UNIVERSIDAD DE TARAPACÁ

Facultad de Ciencias Agronómicas

“EFECTO DEL SUSTRATO SOBRE LA PRODUCCION DE

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES EN PLANTAS DE
KALANCHOE DAIGREMONTIANA

ANTEPROYECTO DE MEMORIA

Para optar al título de Ingeniero Agrónomo.

Alumno : Daniel Franco Miranda

Profesor Guía : Libertad Carrasco

Profesor informante :

Arica – Chile

2018
 ÍNDICE

1. Introducción ................................................................................................ 1
2. Objetivos ..................................................................................................... 3
2.1. Objetivo General .................................................................................. 3
2.1. Objetivos específicos............................................................................ 3
3. Revisión bibliográfica .................................................................................. 4
4. Materiales y métodos .................................................................................. 6
4.1. Materiales ............................................................................................. 6
4.2. Métodos................................................................................................ 6
4.2.1. Condiciones de crecimiento .............................................................. 6
4.2.2. Parámetros de Crecimiento ............................................................... 7
4.2.3. Contenido de iones ........................................................................... 8
4.2.4. Compuestos antioxidantes ................................................................ 9
4.2.5. Actividad antioxidante...................................................................... 10
4.2.6. Diseño Experimental y análisis estadístico...................................... 11
5.- Colaboradores ......................................................................................... 12
6.- Bibliografía ............................................................................................... 14
1. Introducción

Desde tiempos remotos se han utilizado plantas para curar o aliviar

las enfermedades, dando lugar a fitofármacos desarrollándose la
denominada medicina herbaria (OMS). Estos fitofármacos son entonces los
extractos de las plantas obtenidos de diversas formas de preparación para
mejorar el estado de salud.

Actualmente existe un gran interés por este tipo de medicina

tradicional en comparación con los productos de síntesis, y más apreciada
por su bajo costo, sus reducidos índices de toxicidad y su fácil acceso.

En este contexto y dentro de las plantas surgidas en la sociedad a

nivel mundial, se encuentra el kalanchoe (Kalanchoe daigremontiana),
originaria de Madagascar y perteneciente a la familia de las crasuláceas,
catalogada como especie invasora en zonas desérticas (Herrera I. H., 2012).

Se han registrado diversas actividades al kalanchoe, como son

antitumoral, antihistamínica, antiinflamatoria e inmunomoduladora (Puertas,
Gallego, & Arango, 2014). La medicina tradicional la utiliza contra
infecciones, antiinflamatoria y varios tipos de cáncer a nivel mundial (Hsieh et
al, 2016). Además de efectos inhibitorios sobre virus que atacan a linfocitos
B humanos, efecto insecticida contra larvas del gusano de la seda y aislación
de nuevas formas de vitamina E, triterpenoides y ácidos grasos de cadena
larga (Supratman et al, 2011) (Van Maarseven & Jetter, 2009).

Las plantas de la familia crasulácea se caracterizan fisiológicamente

por presentar un metabolismo denominado el Metabolismo Acido de las
Crasuláceas (CAM), haciéndolas más eficientes frente a situaciones de
estrés hídrico y alta luminosidad, ya que hacen fotosíntesis de noche (Taiz &
Zeiger, 2002). Además la variedad estudiada Kalanchoe daigremontiana
permite su reproducción y propagación económica, ya que produce gran
cantidad de gémulas en sus hojas que facilita su estudio (Helena, y otros,
2007).

Estas amplias características, sumado a los problemas presentes en

la Región de Arica y Parinacota de poseer un clima desértico costero, con
precipitaciones mínimas históricas, déficit de recurso hídrico y suelos salinos
(BCN), se combinan perfectamente para plantearse estudiar a las plantas
preparadas y dotadas de mecanismos que saquen ventaja a la Región.

1
 Sin embargo y a pesar de ser estudiados sus efectos no se han
presentado estudios ni avances de los efectos del suelo sobre la formación
de los compuestos que se obtienen de la planta para tratar de forma
terapéutica. De manera que no se conocen sus requerimientos nutritivos, ni
su correlación entre mejor contenido nutritivos del sustrato y la
cantidad/calidad de su capacidad antioxidante.

