Metode spectrale de analiză a

alimentelor
 Metodele spectroscopice de investigare a calitatii alimentelor

Moleculele unei substante sunt sisteme cuantice aflate intr-o anumita stare energetica. Ca
particula cuantica unei molecule i se poate asocia o functie de unda Ψ (numita Hamiltonian) cu
care se poate descrie starea energetica a acesteia utilizand Ecuatia lui Schroedinger (Atkins, 1998):
-h2δ2 Ψ(x)/2m δ2(x) + V(x) Ψ(x) = E Ψ(x)

Pe baza aproximatiei Born-Oppenheimer rezolvarea se poate simplifica si solutiile ecuatiei

pot fi separate pe nivele energetice corespunzatoare nucleului, electronilor, miscarii vibrationale
si rotationale:
Ψ tot = Ψnucl + Ψel + Ψvibr + Ψrot

Prin absorbtia sau emisia de energie moleculele pot suferi tranzitii intre diferite nivele
energetice. In functie de cantitatea de energie necesara tranzitiilor acestea sunt de patru tipuri (in
ordinea descresterii energiei): tranzitii nucleare, tranzitii electronice, tranzitii vibrationale si
tranzitii rotationale ().

ΔE mol = ΔEnucl + ΔEel + ΔEvibr + ΔErot

ΔE nucl > ΔEel > ΔEvibr > ΔErot

Aceasta separare a energiilor este un rezultat al aproximatiei Born-Oppenheimer asupra

solutiilor ecuatiei Schroedinger pentru sisteme cuantice polinucleare.

Investigarea acestor tranzitii se face prin metode spectroscopice. De interes pentru analiza
calitatii alimentelor sunt metodele spectroscopice care investigheaza tranzitiile electronice,
vibrationale si rotationale ale moleculelor ce intra in componenta alimentelor.

O prezentare sistematica a metodele spectroscopice simple si combinate folosite in studiul

alimentelor este redata in Tabelul 1
Nr. Informatia Metoda Starea si cantitatea Observatii
Crt. oferita spectroscopica probei de analizat
(abrevieri)
1. Analiza Emisie, absorbtie Solutie; de ordinul µg Necesita aducerea probei in
atomica in flacara, arc
elementara sau mg, functie de metal solutie prin
electric, plasma
dezagragare;cantitatea de
(FAAS, GFAAS, ICP- Solutie; ng sau/pana la
proba (solutie)este cu atat mai
AES) µg
mare cu cat se vor analiza mai
multe elemente si
Emisie in plasma Solid, maruntita foarte
concentratia lor este mai
cuplata cu fin;mg.
redusa (doar la FAAS);
Spectrometrie de masa
folosite indeosebi la analiza
(ICP- MS)

Fluorescenta de raze X
2. Analiza Absorbtia in : Solid, maruntita foarte Folosita indeosebi pentru
chimica fin;mg. analiza elemetelor cu masa
-ultraviolet si vizibil
complexa (a atomica mare.
(UV-VIS) Solid sau lichid,
substantelor
extracte, uneori si gaz; Substantele colorate (VIS)
componente
-IR (MIR)
mg-g sau cu absorbtie caracteristica
cat si a
-NIR in UV. Se pot aplica pe
structurii
Solid, lichid,
probele native sau dupa
acestora -Raman
extracte,cantitati mari,
prelucrarea acestora;se pot
de ordinul g
-Rezonanta magnetica combina cu metodele
nucleara (RMN) cromatografice.
Extracte solide sau
lichide;
-Sp.de masa Indeosebi in medii neapoase,
ng-μg-mg probe native sau prelucrate,
- Sp. de masa cuplata posibiliate de cuplare cu
cu cromatografia de metodele cromatografice;
informatii asupra
gaz (GC-MS) sau
configuratiei proteinelor si
lichide (LC-MS) polizaharidelor.
 Se poate utiliza materialul in
stare nativa; rezultate mai
bune la analiza in stare.
Separare izotopica a
elementelor usoare,
identificare structurii
chimice, determinari de
cantitati foarte mici, de
ordinul ng (10-9g) sau pg
(10-12g)

3. Analiza -RMN Calcularea raporturilor

starilor cristaline/amorfe,
starii fizice -RES (Rezonanta vascozitate, starea
electronica de spin) dielectrica,conformatia
moleculelor de polizaharide
- IR(MIR) si proteine.

