Licenta

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
LUCRARE DE LICENȚĂ
Stabilirea profilurilor fenotipice de

rezistență și virulență la tulpini clinice de
Staphilococcus aureus și Pseudomonas
aeruginosa
Coordonator științific: Prof. dr. Carmen Chifiriuc

Îndrumător științific: Paulina Podgoreanu
Absolvent:
Buia Ruxandra Mihaela
2018
Cuprins
INTRODUCERE........................................................................................................................... 3
Capitolul 1- Mecanisme de patogenitate și virulență................................................................. 4
1.1 Definiții ............................................................................................................................... 4
1.2 Genele ce codifică patogenitatea. Evoluţia bacteriilor patogene ........................................ 5
1.3 Factorii de virulență ............................................................................................................ 6
1.3.1 Patogenitatea cocilor Gram pozitivi de importanță medicală. Staphylococcus

aures................................................................................................................................................ 9
1.3.1.1 Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia infecțioasă umană ....... 11
1.3.2 Patogenitatea cocilor Gram negativi de importanță medicală. Pseudomonas

aeruginosa..................................................................................................................................... 13
1.3.2.1 Implicațiile speciei Pseudomonas aeruginosa în patologia umană ................... 15
Capitolul 2- Rezistența microorganismelor la substanțe antimicrobiene .............................. 17
2.1 Rezistența naturală la antibiotice ...................................................................................... 17
2.2 Rezistența dobândită ......................................................................................................... 18
2.2.1 Rezistența dobândită prin mutații .............................................................................. 19
2.2.2 Rezistența dobândită prin transferul orizontal de gene .............................................. 21
2.3 Mecanismele moleculare ale rezistenței microorganismelor la antibiotice ...................... 22
2.3.1 Inactivarea enzimatică a antibioticelor ..................................................................... 23
2.3.2 Efluxul activ al antibioticelor ................................................................................... 23
2.3.3 Rezistenta prin impermeabilitate .............................................................................. 25
2.3.4 Modificarea mutațională a țintei antibioticului ........................................................ 26
2.3.5 Utilizarea unei căi metabolice accesorii (de ocolire a căii metabolice inhibate) ..... 26
Capitolul 3- Caracterizarea fenotipică a tulpinilor bacteriene utilizate în studiile in vivo .. 27
3.1. Scopul și obiectivele lucrării ............................................................................................ 28
1
3.2. Materiale şi metode .......................................................................................................... 28
3.2.1. Tulpini bacteriene analizate ....................................................................................... 28
3.2.2. Evidenţierea factorilor de virulenţă solubili la tulpinile patogene ............................. 29
3.2.2.1 Evidențierea producerii de lecitinaze şi lipaze................................................... 29
3.2.2.2 Evidențierea producerii de amilază .................................................................... 30
3.2.2.3 Evidențierea producerii de proteaze................................................................... 30
3.2.2.4 Evidențierea producerii de DN-ază .................................................................... 30
3.2.2.5 Hidroliza esculinei .............................................................................................. 31
3.2.2.6 Detectarea producerii de hemolizine ................................................................... 31
3.2.3. Determinarea hidrofobicității invelisului celular bacterian ...................................... 31
3.2.4. Studiul capacităţii de aderenţă la substrat inert ........................................................ 32
3.2.5. Evidenţierea capacitǎții de aderenţǎ la substratul celular - Metoda Cravioto

modificată ..................................................................................................................................... 32
3.2.6. Determinarea capacității de aderență și invazie la substratul celular prin

aprecierea numărului de celule bacteriene viabile ........................................................................ 32
3.2.7. Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice – Metoda

