resina de Ni-NTA (Qiagen). La resina unida a proteína se lavó en Tampón A
(HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 400 mM, ZnCl2 0,1 mM, TCEP 1 mM) más imidazol 10 mM, luego en
Tampón A más 20 mM de imidazol, y la proteína se eluyó en HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM,
ZnCl2 10 μM. , Imidazol 400 mM, TCEP 1 mM. El imidazol se redujo a 10 mM en un filtro centrífugo
Amicon de 10 kDa. La etiqueta se eliminó por escisión de proteasa 3C durante la noche y se capturó en
resina de Ni-NTA. La proteína se cargó posteriormente en una columna Superdex 75 equilibrada en
HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, ZnCl2 100 μM. Las fracciones máximas se concentraron a 16 mg /
ml.
Cristalización, Determinación de estructura y Análisis. El dominio soluble de MCR-1 se cristalizó por
difusión de vapor en gota de inmersión a 18 ° C en placas de cristalización MRC de 96 pocillos
(Molecular Dimensions). Cristales P41212 formados mezclando 400 nL de proteína con 200 nL de
reactivo de cristalización [0.1M MOPS / HEPES-Na pH 7.5, 10% p / v PEG 20000, 20% v / v PEG MME
550, 0.02M 1,6-hexanodiol, 0.02 M1-butanol, 1,2-propanodiol 0,02M, 2-propanol 0,02M, 1,4-
butanodiol 0,02M, 1,3-propanodiol 0,02M]. Cristales de P21 formados mezclando 300 nL de proteína
con 600 nL de reactivo de cristalización (0,2 M de cloruro de litio, 0,1 M de acetato de sodio pH 5,0,
20% p / v PEG6000). Las gotas se equilibraron frente a 50 μl de reactivo de cristalización. Los cristales
crecieron hasta su tamaño máximo en 14 días. Para la congelación, los cristales se transfirieron a
crioprotectores (solución de reservorio más 20% de glicerol) antes de la cosecha con un ciclo
criogénico y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los datos de difracción se recogieron a
100 K en las líneas de onda I03 (conjuntos de datos Zn-edge) y I04-1 o I02 (conjuntos de datos nativos)
en Diamond Light Source, Reino Unido. Una exploración de fluorescencia de rayos X alrededor del
borde Zn (9626 a 9685 eV) mostró claramente un pico correspondiente a la presencia de zinc en el
cristal. Por lo tanto, la estructura se determinó usando el método de Dispersión Anómala de Longitud
de Onda Única (SAD) combinando cuatro conjuntos de datos isomorfos de resolución 2,5Å recogidos
en el borde Zn (longitudes de onda en la Tabla S1). Los conjuntos de datos se indexaron e integraron
utilizando XDS30 y se combinaron y escalaron usando Aimless31 en CCP432. Las fases experimentales,
un mapa de densidad modificada y un modelo inicial se calcularon usando AutoSol33 en Phenix34, con
una molécula en la unidad asimétrica y dos sitios de zinc identificados. La cifra de méritos fue 0,31 y
0,66, antes y después de la modificación de la densidad. El modelo se construyó usando AutoBuild35
en Phenix.

Esta estructura inicial se usó luego como un modelo de búsqueda para el reemplazo molecular con
Phaser36 para sincronizar un conjunto de datos P41212 de 1,75 Å indexado mediante DIALS, tal como
se implementó en Xia237, y escalado y fusionado en Aimless. El conjunto de datos nativo P21 de
resolución de 1,55Å se procesó utilizando la interconexión Xia2 (indexado e integrado mediante XDS y
escalado utilizando Aimless). Las fases se calcularon mediante reemplazo molecular con Phaser,
usando la estructura P41212 como modelo inicial. Las estructuras se completaron en ambos casos
mediante rondas iterativas de construcción de modelos manuales en Coot38 y refinamiento en Phenix.
La validación de la estructura fue asistida por Molprobity39 y Phenix. Las coordenadas y los factores de
estructura se han depositado en Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb) con los números de acceso
5LRM y 5LRN.

Cromatografía de exclusión por tamaño analítico. La proteína purificada utilizada para los estudios
cristalográficos se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño. La proteína se cargó en una
columna Superdex 75 equilibrada en HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, ZnCl2 100 μM. El volumen
de elución se comparó con el volumen de elución de los estándares (GE Healthcare) para determinar el
peso molecular. El volumen vacío de la columna se determinó cargando azul dextran 2000.