-Dicroism circular Analiza conformationala a

(DC) proteinelor, determinarea
cantitativa a glucidelor si
altor substante optic active.

Tabel 1.Metodele spectroscopice simple si combinate folosite in Studiul alimentelor

1.1. Radiatiile electromagnetice

Radiatiile electromagnetice pot interactiona cu substantele prin fenomene de absorbtie,

dispersie, reflexie si difractie. La randul lor substantele aduse in anumite conditii energetice pot
emite radiatii electromagnetice.
Fenomenele de absorbtie si emisie a luminii sunt insusiri caracteristice materiei, respectiv
atomilor si moleculelor.
Pe baza lor se poate realiza atat analiza calitativa a unor elemente sau substante prezente
in alimente in diferite cantitati cat si analiza cantitativa a acestora.
Radiatia electromagnetica este caracterizata de lungimea de unda (λ), a carei
marime delimiteaza domeniile spectrale de interes in metodele spectroscopice de analiza (Tabelul
2).

Pe langa notiunea lungime de unda (λ), se utilizeaza si notiunea de numar de unda (ν*),
care este proportional cu energia radiatiei, intre ele existand relatia

ν* = 1/ λ = ν/c, c fiind viteza luminii in vid (3.108 m/s)

sau ν*( cm-1) = 10 000/ λmm

respectiv λ (mm) = (1/ ν* cm-1) ´ 10000

ν* se exprima in cm-1 si 1 cm-1 = 2,8564 cal/mol

 Tabel 2. Domeniile spectrale de interes in spectroscopie (Skoog, D.A., Leary J.J., 1996,
p. 63; Stefanescu M., 1998 p. 110 )

Regiunea spectrala Lungimea de unda (numar de unda) Tranzitia

Raze X < 200 nm Ruperea legaturilor

(< 0,2 mm) dintre atomi

UV/Visibil 200-800 nm Electronica, la nivelul legaturii interatomice

(0,2-0,8 mm) ( molecular)

Infrarosu (IR) 0,78-1000 mm Vibrationala, la nivel molecular

Apropiat (NIR) 0,78-2,5 mm (12 800-4000cm-1)

Mediu (MIR) 2,5-25 mm(4000-400 cm-1 )

Indepartat (FIR) 25-1000mm (400-10 cm-1)

Domeniul uzual 2,5-15 mm (4000-670 cm-1 )
Microunde > 1000 mm MW < 1 m Rotationala, la nivel molecular
Radiofrecventa 1-5 m RMN/RES, in camp magnetic

Realizarea si analiza fenomenelor spectroscopice se face cu ajutorul spectrometrului.

Procesele de baza ce stau la baza unui spectrometru sunt (Wilson R.H., 1994, p.2):

a- excitarea

b- colectarea si ordonarea
 c- detectarea

Ordinea acestora poate diferi, functie de echipament, dar intotdeauna procesul de excitare
a substantei este inaintea procesului de detectare a efectului

Excitarea

In timpul acestui proces are loc cresterea starii energetice a probei, care se poate realiza
prin diferite tehnici, specifice fiecarei metode spectroscopice.

In spectroscopia de emisie cresterea starii energetice a probei se poate realiza pe cale

termica (incalzire, flacara, arc electric, plasma), in spectroscopia de masa excitarea energetica se
realizeaza prin bombardarea cu electroni sau atomi usori, in spectroscopia RMN pulsatorie
excitarea se realizeaza prin iradiere, similar cu luminescenta, dar la alte energii ale radiatiilor.

Cresterea starii energetice prin absorbtia cuantificata a radiatiilor electromagnetice ce

iradiaza proba sta la baza metodele spectroscopice de absorbtie in domeniile UV, VIS, IR, RMN,
RES.