difuzimetrică (Kirby-Bauer) ......................................................................................................... 33
3.2.8. Evidentierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotice. ........................ 33
3.2.8.1. Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat .............................................................. 34
3.2.8.2. Evidențierea fenotipului MLSb inductibil ....................................................... 34
3.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII .................................................................................................. 34
CONCLUZII ............................................................................................................................... 46
Bibliografie .................................................................................................................................. 46
2
INTRODUCERE
La prima vedere mamiferele sunt nişe ecologice ca oricare altele pentru agenții
microbieni. Cu toate acestea, din anumite puncte de vedere sunt nişe dificil de populat
datorită mecanismelor de apărare care au fost modulate de coevoluţia cu bacteriile. Aceste
mecanisme de apărare includ sistemele de eliminare mucociliare (care îndepărtează bacteriile
nelegate de epitelii), rata de turnover a celulelor epiteliale senescente, sistemele imunitare
locale (producerea de imunoglobuline, producerea de muramidaza, sinteza de analogi ai
receptorilor specifici, care se combină cu moleculele de aderenţă ale bacteriilor,
neutralizându-le capacitatea de aderenţă), variaţiile de pH, efectul bactericid al bilei
neconjugate, producerea de proteine care leagă fierul, creând un deficit de fier pentru bacterii
(Chifiriuc şi colab., 2011). Mecanismele şi factorii prin care agenţii patogeni au evoluat
pentru a depăşi aceste bariere de apărare sunt reprezentati de factorii de virulenţă.
Evoluţia rapidă a agenţilor patogeni a permis dezvoltarea la fel de rapidă a rezistenţei
la antibiotice. Rezistenţa este ’’capacitatea unui organism de a supravieţui şi de a se
multiplica în prezenţa unui nivel ridicat al unui agent antimicrobian’’ (Chifiriuc şi colab.,
2007).
Rezistenţa la antibiotice a înregistrat în ultimii ani rate foarte înalte, îngrijorătoare,
generează probleme grave de sănătate, astfel că multe dintre antibioticele existente sunt
ineficiente în prezent în tratarea bolilor infecţioase. În ultimii ani, autorităţile internaţionale
(WHO, ESCMID) au făcut eforturi considerabile pentru a îmbunătăţi capacitatea de
supraveghere a circulaţiei tulpinilor antibiorezistente; în acest scop a fost creată reţeaua
EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) cu sediul în Olanda,
organizaţie care colectează deja date raportate în prezent de către 28 de ţări din Europa.
Această reţea, într-o primă etapă, acumulează date despre rezistenţa la antibiotice (obţinute
printr-o metodă unică de lucru, standardizată după normele CLSI 1999-2014) pe care le
prelucrează şi apoi, într-o a doua etapă, printr-un mecanism de feed-back transmite informaţia
necesară pentru acţiunile din domeniul sănătăţii publice, spitale, pentru clinicieni,
microbiologi, etc. pentru a se putea lua măsurile corespunzătoare referitoare atât la impactul
antibiorezistenţei asupra morbidităţii şi mortalităţii generale, cât şi a costurilor rezultate din
aceste situaţii.
Cele mai recente date din literatură menţionează drept mecanisme cheie implicate în
rezistenţa la antibiotice: evenimentele mutaţionale la nivel cromozomal (sinteza de beta-
lactamaze, de tip ESLB şi carbapenemaze); mecanisme extracromozomale; pompe de eflux
3
de tip ABC şi transportori secundari (implicaţi în eliminarea drogurilor) şi barierele de
permeabilitate (prin pierderea porinelor).
Mutaţiile suferite de agenţii patogeni şi chimioterapia utilizată fără discernământ duc
în timp la fenomene de rezistenţă, ceea ce a impus necesitatea dezvoltării unor noi strategii de
combatere a infectiilor nosocomiale.
Capitolul 1- Mecanisme de patogenitate și virulență
Dintre toate speciile bacteriene existente în natură, doar un mic procent sunt capabile
să producă infecții la organismele superioare. O proprietate esențială a agentului patogen
constă în capacitatea acestuia de a genera un proces infecțios, manifestat în general printr-o
stare de boală. Unele specii sunt considerate obligat patogene deoarece nu se pot multiplica în
afara unei gazde specifice. Bacteriile facultativ patogene sunt adaptate şi la supravieţuirea în
afara gazdelor ( în aer, apă, sol, alimente etc.) și produc infecții mai severe sau mai frecvente
la gazdele compromise imunologicsau doar dacă bacteriile sunt inoculate în doze mari.
Aceste bacterii prezintă proprietăți definitorii și anume patogenitatea și virulența, care au
semnificații distincte. Există însă și bacterii care nu sunt deloc patogene, acestea neavând
capacitatea de a stabili interacții cu organismele superioare (Chifiriuc și colab., 2011).
1.1 Definiții
Patogenitatea (gr. Pathos – boală, suferinţă; gr. Geneia – născut, produs al) reprezintă
proprietatea esenţială a oricărui agent infecţios, defineşte capacitatea lui de a determina, în
mod natural sau în condiţii experimentale, apariţia unui proces infecţios” (Chifiriuc şi colab.,
2011).
Datorită evoluției interacțiilor gazdă-patogen, patogenitatea implică mai multe
proprietăți cum ar fi: pătrunderea și localizarea în țesuturile gazdei, multiplicarea și
producerea de toxine, formarea unui răspuns imun și rezistența la mecanismele de apărare ale
gazdei și producerea de leziuni specifice (Mihăiescu şi colab., 2007). Patogenitatea este un
caracter de specie, astfel există specii care sunt strict patogene, condiționat patogene sau
nepatogene (Chifiriuc și colab., 2011).
Virulenţa (lb.latină virulentus = otrăvitor) se referă la capacitatea unui microorganism
patogen, aflat într-o anumită fază de creştere, de a se localiza, de a coloniza, de a se
multiplica şi, eventual, de a invada celulele şi ţesuturile organismului gazdă şi de a produce
4
toxine, determinând o stare patologică la o anumită gazdă, atunci când este introdusă în
organismul acesteia în condiţii bine definite (Zarnea, 1994).
1.2 Genele ce codifică patogenitatea. Evoluţia bacteriilor patogene