Espectrometría de masas de MCR-1 recombinante purificado. Las mediciones de espectrometría de

masas se llevaron a cabo como se describió anteriormente40. Brevemente, se adquirió el espectro de
ionización por electrospray (ESI) en el modo de ion positivo usando un instrumento Waters LCT
Premier equipado con un analizador TOF. Se acopló un espectrómetro de masas LCT Premier (Waters)
a una HPLC Agilent serie 1100 utilizando una columna Chromolith® FastGradient RP-18 endcapped
equipada con una columna de HPLC 50-2, hecha de sílice monolítica (C18, 2 × 50 mm, macroporos con
1,6 μm). diámetro, Merck). El instrumento se conectó a un sistema de entrada de CTC-
automuestreador. Se ejecutó un gradiente de múltiples etapas durante 10 min (disolvente A 94,9%
H2O / 5% CH3CN / 0,1% ácido fórmico, disolvente B 99,9% CH3CN / 0,1% ácido fórmico, 0-1 min 5% B
para el equilibrio, seguido de un lineal gradiente a 100% B durante 4 min, luego 100% B durante 3min
adicionales, seguido de un gradiente lineal de más de 2min a 5% B para reequilibrar la columna) para
separar las muestras de proteína a caudales de 0.4 ml / min durante los primeros 5 min y luego 1.0 ml
/ min durante el tiempo restante. La fuente de ionización por electrospray usó un voltaje capilar de 3,2
kV y un voltaje de cono de 25V. Se usó nitrógeno como nebulizador y gas de desolvatación a un caudal
de 600 l / h. La proteína generalmente se eluye como un pico entre 3 y 5 min en estas condiciones. Las
masas calculadas se obtuvieron utilizando la herramienta ExPasy ProtParam (http: //web.expasy.org/
protparam /).

Construcción del plásmido que expresa MCR-1 para la prueba de susceptibilidad. La prueba de
susceptibilidad se llevó a cabo en MCR-1 de longitud completa expresado constitutivamente a partir
del vector pUC1941. La región codificante mcr-1 con su propio promotor (156 pb) y secuencia
descendente (111 pb) se amplificó por PCR a partir del plásmido pHNSHP458 usando ADN polimerasa
de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs) y mcr-1 1893 F y mcr-1- 1893 R (Tabla Suplementaria S5). El
fragmento se fosforiló, se purificó en gel, se digirió con XbaI y EcoRI y se clonó en pUC19 digerido con
XbaI y EcoRI para crear el plásmido pUC19-mcr-1. La integridad de la construcción se confirmó por
secuenciación de ADN.

Construcción de mutantes dirigidos al sitio MCR-1. Se generaron mutantes MCR-1 en pUC19-mcr-1

usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Agilent Genomics) con un protocolo
modificado (ciclos de reacción aumentados a 21) y cebadores como se especifica en la Tabla
Suplementaria S5.

Coexpresión de MCR-1 y E. coli DsbA. El fragmento que contiene mcr-1 se escindió del plásmido pUC-
19-mcr-1 por digestión doble con EcoRI y XbaI y se ligó en el plásmido pSU1842 para generar el
plásmido pSU18-mcr-1. pSU18-mcr-1 se transformó en E. coli TOP10 (Invitrogen), se purificó y se
verificó su integridad mediante digestión de restricción doble y secuenciación de ADN. Se sintetizó un
fragmento de 627 pb correspondiente al marco de lectura abierto dsbA de E. coli MG1655 (secuencia
de referencia NCBI: NC_00913.3) (Thermo-Fisher). El fragmento se insertó en pBAD-HisA (Invitrogen)
usando los sitios de restricción HindIII y NcoI para crear el plásmido pBAD-dsbA que se transformó en
E. coli TOP10 (Invitrogen). Se purificó pBAD-dsbA a partir de transformantes y se verificó su integridad
mediante digestión de restricción doble y secuenciación de ADN. Los plásmidos pSU18-mcr-1 y pBAD-
dsbA se transformaron en E. coli TOP10 y los recombinantes se seleccionaron en placas de agar LB que
contenían cloranfenicol (25 mg / l) y ampicilina (100 mg / l). El complemento plasmídico de los
transformantes se verificó por PCR y digestión de restricción doble. Las células que contenían los
plásmidos pSU18-mcr-1 y pBAD-dsbA se analizaron con respecto a la susceptibilidad a colistina
mediante dilución en agar como se describe a continuación.