Un alt mod de excitare a probei are la baza comportarea radiatiei ca particula. Fotonul in
ciocnirea sa cu moleculele sau atomii substantelor din proba sufera fenomenul de imprastiere.

In urma acestei interactiuni neelastice (energia cinetica transformandu-se in alte forme de

energie) a fotonului cu atomii sau moleculele probei are loc modificarea frecventei fotonului cat
si starea energetica a substantelor din proba.

Fenomenul este folosit in spectroscopia Raman, oferind informatii pretioase asupra

structurii moleculare (complementare spectroscopiei in IR).

Colectarea si ordonarea

Procesul de colectare si ordonare a informatiilor spectrale rezultate in urma procesului

anterior poate fi considerat ca “inima” spectroscopiei (Wilson R.H., 1994, p.3).
 Aceste informatii sunt colectate intr-un spectru, care reprezinta o ordonare a fotonilor sau
altor particule dupa energie.

Exprimarea energiei se poate face sub forma de lungime de unda (λ), numar de unda (ν*),
frecventa (ν), raportul m/z sau alte forme, in functie de metoda spectroscopica.

Fig 1. Schema de principiu a obtinerii unui spectru de absorbtie

Ca tehnica de lucru intr-un spectrometru, colectarea si ordonarea datelor energetice se

poate realiza prin doua metode: metoda masurarilor secventiale si metoda masuratorilor multiplex.

Masuratorile secventiale constau in masurarea si colectarea secventiala a informatiilor

energetice. Ele au fost folosite la primele aparate si sunt mai avantajoase atunci cand se masoara
energii relativ mari, pana in domeniul vizibil.

Astazi aceasta tehnica este folosita indeosebi in spectrometrele dispersive, in domeniile

UV, VIS.
 Masuratorile multiplex constau in masurarea simultana a tuturor semnalelor spectrale si se
pot aplica benefic doar atunci cand semnalul de zgomot este independent de semnalul analitului,
ceea ce se intampla indeosebi la energii mici, in domeniul IR, RMN. In cazul acestor masuratori,
pentru obtinerea unui spectru conventional care sa reprezinte ordonarea particulelor dupa energie
(Intensitate versus frecventa) este necesara prelucrarea datelor printr-o operatie matematica
cunoscuta sub numele de transformarea Fourier.

Detectarea

Detectarea informatiilor energetice rezultate in urma proceselor de excitare a sistemelor

cuantice reprezentate de proba se realizeaza cu diferiti detectori, specifici fiecarui tip de
spectrometrie. Cerintele impuse acestora se refera indeosebi la reproductibilitatea
si constanta (liniaritatea) raspunsului in domeniul energetic de lucru.

1.3. Spectroscopia tranzitiilor vibrationale moleculare

Tranzitiile vibrationale moleculare de pe starea fundamentala pe prima stare energetica

excitata corespund domeniului radiatiilor infrarosii medii (MIR), cu lungimi de unda cuprinse intre
2,5-25 mm. Overtonurile (tranzitiile de pe starea energetica fundamentala pe stari energetice
superioare) cat si combinatiile modurilor vibrationale se situeaza in infrarosul apropiat (NIR) cu
lungimi de unda cuprinse intre 0,8-2,5 mm iar infrarosul indepartat cu lungimi de unda cuprinse
intre 25-1000 mm corespunde miscarii scheletului polimeric sau a miscarilor de rotatie.
Corespondenta cu energia nivelelor vibrationale exprimata prin numarul de unda se poate vedea
in Tabelul 2.

In cazul oscilatorului armonic ideal overtonurile si combinatiile nu ar trebui sa apara in

spectrul IR. Teoretic aceste absorbtii sunt interzise de regulile de selectie ale mecanicii cuantice.
In mod practic insa aceste aborbtii apar, datorita anarmonicitatii sau rezonantei Fermi dar au
intensitati slabe. Daca nu ar fi posibila aparitia acestor absorbtii nu ar exista spectroscopia NIR,
deoarece toate frecventele fundamentale de vibratie se situeaza in domeniul MIR al spectrului
infrarosu. Intensitatea overtonurilor scade drastic o data cu cresterea ordinului acestora. Vibratiile
cu frecvente inalte (vibratiile legaturii O-H de exemplu) deoarece au putine overtonuri au si
intensitati ridicate ale acestora an regiunea NIR a spectrului infrarosu. Pe langa legatura O-H si
celelalte legaturi ale hidrogenului cu nemetale C-H, N-H, P-H, S-H, cat si legatura C=O, datorita
anarmonicitatii pronuntate si numarului redus de overtonuri, prezinta absorbtii puternice inacest
domeniu spectral.

