Evidencias espectroscópicas dependientes de la temperatura de la curcumina en medio

acuoso: un estudio mecanístico de su solubilidad y estabilidad

RESUMEN: En la curcumina, el equilibrio ceto-enol-enolato del resto

heptadieno-diona determina sus propiedades fisicoquímicas y
antioxidantes. Sin embargo, su escasa solubilidad en agua a pH neutro y
temperatura ambiente disminuye su biodisponibilidad. Las posibles
aplicaciones terapéuticas han despertado un interés en la manipulación
de la solubilidad de la curcumina en agua ya que su estabilidad y
solubilidad en agua sigue siendo poco conocida. Aquí, se informa el
mecanismo detrás de su solubilidad a diversas temperaturas y la
influencia de la interacción de la temperatura, la unión H intramolecular
y las fuerzas intermoleculares, lo que conduce a la agregación-
desagregación a diversas temperaturas. Se observa un cambio notable en
el comportamiento de transición electrónica dependiente de la temperatura de la curcumina, sin embargo, los espectros de absorción
después de los ciclos de enfriamiento y calentamiento permanecen sin cambios, lo que indica una estabilidad térmica mucho mejor
de la curcumina en el agua de lo que se pensaba anteriormente. Este estudio indica que quizás sea la ruptura de los enlaces de
hidrógeno intramoleculares lo que conduce a la exposición de grupos polares y, por lo tanto, es responsable de la disolución de la
curcumina a temperaturas más altas. La formación de agregados intermoleculares podría ser responsable de una mejor estabilidad a
temperatura ambiente de las moléculas después de enfriar su suspensión acuosa de 90 a 25 ° C. Estos estudios de solubilidad de la
curcumina tienen una gran aplicación en la investigación biológica con referencia a la biodisponibilidad y para comprender el modo
de acción orientado al blanco de la curcumina.

INTRODUCCIÓN alqueno conjugada, y la falta de disponibilidad de un grupo polar

Después del advenimiento de varias drogas sintéticas por los
continuos esfuerzos de los químicos sintéticos en todo el mundo
con un objetivo más amplio para mejorar los estándares de salud
a un costo accesible, existe una creciente preocupación por el
aumento del costo para diseñar nuevas moléculas de fármacos y
sus ensayos clínicos , además de otros problemas serios como su
solubilidad, los peligros ambientales en sus producciones a gran
escala y los registros de seguridad humana a largo plazo debido
a los efectos secundarios desconocidos.1 Debido a estas razones,
los investigadores han vuelto su atención a algunos de los factores
naturales. productos, medicinas tradicionales desgastadas por el
tiempo y las moléculas responsables de sus actividades
terapéuticas donde se requieren esfuerzos para validar
científicamente su eficiencia y otros parámetros.2 La cúrcuma es
una de esas drogas milagrosas que ha vuelto a atraer la atención
de personas de todo el mundo1 para diversas dolencias incluida
la cicatrización de heridas, el aligeramiento de la piel (como
cosmético), efecto antiinflamatorio y antimicrobiano s desde
tiempos inmemoriales.3 La curcumina o diferuloilmetano (1,7-bis
[4-hidroxi-3-metoxifenil] -1,6-heptadieno-3,5-diona) es un
componente funcional principal (2-5%) de cúrcuma, reconocida
como la responsable de la mayoría de sus efectos terapéuticos.4-
6 Al observar sus capacidades de curado, se estudia la curcumina
7-12 para aplicaciones clínicas generalizadas.13 Sin embargo,
baja solubilidad acuosa y, por consiguiente, mala absorción y
biodisponibilidad, seguida de rápida el metabolismo y la
eliminación sistémica14,15 dificultan el uso directo de la
curcumina como biomedicina. Aunque la hidrofobicidad de la
molécula ayuda en varias interacciones moleculares, controlando
las propiedades fisicoquímicas, 16-20 es poco soluble en agua a
pH neutro debido a la fuerte hidrofobicidad de la cadena de
fuerte hace que la molécula insoluble o escasamente soluble en
disolventes polares. Sin embargo, en medios ligeramente ácidos y
posiblemente en el interior de las membranas celulares, es
probable que exista en la forma ceto. Esta forma parece favorecer
las reacciones de transferencia del átomo de H 21, por lo tanto,
desempeña un papel crucial en la acción antioxidante de la