Conociendo las documentadas ventajas que trae al sustrato la

incorporación de materia orgánica en forma de compost y humus, lo
económico y factible de su producción, mejorando así el estado de las
plantas, se espera contribuir estudiando el efecto de diferentes
concentraciones de humus en el sustrato sobre el crecimiento de la planta y
compuestos antioxidantes, para fortalecer la comunicación entre la sociedad
y la comunidad académica, entregando respuestas confiables y certeras.

2
2. Objetivos

2.1. Objetivo General

Evaluar la influencia de diferentes concentraciones de sustrato

orgánico (humus) sobre el desarrollo y producción de compuestos
antioxidantes en plantas de Kalanchoe daigremontiana

2.1. Objetivos específicos.

- Determinar que combinación de sustratos presenta los mejores

resultados en la producción de compuestos antioxidantes
- Probar el efecto del humus sobre la cantidad y calidad de producción
de bioquímicos.

3
3. Revisión bibliográfica

El género Kalanchoe pertenece a la familia crassulaceae, tiene

alrededor de 125 especies descritas. Se encuentran principalmente en África,
Madagascar, América Tropical y Australia. Ha sido catalogada como una
especie invasiva en zonas desérticas de países como España, Puerto Rico,
EE.UU., Australia, Sudáfrica y Venezuela (Abdel-Raouf, 2012), (Herrera I. H.,
2012). Dentro de este amplio grupo se encuentra la especie Kalanchoe
daigremontiana Raym.-Hamet. & H (antes Bryophillum daigremontianum),
hierba suculenta, semelpara de vida corta, nativa de zonas semiáridas de
Madagascar (Hannan-Jones MA, 2002).

Desde el punto de vista etnomedicinal, las plantas de este género han

sido de marcado interés ya que ayudan a tratar problemas de salud como la
bronquitis, quemaduras, dolores de oído, picaduras de insectos, infecciones
respiratorias, tuberculosis, problemas de la piel, infecciones bacterianas y
fúngicas, problemas intestinales, cáncer (linfoma), epilepsia, varicela,
tratamientos clínicos del corazón, entre otros (Okwu & Nnamdi, 2011),
(Tkalec et al, 2012) (Kolodziejczyk-Czepas, et al, 2017) (Costa, Muzitano, &
Camargo, 2008). Las variedades pinnata y daigremontiana son las más
utilizadas, en diversas actividades como antitumoral, antihistamínica,
antiinflamatoria e inmunomoduladora (Tkalec, et al, 2012),ademas de
estudiar su eficacia para controlar celulas de cancer de pulmón (Hsieh,
Huang, Leu, Peng, Chang, & Chang, 2016).

El uso y estudio de Kalanchoe daigremontiana, se ha incrementado

específicamente en tratamientos contra el cáncer en donde se ve como una
alternativa viable debido a las moléculas químicas que produce (Puertas,
Gallego, & Arango, 2014). Se han aislado esteroides cardiotónicos
bufadienolidos que han presentado efectos inhibitorios sobre un virus que
ataca linfocitos B y potentes efectos antitumorales (Supratman, et al, 2014).

Sin embargo, dentro de la literatura consultada en el ámbito

agronómico se halla una falta de estudios, encontrando temas con potencial
de investigación, tales como la evaluació de la capacidad de incrementar el
reservorio y flujo de carbono en el suelo, encontrándose que el contenido de
humedad en el suelo bajo K. daigremontiana fue significativamente mayor
que en los sitios ocupados por la vegetación nativa del mismo sector
(Herrera, et al, 2011), o la demostración de que el uso de la colchicina

4
favorece el crecimiento en poco tiempo y aumenta la biomasa en la planta
(Salazaret al, 2018)

Por tanto, se hace necesario no solo desarrollar un sistema o

metodología de cultivo que garantice una producción sostenible de estos
metabolitos (Zabalaet al, 2009), sino también integrarse en casos
multidisciplinarios donde es necesario rigurosidad agronómica para la
evaluación de la relación entre los compuestos generados por la planta vs su
método de cultivo.