Analiza genetică a arătat că bacteriile patogene se disting de cele nepatogene prin
prezența genelor specifice de patogenitate, care sunt organizate în așa numitele ”insule de
patogenitate”. Acestea reprezintă o clasă distinctă de insule genomice dobândite de
microorganisme prin transferul orizontal de gene (Hacker și Kaper, 2000).
Insulele de patogenitate sunt elemente genetice mobile, acestea integrâdu-se în
genomul gazdei și codificand o gamă variată de factori de virulență, esențiali în evoluția
bacteriilor patogene (Carpenter și colab., 2015).
Bacteriile patogene au în general 1-2 insule de patogenitate, însă există bacterii, cum
ar fi tulpinile de Salmonella sp. care au până la 5 astfel de insule (Chifiriuc si colab., 2011).
Insulele de patogenitate sunt unități genetice discrete, flancate de secvențe repetate
direct, secvențe de inserție sau gene ARNt, care au rol de situsuri de recombinare (Fig.1).
Insulele de patogenitate pot fi considerate regiuni de ADN instabile deoarece sunt
susceptibile la deleție și mobilizare (Hacker și Kaper, 2000).
Fig.1. Structura unei insule de patogenitate-V1-4 (gene de virulență), IS(secvențe de inserție)

Sursa: Chifiriuc și colab., 2011
În studiul evoluției bacteriilor patogene (Fig.2), E. coli este un veritabil exemplu al

polimorfismului bacterian. O varietate de patotipuri de E. coli provoacă boli distincte,
datorită variațiilor genetice dobândite prin transferul pe orizontală al factorilor de virulență.
Fenomenele de transfer și recombinare genetică completează și amplifică arsenalul
structurilor de patogenitate ale unui microorganism. Pe baza acestor fenomene se explică de
ce virulența este un caracter de tulpină. E. coli poate fi astfel considerată ca o specie care
evoluează rapid, capabilă să genereze noi variante patogenice care pot elimina mecanismele
5
de protecție ale gazdei și pot produce manifestări clinice specifice (Donnenberg și Whittam,
2001).
Fig.2 Reprezentarea evoluției bacteriilor comensale prin dobândirea genelor de virulență prin transfer orizontal
mediat de diferite elemente genice mobile, printre care și insulele de patogenitate
Sursa: Chifiriuc și colab., 2011
1.3 Factorii de virulență
Factorii de virulență sunt reprezentați de diferite structuri bacteriene, cu diferite roluri