curcumina. La biodisponibilidad mejorada de la curcumina como
fármaco en el futuro cercano definitivamente agregará una nueva
dimensión como una molécula prometedora a la vanguardia de
los agentes terapéuticos para el tratamiento de varias
enfermedades De ahora en adelante, se han adoptado varios
métodos de conjugación para potenciar la solubilidad y su
biodisponibilidad. 18,19,22-27
Varios investigadores han estudiado la estructura de la
curcumina, la solubilidad de la curcumina en diferentes solventes
orgánicos, las predicciones de las excitaciones electrónicas y
vibratorias, y sus datos experimentales; sin embargo, no se
informa un estudio detallado de curcumina en agua a diferentes
temperaturas. Teniendo en cuenta los desafíos en el uso de esta
molécula como fármaco potente, en el presente estudio, en este
artículo, se investigan en detalle los efectos de la temperatura y
el entorno dieléctrico sobre la solubilidad y la estabilidad
estructural de la curcumina y se estudia su mecanismo realizando
una detallada mediciones espectroscópicas visibles UV in situ. Se
observa que el espectro de la curcumina en el agua es complicado,
depende únicamente de la temperatura y es diferente de lo que
se obtiene en los solventes orgánicos. A continuación, los
resultados del estudio espectroscópico de la solubilidad y la
estabilidad de la curcumina en entornos variados se presentan
mediante espectroscopía de absorción UV-vis, fotoluminiscencia,
espectroscopía de RMN y análisis de HPLC.

SECCION EXPERIMENTAL
Materiales. Los autores de CFTRI proporcionaron curcumina
purificada. La pureza de la curcumina recibida se verificó
mediante el uso de diversas técnicas, como la espectroscopía UV-
vis, la espectroscopia FTIR, la espectroscopía de RMN y la
HPLC (ver Información de apoyo). A menos que se mencione en
el manuscrito, se prepararon 2 mg de curcumina en 3 ml de agua
desionizada (purificada a través de un sistema Millière Milli-Q
con una resistividad de 18 MΩ / cm) a pH neutro calentando (>
75 ° C) para todas las pruebas .
Espectroscopia in situ de absorción UV-Vis dependiente
de la temperatura. Se realizó una espectroscopía de absorción
in situ dependiente de la temperatura hasta 95 ° C, con
adquisición de espectro en un intervalo de cada 5 ° C de aumento
de temperatura, usando un espectrofotómetro Cary 50 UV / vis
a una resolución de 1 nm.
Mediciones fotoluminiscentes. La curcumina se disolvió a
alta temperatura y se filtró a través del papel de filtro Whatman
(tamaño de retención> 11 μm) para eliminar los grandes
agregados. Los datos se recogieron usando un espectrofotómetro
de fotoluminiscencia Cary Eclipse de Varian equipado con una
lámpara de flash de xenón.
Mediciones de RMN. La espectroscopía de RMN se realizó en
la curcumina tratada térmicamente disuelta en metanol
deuterado. El espectro de 1H NMR se tomó usando un
instrumento Bruker AVANCE de 400 MHz usando una sonda de
banda ancha con una bobina zgradient. Los desplazamientos
químicos (δ) se expresan en ppm y se refieren al disolvente
CD3OD.
Mediciones HPLC. Los datos se recogieron en el sistema
HPLC de la serie Delta 600 de Waters Corporation y se usó una
longitud de onda de 425 nm para la detección. Para este fin, la
elución se llevó a cabo con sistemas de disolventes en gradiente
con un caudal de 1,0 ml / min a temperatura ambiente. La fase
móvil consistió en metanol (A), agua (B) y acetonitrilo (C). La
muestra se determinó usando los disolventes anteriores
programados linealmente desde 45 a 65% de acetonitrilo en B
durante 0-15 min. El gradiente pasó entonces del 65 al 45% de
acetonitrilo en B durante 15-20 minutos, con una constante del
5% A. Los compuestos se analizaron usando el software HP
ChemStation.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La estructura de la curcumina está representada en (1). Aquí, el
resto β-dicetona se somete a la tautomerización ceto-enol28 y la
molécula existe en una forma planar, intramolecularmente
hidrogenificada, tanto en solución como en forma de polvo.29
Como se discutió anteriormente, a pH 7, la curcumina es de
naturaleza totalmente hidrofóbica debido a la falta de cualquier
grupo polar disponible en la molécula, así como debido a la
extensión de la cadena principal conjugada (heptadieno).