Cele mai deosebite aplicatii din ultimii 80 de ani in analiza alimentelor au fost realizate in
domeniul NIR al radiatiilor infrarosii (Wilson, p.13). Prin aceasta metoda se poate realiza
determinarea concomitenta a continutului in apa, proteina, glucide, lipide si cenusa la un numar
mare de alimente sau produse agricole prelucrate sau materie prima, la produsul finit sau pe fluxul
tehnologic. Fata de radiatiile din domeniul mijlociu al infrarosului acestea au avantajul de a
penetra mai adanc in produsele analizate oferind informatii asupra compozitiei acestora. Ea nu este
o metoda de mare sensibilitate dar ofera avantajul analizei nondestructive fara o modificare a
formei materialelor analizate. Domeniul mijlociu al radiatiilor infrarosii (MID) are aplicatii
importante indeosebi in determinarea structurii moleculare. Mai recent insa au inceput sa apara
studii si asupra posibilitatilor de analiza a anumitor componente, indeosebi a apei din alimente ().

Spectroscopia Raman se bazeaza pe ciocnirea neelastica a fotonilor cu moleculele si are

frecventele de vibratie tot in domeniul IR. Desi initial s-a utilizat doar la studiul structurii
moleculare, fiind complementara spectroscopiei IR, a inceput sa fie folosita si in studiul
alimentelor. In spectrul IR apar doar frecventele vibratiilor care produc o variatie a momentului de
dipol molecular, manifestandu-se indeosebi legaturile polare (C-H, C=O, C-N, O-H, N-H, C-X ),
pe cand in spetrul Raman apar frecventele vibratiilor care produc o variatie a polarizabilitatii
moleculare, putandu-se manifesta indeosebi legaturile simetrice nepolare (C-C, C=C). Semnalul
apei fiind foarte slab in spectrul Raman permite determinarea altor componenti la continuturi foarte
variate in apa a alimentelor.

Spectrometria in domeniul spectral infrarosu (IR)

Spectrometriei in domeniul infrarosu al spectrului radiatiilor electromagnetice ii

corespunde spectroscopia vibrationala si rotationala. Atat din punct de vedere al aplicatiilor,
dinamici moleculare cat si al echipamentelor folosite, acest domeniu se poate subimpati in trei:
- infrarosul apropiat (near infrared, NIR) caruia ii corespunde intervalul 0,78-2,5 mm (12 800-
4000cm-1), corespunzator overtonurilor si combinatiilor frecventelor de vibratie din domeniul
infrarosului mijlociu.

- infrarosu mijlociu (mid infrared, MIR) caruia ii corespunde intervalul 2,5-25

mm(4000-400 cm-1 ) de lungimi de unda si este specific miscarii vibrationale a moleculei;

- infrarosul indepartat (far infrared, FIR) caruia ii corespunde intervalul 25-1000mm (400-10 cm-
1
) de lungimi de unda si este specific miscarii rotationale a moleculelor.