in medierea virulentei cum ar fi: atașarea de celulele gazdei, și evaziunea și inhibarea
răspunsului imun al gazdei, lezarea țesuturilor, etc. (Chen și colab., 2012). Chen și colab.,
(2012) au demonstrat că există mai multe tipuri de factori de virulență cum ar fi:
a. Adezinele bacteriene sunt componente de suprafață care facilitează aderența, care
reprezintă un pas esențial în patogeneza bacteriană. Adezinele proteice pot fi
filamentoase, de tipul fimbriilor sau pililor (Fig.3) sau proteină de membrană externă.
Adezinele sunt prezente atât la bacteriile patogene , câtși la cele saprofite. Exprimarea
acestor adezine în diferitele faze ale procesului infecțios joacă un rol important în
inițierea procesului infecțios (Klemm și Schembri, 2000).
b. Capsula bacteriană intră în categoria factorilor de virulență, deoarece crește patogenitatea
bacteriană, deoarece conferă protecție față de uscăciune, fagocitoză și liză mediată prin
complement. Capsula este o structură extraparietală în general de natură polizaharidică,
6
și mai rar proteică (capsula de acid D-glutamic la Bacillus anthracis), prezentă atât la
bacteriile Gram-pozitive cât și la cele Gram-negative (Wen și Zhang, 2015).
Fig.3 Rolul adezinelor în colonizarea unui substrat celular

Sursa: https://basicmedicalkey.com/
c. Factorii de invazie (invazinele) permit unei bacterii să pătrundă în celulele gazdei pentru
a facilita traversarea mucoasei și a conferi capacitatea de a ocoli mecanismele de apărare
ale gazdei (Kochut și Dersch, 2013).
d. Endotoxinele sunt cunoscute și sub denumirea de lipopolizaharide, fiind componente
structurale ale membranei externe a bacteriilor Gram-negative. Reprezintă molecule mari
constând dintr-un lipid A (responsabil de activitatea de endotoxină), un miez
oligozaharidic și un polizaharid extern (antigenul O) (implicat în antigenitatea celulei
bacteriene) (Fig.4) (Rietschel și colab., 1994).
7
Fig.4 Structura unei endotoxine
Sursa: https://www.biologicscorp.com/
e. Exotoxinele sunt toxine secretate de bacterii, care provoacă leziuni ale țesuturilor gazdei
prin distrugerea celulelor sau perturbarea metabolismului celular. Ele pot fi secretate sau,
similar cu endotoxinele, pot fi eliberate după liza celulară (https://www.microrao.com/ ).
Exotoxinele pot fi clasificate în mai multe tipuri. Tipul 1 se leagă la un receptor de pe
suprafața celulară și stimulează căile de semnalizare intracelulare. Din această categorie
fac parte superantigenele, care sunt secretate de mai multe bacterii, cele mai bine
caracterizate fiind cele produse de tulpini de Staphylococcus aureus, ce produc șocul
toxic. Tipul 2 se referă la exotoxinele care afectează membranele celulei gazdă.
Citolizinele dependente de colesterol reprezintă un exemplu de exotoxine de tip 2 care
determina formarea de pori în celula țintă, lucru care necesită prezența colesterolului. Al
treilea tip de exotoxine sunt cele cu ținte de acțiune intracelulare. Acestea la rândul lor pot
fi clasificate după mai multe criterii. Un prim criteriu este modul de a patrunde în celulă.
Un grup de toxine intracelulare îl reprezintă grupul AB, unde subunitatea B (de legare -
binding) se atașează la receptorii depe membranele celulare, iar subunitatea A (cea activă)
traversează membrana și își exercită funcția enzimatică. Un al doilea criteriu de
clasificare ar fi după mecanismul de acțiune. Multe dintre exotoxine acționează direct la
8
nivelul organitelor celulare, cum ar fi ribozomii 70S, inhibând sinteza proteinelor
(Spaulding și colab., 2013).
f. Sideroforii sunt compuși chelatori de fier, cu afinitate ridicată, secretați de
microorganisme prin pompele de eflux ale superfamiliei MFS (major facilitator
superfamily) (Neilands, 1995), ce servesc la transportul intracelular al fierului (Chifiriuc
și colab., 2011).
Sideroforii formează de obicei un complex stabil, hexadentat, octaedric, preferențial cu
Fe3+ (Neilands, 1995). Sideroforii au ca funcție principală chelarea fierului ferric, însă pe
lângă asta, aceștia au capacitatea de a lega o varietate de metale în plus față de fier
(Ahmed și Holmström, 2014).
1.3.1 Patogenitatea cocilor Gram pozitivi de importanță medicală. Staphylococcus