Falta hablar de compuestos antioxidantes, cómo se han relacionado

con prevención de enfermedades, de métodos antioxidantes ….

5
4. Materiales y métodos

4.1. Materiales

Material Vegetal:

Gémulas de kalanchoe (Kalanchoe daigremontiana), recolectadas de

la zona urbana de la ciudad de Arica.

Sustratos:

Turba, Arena, Humus

Localización del cultivo:

Las plantas se establecerán en el jardín terapéutico de la Unidad de

Cuidados Paliativos dentro de las dependencias del hospital Regional Juan
Noé Crevani, de la ciudad Arica (región de Arica y Parinacota, Chile)

Procesamiento y análisis de las muestras:

El procesamiento de las muestras y los distintos análisis químicos y

bioquímicos se realizarán en el Laboratorio de Investigación Bioquímica del
Departamento de Química de la Facultad de Ciencias, Universidad de
Tarapacá, Campus Velásquez.

4.2. Métodos

4.2.1. Condiciones de crecimiento

La gémula de Kalanchoe daigremontiana se pondrá a germinar en un

sustrato de turba con perlita. Los componentes utilizados para obtener las
mezclas de sustratos serán: arena de río, turba con perlita y humus de
lombriz obtenido por el proceso de digestión de lombriz californiana. La
proporción de componentes de sustrato en cada tratamiento se observa en el
cuadro 1. Las mezclas se realizaran de forma manual. Transcurridos los 30
días se realizara el trasplante a bolsas de plástico negras de 4L, utilizando un
diseño completamente al azar, con cinco tratamientos y diez repeticiones.

6
El crecimiento y desarrollo de las plantas será monitoreado adecuadamente
con la finalidad de mantenerlas libres de aves, plagas y enfermedades. Las
bolsas serán rotadas periódicamente para mantener la uniformidad de las
condiciones de cada unidad experimental.

Además se monitoreará periódicamente: altura de plántulas (mm), y número

de hojas verdaderas.

TRATAMIENTO Arena(%) Turba(%) Humus(%)

1 50 50

2 37.5 37.5 25

3 25 25 50

4 12.5 12.5 75

5 100

4.2.2. Parámetros de Crecimiento

Acumulación de materia seca: Para la determinación de la

acumulación de materia seca, las plantas serán secadas en estufa a una
temperatura de 80°C ± 5°C hasta obtener una masa constante (24 horas
aproximadamente). La acumulación de materia seca se expresará como la
diferencia del peso de las plantas al final de los tratamientos menos el peso
de las plantas registrados al inicio de los tratamientos.

Área foliar: El área foliar total por planta se obtuvo a través de la suma
del área foliar de cada una de las hojas de la planta, utilizando la relación:
Área= 0,742× L ×A (Francis, 1969); donde= 0,742 es el coeficiente de área
para maíz; L= largo de la hoja; A= ancho máximo de la hoja. El incremento
del área foliar se expresó como la diferencia del área foliar al final de los
tratamientos menos el área foliar de las plántulas registrados al inicio de los
tratamientos.

Relación raíz/parte aérea: Esta relación se estimará a través del

cuociente obtenido de la división entre el peso seco de la raíz y el peso seco

7
de la parte aérea. La variación de la relación raíz/parte aérea se expresará
como la diferencia de la relación raíz/parte aérea de las plantas al final de los
tratamientos menos la relación raíz/parte aérea de las plántulas registradas
al inicio de los tratamientos.

4.2.3. Contenido de iones

Análisis para Ca2+, Na+ y K+: Las muestras compuestas de tejido

vegetal serán secadas en estufa, molidas y calcinadas en mufla a 550 ºC por
un período de 2 horas. Las cenizas se solubilizarán con agua destilada y HCl
2 M. Posteriormente, las muestras se filtrarán y se llevarán a un volumen final
constante con agua destilada. El contenido de Ca 2+ se determina por medio
de espectrofotometría de absorción atómica, y el de Na + y K+ por fotometría
de emisión por llama (Sadzawka et al, 2004).