15,28,30,31 Es conocido que un doble enlace aislado o un solo par
de electrones da lugar a una fuerte absorción de
aproximadamente 190 nm, 32 mientras que la presencia de
conjugación reduce la separación de energía entre los orbitales
ocasionada por la absorción a longitudes de onda más largas. En
disolventes orgánicos, la enolización del grupo dicetona en la
curcumina permite la conjugación entre las nubes de electrones
π de las dos partes de vinilguaiacol. Esto conduce a un cromóforo
conjugado común, lo que resulta en una reducción de la energía.
Debido a la excitación π-π * de baja energía de ese cromóforo, la
solución de curcumina en solventes orgánicos (principalmente
etanol o metanol) típicamente absorbe alrededor de ~ 420 nm,
por lo tanto, exhibe un color amarillo brillante. La transición n-
π *, debida a la excitación de un electrón de par único de oxígeno
al orbital p antienlazante del grupo carbonilo en la curcumina,
se observa alrededor de 262 nm en metanol (ver curva roja en la
Figura 1C).
En un medio acuoso, se entiende que, a pH alcalino, el
grupo ácido fenólico en la curcumina dona su hidrógeno,
formando el ion fenolato que permite que la curcumina se
disuelva en agua. Sin embargo, la molécula no es estable durante
mucho tiempo a pH neutro y alcalino y se degrada fácilmente en
compuestos como vainillina, ácido ferúlico, etc.33 Por debajo del
pH 7, la curcumina es estable, pero paralela a los valores de pH
decrecientes, el equilibrio de disociación se desplaza hacia la
forma neutra de solubilidad acuosa muy baja. Debido a este
proceso, se puede observar un cambio significativo del espectro
de absorción UV-vis de la curcumina a valores de pH ácidos. Sin
embargo, en pH neutro, es prácticamente insoluble a
temperatura ambiente.
Los cambios espectrales reversibles dependientes de la
temperatura se han observado anteriormente en moléculas
orgánicas.34 Debido a la estructura plana y naturaleza
hidrofóbica de la molécula de curcumina, las interacciones π-π
entre las nubes de electrones π de las moléculas aromáticas
también deben considerarse en la solvatación como la
desolvatación.35 La posibilidad de apilar las moléculas de
curcumina juntas en una disposición supramolecular unida
mediante enlaces H se refleja en las observaciones discutidas a
continuación. La espectroscopía de absorción UV-vis dependiente
de la temperatura de la curcumina en el agua y los efectos de la
unión intramolecular de Hb y las fuerzas intermoleculares en las
transiciones electrónicas se analizan en esta sección. Para
verificar el efecto de la temperatura sobre la solubilidad y
estabilidad de la curcumina en agua, se llevó a cabo una
espectroscopía de absorción in situ dependiente de la
temperatura hasta 95 ° C. Los resultados se presentan en la
Figura 1A, donde se observó que, a medida que aumenta la
temperatura, la intensidad máxima también aumenta alrededor
de las longitudes de onda 237, 345 y 419 nm y el color de la
solución se vuelve amarillo cúrcuma. En la Figura 1B, el aumento
en la intensidad del pico situado por encima de 400 nm se
representa en función de la temperatura. Aquí, se observó un
desplazamiento solvatocrómico en la espectroscopía de absorción
dependiente de la temperatura de curcumina en agua. En
general, los efectos del solvente en las transiciones π-π* y n-π *
podrían cambiarse al rojo o al azul dependiendo de
 espectroscopia UV visible in situ detallada mediciones. Se
observa que el espectro de la curcumina en el agua es complicado,
depende únicamente de la temperatura y es diferente de lo que
se obtiene en los solventes orgánicos. A continuación, los
resultados del estudio espectroscópico de la solubilidad y
estabilidad de la curcumina en entornos variados se presentan
utilizando UV-vis. espectroscopia de absorción,
fotoluminiscencia, espectroscopía de RMN y análisis de HPLC.