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Método de Dilución de Agar. Concentraciones inhibitorias

mínimas (MIC) de colistina para E. coli TOP10 células que expresan MCR-1 de tipo salvaje y mutantes
en pUC19, y co-expresan MCR-1 y E. coli DsbA, se analizaron mediante el método de dilución en agar,
de acuerdo con Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST). Brevemente,
suspensiones bacterianas de densidad óptica correspondientes a 0.5 McFarland Standard
(aproximadamente 1.5 × 108CFU / mL) se prepararon para las pruebas y se usaron para inocular placas
de agar Mueller-Hinton (Becton Dickinson, EE. UU.) Suplementadas con colistina en rangos de
concentración de 0.125- 128 mg / l. La cepa de E. coli ATCC 25922 se usó con fines de control de
calidad. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes, cada uno con muestras por duplicado.
Método de microdilución en caldo. El efecto del EDTA sobre la susceptibilidad a colistina de los
aislamientos de laboratorio, ambientales, veterinarios y clínicos de E. coli se evaluó mediante
microdilución en caldo de acuerdo con el Comité Europeo de Ensayo de Susceptibilidad Antimicrobiana
(EUCAST). Los detalles de las cepas bacterianas usadas en estos experimentos se dan en la Tabla S3.
Brevemente, las células se resuspendieron hasta una densidad óptica correspondiente a un estándar
de 0,5 McFarland (aproximadamente 1,5 × 108CFU / ml) y se usaron para inocular placas de
microtitulación de 96 pocillos que contenían medio Mueller-Hinton ajustado a cationes (Becton
Dickinson, EE. UU.) A concentraciones de colistina de 0,25 a 128 μg / ml. Se añadió EDTA a los pocillos
experimentales hasta una concentración final de 250 μg / ml de EDTA. Las placas se incubaron durante
la noche a 37ºC y se leyó la densidad óptica en un lector de placas a 492 nm. Los experimentos se
llevaron a cabo por duplicado; para las cepas aisladas en China (Tabla S3) el experimento se repitió tres
veces.

Cálculos de Teoría Funcional de Densidad. Las geometrías iniciales se generaron a partir de estructuras
cristalinas de rayos X mediante la inclusión de residuos dentro de aproximadamente 5-10 Å de los
iones de zinc, y la posterior reducción manual para incluir las cadenas laterales y bucles relevantes de
los residuos. Los residuos se truncaron en un carbono alfa y se saturaron con átomos de hidrógeno; los
átomos de hidrógeno también se agregaron manualmente para satisfacer las valencias de todos los
otros átomos en el modelo. Las optimizaciones se realizaron utilizando seis restricciones cartesianas
sobre los carbonos alfa para los intermedios en los que se incluyeron His395 e His478 y cuatro en los
que se excluyeron. Todas las optimizaciones se realizaron utilizando la versión 8.543 de Jaguar, con la
función híbrida B3LYP44-47 utilizando criterios de convergencia poco estrictos. Los cálculos de prueba
en otros complejos usando los criterios de convergencia predeterminados más estrictos no condujeron
a cambios significativos en energías, longitudes de enlace o ángulos, pero consumieron mucho más
tiempo. Se utilizó un potencial de núcleo relativista efectivo para el (los) átomo (s) de zinc tal como se
incorporaron en el conjunto base LACV3P * de Jaguar, y se estableció la base Pople 6-31 G * para
todos los demás átomos. Las energías se calcularon usando cálculos de puntos únicos que incorporan
el modelo de solvatación de elementos finitos Poisson-Boltzmann48,49 tal como se implementó en
Jaguar. La constante dieléctrica se estableció en 4, como se usa comúnmente en el enfoque del
modelo de clúster50 y el radio de la sonda en 2Å. Las frecuencias vibratorias no se calcularon, por lo
que los datos energéticos no incluyen una corrección para la energía de punto cero, aunque
observamos que se esperaría que esto fuera bastante pequeño. En ausencia de cálculos de frecuencia,
los puntos estacionarios no se han verificado como mínimos. Disponibilidad de código Jaguar versi