1.3.2. Domeniul infrarosului mijlociu (MIR)

Fiecare legatura chimica dintr-un compus absoarbe in mod caracteristic in acest domeniu,
intensitatea si frecventa absorbtiei depinzand de intreaga structura moleculara. Astfel spectrul in
IR poate fi considerat o autentica amprenta a fiecarei substante, neexistand doua substante cu
acelasi spectru IR. Deoarece fiecare legatura chimica poate vibra in moduri diferite, figura 11
(alungire, deformare, rasucire, etc.), unei legaturi chimice pot sa-i corespunda mai multe frecvente
in spectrul IR. Pentru ca o vibratie sa fie IR activa, ea trebuie sa produca o deformare
a momentului de dipol molecular, ceea ce are loc indeosebi la legaturile polare, care prezinta
absorbtii puternice in IR. Vibratiile legaturilor nepolare cat si vibratiile simetrice nu sunt IR active,
adica acestea nu apar in spectrul IR, ele prezentand insa absorbtii in spectrul Raman. Cei mai
importanti factori moleculari care determina intensitatea si frecventa absorbtiei sunt ordinul de
legatura si tipul atomilor ce formeaza legatura. Conjugarea sau atomii invecinati pot insa influenta
intr-o oarecare masura pozitia si intensitatea absorbtiei. Astfel este posibila atribuirea unui
domeniu de frecvente pentru diferite grupari functionale, aflate in molecule diferite. Aceste
informatii sunt prezentate in tabele de absorbtie IR.In aceste tabele pentru exprimarea intensitatii
absorbtiei se folosesc urmatoarele prescurtari (provenite din limba engleza): s (puternic-strong),
m (mediu-medium), w (slab-weak), br (larg-broad), sh(umar-should).
Vibratii de alungire (intindere) a legaturilor

simetrice asimetrice

Vibratii de deformare unghiulara

Pendulare simetrica in plan Pendulare asimetrica in plan

(forfecare)

Pendulare simetrica Pendulare asimetrica

in afara planului

in afara planului (basculare) (rasucire)

Fig 2.Cateva tipuri de vibratii ale legaturilor (Skoog, p.277)

Tabelul 3. Gruparile functionale si absorbtiile in MIR

Grup functional Numar de unda (cm-1)/ Intensitate

tip de vibratie
Alcani, grparile alchil 3000-2840, stretch Mediu-puternic

-C-H ~1465, bend Mediu-puternic

-CH2 ~ 1375, bend Mediu-puternic

-CH3
Alchene 3095-3010, stretch Mediu-puternic

=C-H 100-650, bend (oop) Mediu-puternic

=C-H 1660-1600, bend Mediu-puternic

C=C
Alchine 3300, stretch Puternic

sC-H 650-600, bend Puternic

sC-H 2150, stretch Medium

-CsC-
Halogenuri de alchil 1400-1000,stretch Puternic

C-F 785-540, stretch Puternic

C-Cl 650-510, stretch Puternic

C-Br 600-485, stretch Puternic

C-I

Alcoli 3400-3300, stretch Puternic

O-H 1440-1220, bend Larg- slab

C-O-H 1260-1000, stretch Medium

C-O
Aromatic 3050-3010, stretch Medium

=C-H 900-690, bend (oop) Slab- medium

=C-H 1600-1475, bend Mediu-puternic

C=C 2000-1667, overtones slab

Eteri 1300-1000,stretch Puternic

C-O
Aldehide 1740-1725, stretch Puternic

C=O 1700-1680, stretch Medium

C=O + α or β C=C 1700-1660, stretch Puternic

Ar-CH=O
Cetone 1720-1708, stretch Puternic

C=O 1700-1675, stretch Puternic

C=O + α or β C=C 1700-1680, stretch Puternic

Ar-CR=O Medium

C=O

1300-1100, bend
Amine 3500-3300, stretch Medium

N-H 1640-1560, bend in Medium

1s amines, 1500 for
N-H Medium
2s amines

C-N slab - Medium

1350-1000, stretch
Amide 1680-1630, stretch Puternic

C=O 3350-3180, stretch-2 bands Puternic

for 1s
N-H Puternic
3300, stretch-1 band for 2s
N-H Puternic
1640-1550, bend
Acizi carboxilici 3400-2400, stretch Puternic, f. larg

O-H 1730-1700, stretch Puternic-larg

C=O 1320-1210, bend Medium

C-O
Esteri 1750-1735, stretch Puternic

C=O 1740-1715, stretch Puternic

C=O + α or β C=C 1740-1715, stretch Puternic

 Ar-COR=O 1300-1400, stretch Mediu-puternic

C-O
Cloruri acide 1810-1775, stretch - Puternic
unconjugated
C=O Puternic
1780-1760, stretch-
C-Cl Puternic
conjugated