Los cambios espectrales reversibles dependientes de la
temperatura se han observado anteriormente en moléculas
orgánicas.34 Debido a la estructura plana y naturaleza
hidrofóbica de la molécula de curcumina, las interacciones π-π
entre las nubes de electrones π de las moléculas aromáticas
también deben considerarse en la solvatación como la
desolvatación.35 La posibilidad de apilar las moléculas de
curcumina juntas en una disposición supramolecular unida
mediante enlaces H se refleja en las observaciones discutidas a
continuación. La espectroscopía de absorción UV-vis dependiente
de la temperatura de la curcumina en el agua y los efectos de la
unión intramolecular de Hb y las fuerzas intermoleculares en las
transiciones electrónicas se analizan en esta sección. Para
verificar el efecto de la temperatura sobre la solubilidad y
estabilidad de la curcumina en agua, se llevó a cabo una
espectroscopía de absorción in situ dependiente de la
temperatura hasta 95 ° C. Los resultados se presentan en la
Figura 1A, donde se observó que, a medida que aumenta la
temperatura, la intensidad máxima también aumenta alrededor
de las longitudes de onda 237, 345 y 419 nm y el color de la
solución se vuelve amarillo cúrcuma. En la Figura 1B, el aumento
en la intensidad del pico situado por encima de 400 nm se
representa en función de la temperatura. Aquí, se observó un
desplazamiento solvatocrómico en la espectroscopía de absorción
dependiente de la temperatura de curcumina en agua. En
general, los efectos del solvente en las transiciones π-π * y n-π *
podrían cambiarse al rojo o al azul dependiendo de las
polarizabilidades de las interacciones solutos-solventes y de eso
sus efectos sobre la reorganización de electrones en el soluto y el
solvente La mayoría de las transiciones resultan en un aumento
en la naturaleza polar en el estado excitado que en el estado
fundamental. Las distorsiones del cromóforo también pueden
conducir a cambios de color rojo o azul dependiendo de la
naturaleza de la distorsión. En el caso de transiciones n-π *
prohibidas débiles del par aislado de oxígeno en las cetonas, el
efecto del disolvente depende del grado en que el disolvente puede
las polarizabilidades de las interacciones solutos-solventes y de
formar enlaces H con el grupo carbonilo de la curcumina en el
eso sus efectos sobre la reorganización de electrones en el soluto
estado excitado. En la solución metanólica de curcumina, el
y el solvente La mayoría de las transiciones resultan en un
máximo de absorción de la transición n-π * es a 262 nm (ver
aumento en la naturaleza polar en el estado excitado que en el
curva roja en la Figura 1C), mientras que en solución acuosa,
estado fundamental. Las distorsiones del cromóforo también
esta transición se sitúa alrededor de 237 nm. En la Figura 1C se
pueden conducir a cambios de color rojo o azul dependiendo de
muestra una comparación del espectro de curcumina en agua y
la naturaleza de la distorsión. En el caso de transiciones n-π *
el espectro de curcumina en metanol. Esto ayudará a entender la
prohibidas débiles del par aislado de oxígeno en las cetonas, el
siguiente explicación. Claramente, la transición n-π * está
efecto del disolvente depende del grado en que el disolvente puede
desplazada en azul del metanol al agua, un disolvente más polar.
formar enlaces H con el grupo carbonilo de la curcumina en el
Aquí, el efecto de la temperatura no parece afectar este
estado excitado. En la solución metanólica de curcumina, los
desplazamiento azul causado por el efecto del solvente como se
máximos de absorción del presente estudio, en este artículo, el
esperaba. Sin embargo, las transiciones π-π * de la curcumina en
efecto de la temperatura y el entorno dieléctrico sobre la
el agua, a diferencia de la transición n-π *, son bastante
solubilidad y la estabilidad estructural de la curcumina se
complicadas. En este caso, generalmente el efecto opuesto ocurre
investigan en detalle y se estudia su mecanismo mediante la
cuando las interacciones dipolo-dipolo con las moléculas de
disolvente polar disminuirán la energía del estado excitado que apilamiento π-π que no pueden pasarse por alto en ausencia de
la del estado fundamental. Por lo tanto, se esperaba un cambio evidencia de una investigación directa de las fuerzas que se
al rojo para la transición π-π * mientras se cambiaba el metanol juegan entre las moléculas.