aureus
Colorația Gram, utilizată în mod special pentru a clasifica bacteriille în funcție de

structuraperetelui lor celular, împarte celule bacteriene în 2 categorii și anume celule Gram-
pozitive și celule Gram-negative. Bacteriile Gram-pozitive, după aplicarea colorației, vor
apărea la microscop colorate în violet, datorită colorantului bazic folosit (violet de gențiană),
care intră în celula bacteriană, unde interacționează cu mai multe substanțe formând un
complex stabil intracelular (Chifiriuc și colab., 2007).
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, nesporulați, necapsulați. Pot fi cultivați pe medii
simple sau complexe, unde cresc sub diverse forme, fiind foarte rezistenți la condițiile din
mediul extern (Toma, 2006).
O specie importantă a acestui gen este Staphylococcus aureus, un patogen oportunist,
implicat în special în infecții ale tegumentelor și mucoaselor. Acesta aderă la mucoase,
epitelii după care se multiplică, eliberând enzime sau/și toxine, cu apariția unor sindroame
caracteristice (Toma, 2006).
Staphylococcus aureus își exercită patogenitatea atât prin structura sa, dar și prin
toxinele pe care le produce. Componentele de la nivelul structurii celulei bacteriene de
Staphylococcus aureus care îi conferă caracterul de patogen sunt: microcapsula, care
învelește bacteria și o protejează de atacul celulelor imunitare și efectorilor umorali și
favorizează aderența bacteriei de diferite materiale cum ar fi cele sintetice (catetere, grefe),
peretele celular ce mediază atasarea bacteriei la suprafata mucoaselor prin intermediul
9
acizilor teicoici, provoacă reacții inflamatorii și inhibă mecanismele de apărare ale gazdei
(Toma, 2006).
Staphylococcus aureus secretă un număr mare de toxine printre care:
a. trei tipuri de hemolizine:
 α-toxina specifică tulpinii S.aureus este prototipul pentru clasa de citotoxine mici
formatoare de pori în celulele eucariote (Bhakdi și Tranum, 1991).
 β-hemolizina este o toxină care provoacă liza mai multor tipuri de celule, inclusiv a
eritrocitelor, fibroblastelor, leucocitelor și macrofagelor. Această toxină este o
sfingomielinază neutră care lezează eritrocite pentru a evita sistemul imunitar gazdă,
dar și pentru a avea acces la substanțele nutritive (Huseby și colab., 2007).
 y-hemolizina este o toxină formatoare de pori oligomerici la nivelul bistratului
membranar lipidic (Alessandrini și colab., 2013).
b. toxina șocului toxic este un superantigen, fiind responsabilă de sindromul de șoc toxic,
produs prin eliberarea unor cantități mari de interleukină-1 și interleukină-2 și factor de
necroză tumorală (Dinges și colab., 2000).
c. enterotoxinele eliberate de S. aureus sunt unele dintre cele mai puternice superantigene
bacteriene care exercită efecte toxice profunde asupra sistemului imunitar, ducând la
stimularea eliberării și inflamației citokinelor. Este asociat cu intoxicații alimentare, șoc toxic
nemenstrual, dermatită atopică, astm și polipi nazali (Fries și Varshney., 2013).
d. toxinele exfoliative sunt serin-proteaze ce determină leziuni la nivelul pielii cu exfoliere,
care duce la apariția sindromului stafilococic al pielii opărite (Becker și colab., 2003).
e. coagulaza este o enzimă stafilococică, ce determina conversia fibrinogenului în fibrină.
Complexul rezultat din interactia coagulazei cu protrombina permite enzimei să convertească
fibrinogenul la fibrină. Aceasta are ca rezultat coagularea sângelui. Coagulaza este legată
strâns de suprafața bacteriei și poate acoperi celula bacteriană cu o capsulă protectoare de
fibrină la contactul cu sângele. Cheagul de fibrină poate proteja bacteria de fagocitoză (Mc
Adow și colab., 2012).
f. catalaza este o enzimă care mediază descompunerea peroxidului de hidrogen în apă și
oxigen și protejează stafilococul de speciile reactive de oxigen (Chelikani și colab., 2004).
g. hialuronidaza este o enzimă care hidrolizează acidul hialuronic, componentă esențială a
matricei extracelulare, favorizând diseminarea infecției (Buhren și colab., 2016).
h. lipazele sunt enzime care hidrolizează lipidele și permit bacteriei să supraviețuiască și să
invadeze pielea și țesutul subcutanat (Xie și colab., 2012).
10
i. nucleazele sau DN-azele sunt fosfodiesteraze termorezistente care reprezintă un marker de
detecție pentru S. aureus (Tang și colab., 2008).
1.3.1.1 Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia infecțioasă umană

