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Germinación en agentes genotóxicos

Día 0: Preparación de material


- Cortar el pedicelo a 375 semillas
- Esterilizar:
 18 Cajas Petri grandes
6 para germinaciones (día 1)
12 para tratamientos (día 2)
 10 Cajas Petri pequeñas para germinaciones (día 1)
 1 Frasco 500 mL con 20 mL de cloralex y 180 mL de agua.
 1L de agua
 2 Pinzas millipore en dos probetas
 2 Probetas 100 mL
 530 mL de agar 0.7% (3.71 g en 530 mL)
 360 mL de agar 0.7% (2.45 g en 360 mL)
 360 mL de agar 0.7% (2.45 g en 360 mL)

Día 1: Germinación
Sembrar 50 semillas en cada una de las 6 cajas grandes
Sembrar 15 semillas en cada una de las 5 cajas pequeñas.

Día 2: Imbibición en genotóxico y extracción raíces 3, 6 y 12 horas


Transferir semillas a cajas controles y con genotóxicos.

- Zeocina 10 µM (40 µL en 360 mL) y 20 µM (80 µL en 360 mL)


- Ciprofloxacino 1.0 µM ( en 360 mL) y 1.5 µM ( en
360 mL)
- Hidroxiurea 0.25 µM (6.8 mg en 360 mL) y 0.5 µM (13.6 mg en
360 mL)
36 horas de germinación:

Inicio 3 horas 6 horas 12 horas 24 horas 48 horas


19:30 10:30 13:30 19:30 10:30 10:30

Día 3: Extracción de raíces 24 horas

- Preparar 1 L de agua DEPC (1 mL/1 L). Agitación O/N

Día 4: Extracción de raíces 48 horas

- Esterilizar 40 ciclos lenta:


 12 Morteros con pistilo
 12 Espátulas
 1 L de agua DEPC
 Puntas de los tres tamaños
 Tubos eppendorf (PCR, 0.6, 1.5. 2.0 mL)

Día 5: Extracción RNA

Día 6: Calibración

Día 7: RT y PCRs

Hidroxiurea
Control 3h

10 µM
Control
3 horas 10 µM Sin crecimiento suficiente de raíz
20 µM
Control
6 horas 10 µM Sin crecimiento suficiente de raíz
20 µM
Control
12 horas 10 µM
20 µM
Control
24 horas 10 µM
20 µM
Control
48 horas 10 µM
20 µM
00:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00
6:00 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00
12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00
18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00

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