730-550, stretch
Anhidride 1830-1800 & 1775-1740, Variabil
stretch
C=O Puternic-larg
1300-900, stretch (multiple)
C-O
Nitrili 2250, stretch Medium

CsN
Nitro compusi 1600-1530, asymmetric Puternic
stretch
NO2 Medium
1390-1300, symmetric
stretch

La modul general un spectru IR poate fi impartit in doua regiuni:

1. Regiunea peste 2000 cm-1, ce contine relativ putine picuri (absorbtii) dar de intensitate mare
si caracteristice legaturilor C-H, N-H, O-H din diferite grupari functionale.

2. Regiunea sub 2000 cm-1, ce contine un numar mare de picuri, de intensitati variabile si care
se mai numeste siregiunea de amprenta (fingerprint) deorece este caracteristica fiecarei
substante .
 In aceasta regiune absoarbe foarte puternic, la cca. 1700 cm-1 gruparea carbonil si la cca. 1200
cm-1 legatura C-O (uzual 2 picuri).

1.3.3. Spectrometria FT-IR (spectrometria in IR cu transformata Fourier)

La modul general un spectru de absorbtie al unei substante reprezinta reprezentarea grafica

a variatiei intensitatii energiei absorbite (exprimata prin absorbanta sau transmisie) functie de
lungimea de unda (Figura 12).

Fig 3. Specrul IR al unei probe de PVC (a-absorbanta, b-transmisie)

Tehnicile spectrometrice clasice in IR se bazau pe metoda dispersiva (Figura 13), in care

radiatia continua a sursei era separata in componente cu ajutorul unei prisme sau retea de difractie
(monocromatorul). La spectrometrele in IR clasice, dispersive, la care sursa deobicei are o
intensitate mai redusa, monocromatorul se afla inainte de detector, pentru ca prin proba sa treaca
o cantitate cat mai mare de energie (radiatie). Datorita dezavantajelor prezentate de aceasta
metoda, constand indeosebi in timpul lung necesar inregistrarii spectrului, raportului scazut intre
semnal/zgomot, s-a dezvoltat tehnologia masurarii simultate a frecventelor pe baza codarii cu
ajutorul interferometrului. Prin aceasta timpul de inregistare s-a redus de la citeva minute la
secunde sau chiar mai putin de o secunda. Intr-un spectrometru FTIR se inregistreaza
interferograma semnalului probei care masoara simultan toate frecventele absorbite.
Interferograma digitizata este preluata de un computer unde este decodata prin aplicarea functiilor
Fourier, reultand in final un spectru obisnuit.

Fig 4. Spectrometrul dispersiv cu dublu fascicul

 Fig 5.Schema de principiu a unui Spectrometrul FT IR (Brian C. Smith,
Fundamentals of Fourier Transform Infrared spectroscopy, CRC press, Boca Raton, 1996.)
si spectrometrul FTIR S 8400 Shimadzu pe care au fost realizate masuratorile.

Interferometrul utilizeaza un separator de radiatie (beam spliter) care desface radiatia

incidenta in doua. Una din ele este refelctata de o oglinda plana fixa iar cealalta este reflectata de
asemenea de o oglinda plana care insa se misca pe o distanta de cativa mm fata de cealalta. Cele
doua radiatii reflectate de oglinzile respective se recombina rezultand o interferograma. Aceasta
are codate toate frecventele radiatiei incidente. Interferograma poate fi reflectata sau absorbita de
proba cand frecventele caracteristice, continute codat in interferograma, sunt absorbite de vibratiile
caracteristice grupului functional al moleculei din proba. Rezulta astfel un semnal in IR
caracteristic, unic pentru proba respectiva. Acest semnal este masurat de detector, dar el nu poate
fi prelucrat direct ci este necesara decodarea lui prin aplicarea tehnicii matematice cunoscuta ca
Transformarea Fourier (FT). Aceasta decodare necesitand calcule laborioase se realizeaza cu
ajutorul computerului rezultand in final un spectru normal.