Análisis para fósforo (P): Las muestras compuestas de tejido vegetal

serán secadas en estufa, molidas y calcinadas en mufla a 550 ºC por un
período de 2 horas. Las cenizas se solubilizarán con agua destilada y HCl 2
M. Posteriormente, las muestras se filtrarán y se llevarán a un volumen final
constante con agua destilada. Luego, se harán reaccionar con el reactivo
vanadomolibdato de amonio el que con el fósforo forma un complejo de color
amarillo. Este complejo coloreado será posteriormente cuantificado por
medio de espectrofotometría de absorción molecular a 430 nm (Sadzawka y
cols., 2004).

Contenido relativo de agua (CRA): El contenido relativo de agua (CRA)

se obtendrá de la medida del peso fresco (PF) de discos foliares, del peso
turgente (PT) que se obtendrá de la hidratación de los discos al cabo de 3
horas y el peso seco (PS) del material secado en estufa a 80ºC hasta peso
constante (Slavik, 1974).

Entonces el contenido relativo de agua será calculado a través de la

siguiente fórmula:

CRA (%) = (PF - PS/ PT - PS) ×100

8
4.2.4. Compuestos antioxidantes

Preparación de muestras: La materia prima fresca será molida y

guardadas a -20°C hasta su análisis.

Cuantificación de Antocianinas: la cuantificación de antocianinas se

realizará por el método de (Ticconi et al, 2001) .Se masa aproximadamente 1
g de materia prima y se solubiliza con 5 mL de una solución compuesta por
propanol: HCl: H2O (18:1:81 v/v/v). Las muestras serán hervidas en un baño
de agua durante 3 min. Luego se dejarán en oscuridad y a temperatura
ambiente por 24 horas. Pasado el tiempo se centrifugará a 5000xg a 4°C por
10 min. La absorbancia se mide a partir del sobrenadante obtenido, por
espectrofotometría a 535 nm y a 650 nm. La absorbancia correspondiente a
las antocianinas se calculará de acuerdo a (Lange, et al, 1971) donde:

A=A535-A650

Cuantificación de Polifenoles: el contenido de compuestos fenólicos

totales se determinará siguiendo el método de Folin-Cioccalteau (Singleton
ete al, 1999)Se masa 1,0 g de materia fresca y se solubiliza en 10 mL de
metanol. Posteriormente se centrifuga a 8000xg por 15 min. Se toman 0,5
mL del extracto metanólico y se depositan en un tubo centrifuga cubierto de
papel aluminio, se adicionan 0,75 mL de reactivo Folin-Ciocalteu, se
homogeniza y se deja reposar durante 5 min. Posteriormente, se añaden
0,75 mL de Na2CO3 al 20% (p/v) para generar la transferencia de electrones
a pH básico, dejando reposar por 90 min. La absorbancia se mide a 760 nm
en un espectrofotómetro (Spectronic, modelo Genesys 6). Los valores
obtenidos se relacionan con la curva de calibración empleando ácido gálico
como patrón y los resultados se expresan como mg ácido gálico g-1 MS (MS,
materia seca).

Cuantificación de del contenido de clorofilas a, b y carotenoides

(carotenos y xantófilas): el contenido de clorofila a, b y carotenoides se
determinar a partir de 0,05 g de material vegetal al que se le agregan 6 mL

9
de acetona al 100% para extraer los pigmentos. Las muestras contenidas en
tubo de ensayo cubierto con papel de aluminio para evitar la fotooxidación de
los pigmentos serán agitadas durante 1 minuto y luego se procederá a
centrifugar los tubos por 2 minutos a 5000xg. El sobrenadante resultante, se
empleará para la cuantificación de los pigmentos por espectrofotometría de
absorción molecular (Spectronic, modelo Genesys 6). Las longitudes de onda
utilizadas en este análisis serán 750, 662, 645, y 470 nm, efectuando
correcciones si la muestra presenta turbidez a 750 nm (las clorofilas no
absorben a esta longitud de onda (Lacuesta et al, 1992)