Staphylococcus aureus este o bacterie care produce multe afecțiuni la nivelul
organismului uman, cauzând infecții în diverse zone ale corpului. Se găsește în principal
la nivelul pielii la persoanele sănătoase, însă dacă bacteria pătrunde în sistemul circulator,
în sistemul osos sau ajunge la inimă poate provoca infecții cu urmări grave, iar cele mai
predispuse persoane la infecțiile cu acest agent patogen sunt cele cu sistemul imunitar
slăbit.
1.Infecții cutanate:
 abcesul cutanat reprezintă o pungă de puroi la nivelul pielii (Fig.5), acesta putând
să apară pe orice parte a corpului, dar mai ales în zonele de creștere a firului de
păr. Această afecțiune este provocată de S. aureus rezistent la meticilină (MRSA),
care este o bacteria distinctă din punct de vedere genetic față de alte tulpini de
stafilococ, ce provoacă infecții dificil de tratat, umplute cu puroi (Stryjewski și
Chambers, 2008).
Fig.5 Leziune provocată la nivelul țesutului cutanat de S. aureus rezistent la meticilină

Sursa: https://lethow.com
 sindromul stafilococic al pielii opărite sau boala lui Ritter reprezintă de asemenea o
afecțiune cutanată, care este des întâlnită la nou născuți. Acest sindrom este indus
de exotoxinele epidermolitice A și B care sunt eliberate de S. aureus și care induc
descuamarea stratului epidermal (Fig.6) (Haveman și colab., 2003).
11
Fig.6 Aspectul leziunilor la un copil cu sindrom stafilococic al pielii opărite
Sursa: https://en.wikipedia.org/
2. Alte tipuri de infecții :

 intoxicația alimentară este o boală gastro-intestinală cauzată de consumul de alimente
contaminate cu toxine produse de S. aureus , care au activitate superantigenică. Alimentele cu
cel mai mare risc de transmitere al toxinelor stafilococice sunt cele insuficient preparate termic,
manipulate de indivizi colonizați cu S. aureus, cum ar fi carnea tocată sau produsele de
patiserie (Hennekinne și colab., 2012).
 sindromul șocului toxic stafilococic este o complicație rară a infecției cu S. aureus în care
toxinele bacteriene acționează ca superantigene, activând un număr foarte mare de celule T și
generând o cascadă de citokine, care se manifestă clinic cu febră, erupție cutanată mai ales la
nivelul palmelor (Fig.7), dureri musculare (Silversides și colab., 2010).
Fig.7 Erupție cutanată apărută în sindromul șocului toxic stafilococic

Sursa: http://resscientiae.wikia.com/
12
1.3.2 Patogenitatea cocilor Gram negativi de importanță medicală. Pseudomonas
aeruginosa
Colorația Gram diferențiază bacteriile în funcție de proprietățile chimice și fizice ale