al agua. Sin embargo, el pico de absorción para la transición π-
π * en metanol está situado a 420 nm y en agua, se observan dos
picos a aproximadamente 345 y 419 nm donde la intensidad del
pico a 345 nm es prominente en comparación con el pico en 419
nm. La evolución de estos dos picos de absorción para las
transiciones π-π * de la curcumina en el agua indica un cambio
en la forma tautomérica del grupo cetoenol-enolato en la
curcumina, donde el papel del efecto del disolvente y la
temperatura pueden ser significativos. En contraste con estos
resultados, es importante confirmar que el espectro de absorción
de curcumina en metanol no cambia con la variación de
temperatura. Se observó que hay una "disminución" leve en la
intensidad con el aumento de la temperatura debido a la
distribución de Boltzmann de las poblaciones en el estado
fundamental a diferentes temperaturas (ver Información de
apoyo, S2). Por lo tanto, parece que la estabilidad de resonancia
en el enolato de ceto-enol en el agua cambia bruscamente a
medida que aumenta la temperatura. La energía térmica
proporcionada por el calentamiento podría ser responsable de
romper la unión H intramolecular del grupo ceto-enola-enolato
en la curcumina, exponiendo los grupos polares al disolvente. Sin
embargo, en lugar de un desplazamiento hacia el rojo causado
por más interacciones dipolo-dipolo entre la curcumina y las
moléculas de agua, se observó un notable desplazamiento azul en
el pico a 345 nm (Figura 1A). El desplazamiento hacia el azul
podría deberse a estos dos factores: (1) la mayor energía de
activación térmica de la solución podría dificultar la interacción Para comprender mejor el mecanismo así como para
entre el soluto y el solvente, evitando que formen interacciones examinar la estabilidad térmica de la molécula, los espectros
iónicas o intermoleculares estables π-π y, por lo tanto, reduciendo UV/vis in situ de la curcumina en agua se adquirieron durante
las interacciones dipolo-dipolo y aumentando la energía de la un ciclo de calentamiento, mostrado por la curva negra) es
transición, y (2) la apertura del resto cíclico (grupo ceto-enol- similar a los resultados mostrados anteriormente en la Figura 1A,
enolato) en la curcumina ha reducido el efecto de conjugación de sin embargo, después de enfriar la muestra a ~ 25 ° C, hay un
la molécula y, por lo tanto, aumenta la energía. Por lo tanto, a cambio notable en los espectros de absorción (mostrados por la
medida que aumenta la temperatura de la muestra, se observa curva roja) donde los picos de absorción después del primer
que las posiciones de los picos de absorción desacoplados de la calentamiento están situados a 237, 345 y 420 nm (en 90 ° C) y
transición π-π * se mueven a una frecuencia más alta. Esto se después del
considera que el resultado de una disminución en la fuerza H- Enfriando, los picos se observan a 275, 431 y 500 nm (a 25
unión entre las moléculas de agua y curcumina, a altas ° C). Se cree que la transición n-π * se desplaza hacia el rojo
temperaturas, donde los grupos ceto-enol de la curcumina durante el enfriamiento debido a la reagregación (por formación
podrían haber estado disponibles para la interacción con las de enlaces de hidrógeno) y al microambiente menos polar causado
moléculas de agua (debido a la rotura de H- intramolecular por la agregación. La curva verde que corresponde al
vinculación). A medida que la temperatura aumenta, las recalentamiento de la suspensión acuosa de curcumina muestra
resistencias del enlace H se vuelven progresivamente más débiles que durante el recalentamiento, los picos reaparecen en sus
como resultado de una mayor distorsión y alargamiento de los posiciones originales (237, 345 y 420 nm). Este proceso se
enlaces H. Con respecto a las características de absorción de la describe en el esquema presentado en la Figura 2B. La imagen
molécula, es evidente que hay cambios ambientales causados por en el recuadro de la Figura 2A muestra dos viales con curcumina
la ruptura del enlace H intramolecular en el tautómero ceto-enol en agua a 90 ° C, que es una solución transparente bastante
a medida que se eleva la temperatura, lo que conduce al cambio transparente (izquierda) y 25 ° C que es relativamente turbia
en la energía de transición electrónica. Además, a medida que la (derecha), representan el ciclo de aglomeración-desaglomeración
conjugación disminuye, la longitud de onda de la absorción de la molécula . Además, el cambio de 431 a 420 nm durante el
máxima también disminuye. Tanto la interacción dipolar calentamiento indica la ruptura de las interacciones en el mismo.