C = F (Abs750 – 0,002)

dónde:

F = 1, para la absorbancia a 662 nm y 645 nm

F = 2, para la absorbancia a 470 nm

La concentración de clorofilas, carotenos y xantófilas fueron calculadas

mediante las siguientes fórmulas:

Clorofila a (μg/mL) = (11,24 × 𝐴662 − 2,04 × 𝐴645 )

Clorofila b (μg/mL) = (20,13 × 𝐴645 − 4,19 × 𝐴662 )

1000×𝐴470 −1,90𝐶ℎ𝑙 𝑎 −63,14𝐶ℎ𝑙 𝑏

Carotenoides (carotenos + xantófilas) (μg/mL) = 214

Fórmula 1: Concentración de clorofilas y carotenoides en µg/mL.

4.2.5. Actividad antioxidante

Actividad Antioxidante (método DPPH): la capacidad para capturar

radicales libres de los extractos será determinada utilizando como referencia
la disolución de 2,2-difenil-1-1picrihidrazil (DPPH), mediante el método de
Fukumoto y Mazza (Fukumoto & Mazza, 2000). Se masa 1,0 g de materia
prima aproximadamente y se agregan 10 mL de metanol al 100%, la mezcla
será agitada por 24 horas. Luego, transcurrido el tiempo de agitación, se
centrifugará a 3600xg por 2 min. Del sobrenadante se prepararán las
siguientes soluciones: un control, el que solo contiene 1 mL de DPPH, se
mide inmediatamente la absorbancia a 517 nm a tiempo 0. La muestra, que
consiste en 1 mL de DPPH; 0,5 mL de sobrenadante; 2,5 mL de metanol, fue
almacenado en oscuridad por 60 min. Se mide la absorbancia a 517 nm.
Estas muestras serán comparadas con el blanco, el cual solo contiene
metanol. La actividad antioxidante será expresada como porcentaje de

10
inhibición que corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el
extracto a una determinada concentración:

𝐴1 − 𝐴
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = %𝐼 = × 100
𝐴

Fórmula 2: % Inhibición del radical 1,1difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) en el

extracto. Donde A es la absorbancia del blanco, y A 1 es la absorbancia de la
muestra.

Actividad antioxidante (Método FRAP): la actividad antioxidante no

enzimática total se mide mediante el ensayo FRAP (Poder antioxidante
reductor del hierro). Se masa 1,0 g de materia prima, con 10 mL de metanol.
Para la determinación del test FRAP se añade una alícuota de 100 µL de
extracto metanólico, a 2 mL de reactivo FRAP, cuya mezcla está compuesta
por 1 mM de TPTZ (2,4,6-tripyridyl-2-triazine), 20 mM de cloruro férrico en
0,25 M de acetato de sodio a pH 3,6. Posteriormente la mezcla se deja a
temperatura ambiente (25°C) durante 5 min. Se mide la absorbancia a 593
nm. Los datos serán analizados respecto a una curva patrón de ión ferroso
de 25 a 1600 µM (Benzie & Strain, 1996); (Rosales et al, 2006). Los
resultados se expresarán en µmol g-1 PS.

4.2.6. Diseño Experimental y análisis estadístico

La unidad experimental consistirá en una planta y el número de repeticiones

por tratamiento será diez.

Los datos experimentales de cada parámetro en estudio correspondieron a la

media de diez replicas ± error estándar (SE). Los datos serán analizados a
través de análisis de varianza (ANOVA) a una probabilidad de  = 0,05.
Cuando sea significativa la interacción se realizará el análisis de efectos
simples. Para la comparación de los promedios se utilizará el test de Tukey a
un nivel de significancia del 95%. El programa estadístico a utilizar será el
STATGRAPHICS Plus versión 5.1.

StatPoint Technologies. (2001). Statgraphics Plus 5.1. StatPoint

Technologies, Warrenton, Virginia: USA.

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5.- Colaboradores

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13
6.- Bibliografía

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