Metodos de conservación :

A largo plazo
 Detiene el crecimiento celular
 No hay muertes celulares considerables
 Garantiza estabilidad genética

Alternativos
 Asegura viabilidad

VENTAJAS DESVENTAJAS
LIOFILIZACION Largo tiempo de Mayor costo
conservacion
Se puede mantener a
temp. Ambiente

CRIOPRESERVACION (- Largo tiempo de Controlar disminusion

70°C) conservacion de temperatura
CULTIVO BAJO ACEITE Mayor probabilidad de
MINERAL contaminacion.
No garantiza pureza
El hongo puede seguir
creciendo en
condiciones
desfavorables
PAPEL DE FILTRO Sencillo Tiempo de
conservacion 2 años
aprox

Parametros a controlar:

 Esterilidad de los medios utilizados

 Viabilidad del m.o
 Caracteristicas macro y microscopicas
 Pureza

Esterilidad:
Realizar blancos para verificar la esterilidad del medio de cultivo
Viabilidad:
Transferir 0,5 ml de inóculo a 4,5 ml de medio líquido y se preparan diluciones
seriadas, luego se transfieren 10 µl de cada dilución a una placa del medio de cultivo.

Calcular % de sobrevida.

Pureza:
Sobre las placas de viabilidad verificar por medio visual la morfologia macroscopica del
m.o. Tambien por microscopio.

Reaislar en un medio no selectivo

Caracteristicas macro y microscopicas

ESQUEMA SEMANA 1

DIA 1: Busqueda bibliografica

Reaislamiento de cepa y produccion de esporas

DIA 2 : Preparar soluciones para los metodos seleccionados(tween 80,

leche descremada, glicerol) y material para esterilidad

Realizar suspension de esporas (prueba)

DIA 3 :
Preparacion de suspension 50 – 100 esporas/mL

Escala Mac Farland 0,5 – 1,5 108 ufc/mL

Preparación del Agente Protector para Liofilizacion: Leche descremada

Se prepara al 20% p/v, se fracciona en volúmenes de 10 ml y se esteriliza en

autoclave a 116º C por 15 minutos. Es importante evitar la caramelización del
medio. Los tubos se conservan en heladera. Es necesario realizar controles de
esterilidad del lote antes de su utilización.

Preparación de la suspensión para liofilizar

Las esporas de los hongos se recogen con un ansa y se resuspenden en agua

destilada estéril (108 cel/ml aprox ). Las suspensiones se mezclan con un
volumen igual de leche 20% p/v. La concentración final para liofilizar es al 10%
(10 agua , 10 leche )

Llenado de ampollas y liofilización

Con una pipeta Pasteur aséptica se dispensan 0.1-0.2 mL aproximadamentede

la suspensión de trabajo dentro de la ampolla estéril, cuidando de no
contaminar las paredes ni la entrada del envase. Cubra cada ampolleta con
una tapa de gasa/lino estéril y colóquelas en el set (bandejas) del equipo.
Asegúrese de controlar y registrar todo el proceso (congelación, secado
primario y secado secundario). Siga las instrucciones de uso del fabricante.

Almacenamiento

Para garantizar la estabilidad del liofilizado es preferible conservar los

liofilizados entre 0 y 5° C, en oscuridad.

Recuperación del cultivo

Para la recuperación de los cultivos de hongos miceliales se agrega 0,5 ml de

agua destilada estéril, se deja 15 minutos aproximadamente, se mezcla y se
siembra en los medios de cultivo correspondientes.

Criopreservación a – 70°C.
Preparación de los crioviales para conservación de las suspensiones
Se utilizan crioviales de 2 ml con tapa a rosca externa y o-ring, con faldón,
estériles.

Preparación del Agente Protector

se utiliza 10% (v/v) de glicerol con 0,1% (v/v) de tween 80 para evitar que las
esporas queden en la superficie del liquido.
Las soluciones de glicerol se preparan y se esterilizan en autoclave 15 min. a
121ºC., con la tapa floja, se ajusta la tapa al retirar del autoclave, se dejan
enfriar a temperatura ambiente y se fraccionan en esterilidad según el
procedimiento que se va a utilizar para realizar la suspensión del cultivo a
conservar.
• 15 ml de en tubos de 20 x 150 mm con tapa a rosca ( hasta 3/4 de su
volumen total) o
• 1,8 ml en los crioviales de 2ml.

Preparación de la suspensión y almacenamiento

Para resuspender las esporas de los hongos se realiza el agregado de la

solución estéril de glicerol al tubo con el cultivo, suave raspado de la superficie
del cultivo con la misma pipeta a fin de de obtener una suspensión densa de
esporas y fragmentos de micelio, evitando arrastrar medio de cultivo. Luego se
transfiere esta suspensión a envases estériles con tapa a rosca (frasco o vial) y
se ajustan fuertemente las tapas.

La concentración final de los microorganismos debe ser 108 cel/ml aprox.

La suspensión se deja 24 hs. en heladera, luego 24 hs. a –20 ºC y por último a

–70 ºC/-80.

Recuperación del cultivo

Para su recuperación el vial se descongela rápidamente en baño
termostatizado entre 30-37ºC, cuidando que permanezca frío (4ºC). Se
transfirieren 100 ul de la suspensión sobre un tubo en pico de flauta o una
placa del medio de cultivo recomendado anteriormente y se incuba en las
condiciones optimas de cultivo para esa especie microbiana.

El vial se conservar en la heladera hasta que se obtenga desarrollo de la cepa.

Si la cepa no crece, se agregar al vial 1ml de extracto de malta al 3%, se agita
bien con vortex, se trasvasa a un frasco con 30 ml del mismo medio de cultivo
y se incubar en agitación a 26 ± 2ºC durante 24-72 horas o hasta que se
observa una cantidad suficiente de desarrollo si es un hongo micelial.

Observación: una vez descongelada la suspensión puede conservarse en la

heladera y utilizarse hasta su agotamiento. No se puede volver a congelar.

Desecación en papel de filtro.

El empleo de un soporte de papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) para
el mantenimiento de células en condiciones de ausencia de agua es un
procedimiento adecuado y sencillo, para conservar cepas. La técnica consiste
en embeber tiras de papel filtro con una suspensión densa de organismos en
suero, en glutamato de sodio o en otro agente. Las tiras de papel son
posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado

Cultivo bajo aceite mineral