inespecífica como la interacción específica de unión de Hb juegan Como se propuso anteriormente en este documento, con el
un papel importante en la posición de los máximos de absorción calentamiento, la ruptura del enlace H intramolecular
y fluorescencia de cualquier muestra. Como se indicó posiblemente conduzca al máximo de absorción a 345 nm y a la
anteriormente, los grandes cambios espectroscópicos observados solubilidad mejorada a 90 ° C. El pico a 420 nm también es
también podrían se explicará en base a las interacciones de característico de la curcumina en casi todos los disolventes

orgánicos (excepto como la etil amina, que es muy básica).
Durante el proceso de enfriamiento, tienen lugar interacciones
dipolares o hidrofóbicas inespecíficas que conducen al pico fuerte
a 345 nm (visto en el ciclo de calentamiento) reduciéndose a un
hombro pequeño después de enfriarse a temperatura ambiente.
Es imperativo notar que el estado sólido de empaquetamiento de
la molécula también juega un papel en la energética y, por lo
tanto, en la solubilidad a diferentes temperaturas. La formación
del enlace H, las interacciones π-π y el empaquetamiento
molecular36 pueden ajustarse al proceso físico de agregación y
desagregación observado. Se muestra más prueba de la hipótesis
propuesta en el recuadro de la Figura 2A, donde se exhibe la
transmisión óptica de la muestra. El vial de muestra (i) es el de
la curcumina en agua a 90 ° C y es una solución ópticamente
transparente. La misma muestra se enfría a temperatura
ambiente (ii) y se observa que hay turbidez en la muestra. Aquí,
como se ve en la imagen, debido a la apariencia nebulosa de la
muestra, se sospecha que la espectroscopía de esta suspensión
turbia de partículas de curcumina en agua implica una gran
contribución de dispersión. De este comportamiento dependiente
de la temperatura de la muestra puede inferirse que la agregación
de las moléculas tiene lugar al enfriarse. También es importante
señalar que la curcumina disuelta en otros disolventes obedece a
la ley de Lambert-Beer, lo que sugiere la ausencia de agregación
de moléculas; sin embargo, en el agua, la espectroscopia de
curcumina no cumple con la ley.
Además, para comprender mejor el comportamiento de
absorción único demostrado por primera vez en este estudio sobre
la curcumina en el agua (la aparición de tres picos agudos) se
llevó a cabo un estudio detallado de la absorción de UV-vis
dependiente de la temperatura para estudiar la influencia del
cambio en el entorno dieléctrico comparando tres porcentajes de
composición diferentes de la mezcla de disolventes: (1) 50% de
metanol, (2) 20% de metanol y (3) 10% de metanol en agua. En
cada caso, la cantidad de curcumina se mantuvo igual. Los
espectros de absorción de estas tres muestras con ambiente
dieléctrico variado se muestran en la Figura 3, donde, en
contraste con los espectros de absorción mostrados en la Figura
1A, al 50% de mezcla de metanol y agua (panel superior), el pico
principal está situado en 420 nm seguido de un hombro bastante
débil alrededor de 350 nm. Sin embargo, a medida que aumenta
el porcentaje de agua, se observa que la intensidad del pico de
absorción a 350 nm aumenta, reduciendo la relación de la
intensidad máxima a 420 y 350 nm a medida que aumenta la
temperatura (compárese con la Figura 1A). Un análisis adicional
muestra que el pico que se observó a 345 nm en agua pura a
mayor temperatura (Figura 1A) ahora se desplaza a alrededor de
350 nm para las mezclas de agua y metanol, de acuerdo con el
hecho de que la mezcla es menos polar que el agua. Aunque la
presencia de metanol en agua reduce la energía de solvatación
necesaria para que la curcumina se disuelva en la mezcla, las
moléculas de agua que son altamente miscibles con metanol
forman fácilmente fuertes enlaces H con metanol y por lo tanto
no reduce la energía requerida para π-π * transición que resulta
en el cambio azul. Esto implica que el pico observado en el agua
alrededor de 345 nm se debe únicamente al cambio en el entorno
dieléctrico, donde la estructura de la molécula de curcumina en
ese estado da lugar a esta firma.
En la Figura 4, el espectro de fotoluminiscencia a
temperatura ambiente tomado en la curcumina en agua se
compara con la curcumina en metanol a la longitud de onda de
excitación de 420 nm. En ambos medios, la curcumina muestra
un pico de emisión bastante amplio centrado a alrededor de 540
nm para el metanol y a 550 nm para el agua. Estos resultados
son consistentes con los datos de absorción donde se mostró la
dependencia de la absorción electrónica de curcumina en su
entorno dieléctrico. Además, hay un cambio notable en la forma
de la curva de emisión que puede tener su origen en el cambio en
el perfil de pico de absorción (Figuras 1A y 3) emitiendo de ese
modo a diversas longitudes de onda con diferentes intensidades
para agua y metanol. Un estudio de excitación fotoluminiscente
cuidadoso y deconvolución de los espectros podrá proporcionar
más información sobre la contribución relativa de varios picos de
emisión en los picos anchos como se ve en la figura.
Es bastante desafiante cuantificar exactamente la
solubilidad de la curcumina en agua debido a su escasa
solubilidad y al rango variado de tamaños de los aglomerados, lo
que explica la falta de un informe previo sobre ella. Se dispersó
medio gramo de curcumina en 325 ml de agua y los aglomerados
grandes se filtraron utilizando papel de filtro Whatman (tamaño
de retención> 11 μm) después de calentarlo hasta 95 ° C, donde
gran parte de la curcumina insoluble (en forma de grandes
aglomerados) ) podría filtrarse y el filtrado es una suspensión /
solución amarilla estable en agua. La estabilidad de esta
suspensión se verificó y se encontró estable (sin cambios en la
absorción electrónica) durante más de un mes. En el siguiente
paso, esta suspensión se filtró a 95 ° C usando un filtro de jeringa
de 220 nm para eliminar aglomerados muy pequeños.
La imagen del vial se muestra en el recuadro de la Figura
5I (vial a la izquierda). Cuando se filtra después de enfriar a 25
° C, la mayor parte del color del vial se pierde (vial a la derecha),
lo que indica que, después de volver a enfriar a 25 ° C, una
proporción significativa de moléculas de curcumina (aunque
todavía en suspensión) volver a formar agrupaciones más grandes
que el tamaño de poro del papel de filtro, lo cual es consistente
con nuestra hipótesis anterior basada en el estudio de absorción
que indicó que con la disminución de la temperatura, una gran
parte de las moléculas de curcumina vuelven a su forma estable
de ceto- tautómero de enol-enolato que forma grandes agregados.
Esta es una observación importante, de acuerdo con nuestros
datos de absorción, que revela que a medida que la temperatura
comienza a reducirse, la curcumina se precipita principalmente a
su forma estable de tautómero ceto-enolato-enolato,
recristalizándose en pocas unidades monoméricas. La observación
más intrigante es el hecho de que no toda la curcumina se
precipita inmediatamente. Se observa que, durante más de un
mes, la curcumina en agua permanece estable en suspensión, que
puede usarse para ensayos o aplicaciones adicionales. Por lo
tanto, se observa que la curcumina entra en la fase acuosa y
permanece estable sin el uso de un codisolvente u otros medios
químicos para modificar la molécula y, por lo tanto, afectar su
actividad.
Para una mayor cuantificación, la solubilidad de la
curcumina en el agua después del calentamiento es un término
ambiguo para usar en este estudio. Como se observó y estableció
en las explicaciones anteriores, las pruebas revelan que la
curcumina está más dispersa en el disolvente (agua) que disuelta,
aunque está disponible para reacciones bioquímicas y acciones
farmacológicas. Además, la cantidad de curcumina en el
disolvente es extremadamente baja incluso después de calentarla
en agua. Establecer la cantidad de curcumina que entra en la
fase de solución con una precisión aceptable es difícil. Eso explica
la falta de cualquier trabajo relacionado con la investigación
sobre curcumina solo en agua hasta ahora en la literatura,
excepto un estudio donde los investigadores han cuantificado
usando el gráfico estándar de concentración de curcumina en
"metanol" para mostrar un aumento de 10 veces de la
concentración de curcumina en agua "Agua" .31 Después de
repetidas pruebas para estimar la cantidad de curcumina que está
en el agua, se encontró que este valor estaba en el rango de 1-10
μg / ml, usando análisis gravimétrico. Sin embargo, dado que la
disminución de la temperatura podría llevar a la molécula a
precipitarse fuera del agua para formar agregados de curcumina
sólida, garantizar el nivel de curcumina en la fase de solución
podría ser errónea. Por lo tanto, no fue posible calcular con
precisión el coeficiente de extinción molar de curcumina en agua,
como se informó en algunos estudios previos; se forman agregados
y, por lo tanto, la ley de Lambert-Beer no se puede aplicar.
Además, para dienos conjugados, εmax no puede predecirse con
exactitud.
Además, para determinar la estabilidad de la curcumina en
agua, se usaron espectroscopía UV-vis, espectroscopía FTIR,
espectroscopía de RMN y técnicas de HPLC. La muestra acuosa
de curcumina después del calentamiento se filtró a través de un
papel de filtro Whatman (tamaño de retención> 11 μm) para
obtener un sol homogéneo, que se secó adicionalmente para
eliminar el agua y se redispersó en el disolvente deseado para
todas las técnicas.
 La Figura 2, donde se compararon los espectros de
absorción de curcumina en agua después de repetidos ciclos de
calentamiento, indicó la robustez de la curcumina. Para verificar
adicionalmente su estabilidad térmica, en la Figura 6, el espectro
de absorción UV visible de la curcumina disuelta a temperatura
ambiente en metanol se compara con el de la curcumina disuelta
en metanol después de hervirlo en agua, secarlo y resuspender
este polvo tratado térmicamente en metanol No se observó
ningún cambio en los espectros de absorción (aparte del pequeño
cambio en la intensidad). Para tener una mirada más cercana a
cualquier cambio en la naturaleza química de la curcumina
tratada con calor, se realizó una espectroscopía de RMN en la
curcumina tratada térmicamente disuelta en metanol deuterado.
En la Tabla 1, los espectros de RMN de curcumina en metanol
deuterado se comparan con curcumina tratada térmicamente en
metanol deuterado, lo que confirma que no hay cambios en la
estructura química de la curcumina, incluso después de hervir en
agua durante un tiempo prolongado. Finalmente, para confirmar
cualquier degradación parcial en curcumina, se realizó HPLC en
curcumina tal como se recibió y curcumina tratada
térmicamente. Los resultados se comparan en la Figura 7. El
análisis por HPLC de curcumina tal como se recibió en metanol
muestra un pico en el tiempo de retención de 4,3 minutos, que
corresponde a la curcumina (Figura 7A) .37 Además, hay un pico
insignificante alrededor de 3,75 minutos que corresponde a
bisdemetoxicurcumina (2) (1E, 6E) -1,7-bis (4-hidroxifenil)
hepta-1,6-dieno-3,5-diona) (vista ampliada). La
bisdemetoxicurcumina es otro curcuminoide presente en la
cúrcuma cuya estructura es similar a la de la curcumina (1).
Debido a que estos dos curcuminoides son igualmente
importantes para las aplicaciones terapéuticas, incluso la
presencia de una cantidad traza de bisdemetoxicurcumina junto
con curcumina no es indeseable y a menudo inevitable incluso
después de la purificación.30 El análisis de HPLC de la
curcumina tratada térmicamente (Figura 7B) muestra que la
curcumina no se ha sometido a ningún cambio químico o
degradación debido al tratamiento térmico. Sin embargo, la
intensidad del pico correspondiente a bisdemetoxicurcumina se
mejora poco, lo que puede explicarse por la ausencia de un grupo
metoxi no polar en la molécula. La ausencia de grupo metoxi no
polar en esta molécula aumenta su disponibilidad en agua polar
en comparación con la curcumina, que tiene dos grupos metoxi.