pereților lor celulari. Bacteriile Gram-negative conțin o cantitate mult mai mică de
peptidoglican, și au o membrană lipidcă externă care este dizolvată când se adaugă alcool-
acetona astfel că bacteriile nu rețin cristalul violet și vor fi recolarate în roșu cu un colorant
de contrast (Chifiriuc și colab., 2007).
Genul Pseudomonas cuprinde bacili Gram-negativi, nesporulați, care au unul sau
mai mulți flageli polari, fiind strict aerobi. În acest gen sunt incluse peste 60 de specii reunite
în 11 genuri (Toma, 2006). Cea mai importantă specie a genului Pseudomonas este
Pseudomonas aeruginosa, care este numit și „bacilul piocianic”. Este o bacterie ce se
întâlnește în tubul digestiv, dar și într-o multitudine de medii, precum apa, aer, sol. Poate
crește pe medii simple în strict aerobioză, fiind o specie de importanță medicală
considerabilă, un agent patogen recunoscut pentru ubicuitatea sa, mecanismele rezistenței
sale la antibiotice și asocierea cu boli grave, cum ar fi pneumonia asociată ventilatorului
(Toma, 2006).
Patogenitatea oportunistului Ps.aeruginosa este dată de numeroșii factori de virulență
cu rol în aderență, colonizare, invazie și evitarea mecanismelor de apărare ale gazdei (Tabelul
1). Cheia prin care tulpina de Ps. aeruginosa posedă capacitatea de a coloniza într-o
diversitate atâta de mare de nișe, constă în prezența numeroaselor insule genomice de
patogenitatea care conferă tulpinilor trăsături adaptative.
Virulența tulpinilor de Ps. aeruginosa este asigurată de mai multe structuri cum ar fi:
capsula cu rol de adezină și rol antifagocitar; pilii ce asigură adeziunea de substratul specific;
lipopolizaharidul din peretele celular cu rol de endotoxină și sideroforii (Toma, 2006).
Ps. aeruginosa sintetizează numeroase substanțe cu efect toxic (Fig. 8):
 exotoxina S prezintă o activitate metabolică care îi permite bacteriei să invadeze
organismele gazdă prin descompunerea straturilor externe ale celulei sau prin necrotizarea
țesuturilor, fiind eliberată în celula gazdă unde poate ataca structura sau funcția celulei,
precum si ADN-ul acesteia (Rocha și colab., 2003).
 exotoxina A este de natură proteică, având roluri diferite, precum: efecte citopatice
directe, inhibarea sintezei proteice și interferența cu funcțiile imunitare ale celulei gazdă
(Michalska și Wolf, 2015).
13
 biofilmul reprezintă un grup de celule aderate între ele și la un substrat, înglobate într-o
matrice extracelulară. S-a dovedit a fi implicat într-o mare varietate de infecții
microbiene, precum cele provocate de P. aeruginosa, ca de exemplu fibroza chistică,
unde tulpinile crescute în biofilm sunt foarte greu de eliminat (Mulcahy și colab., 2014).
 hemolizine și fosfolipaza C care acționează sinergic (Toma, 2006).
 proteazele distrug țesuturile organismului gazdă prin afectarea funcțiilor
imunoglobulinelor, proteinelor complementului, fibronectinei favorizând astfel invazia
tulpinii Ps.aeruginosa. Elastaza și proteaza alcalină (colagenaza) sunt metaloproteaze
care pot degrada o varietate de molecule de apărare ale gazdei. Elastaza prezintă
capacitatea de a distruge componentele complementului, citokinele, IgA, IgG, lizozimul
din mucoasa căilor respiratorii umane și proteinele cu rol de surfactant A si D. Proteaza
alcalină inhibă formarea fibronectinei producând liza acesteia. Elastaza împreună cu
proteaza alcalină distrug structurile de susținere ce conțin în structura lor fibronectina și
elastina, pe lângă acest rol sunt responsabile și de inactivarea IFN-γ si TNF (Adrejko
și Mizerska-Dudka, 2012).
Tabelul 1. Activitățile biologice ale factorilor de virulență prezente la Ps.aeruginosa (după Chifiriuc si
colab., 2011)
Factor de virulență Activitatea biologică
Exotoxina A Citotoxică prin inhibarea sintezei proteinelor

Toxică pentru macrofage
Mitogen pentru celulele T
Inhibă proliferarea granulocitelor și macrofagelor
Exoenzima S Aderența la epiteliu
Citotoxică
Exopolizaharide mucoide Aderența la epiteliu
Bariera împotriva fagocitelor și antibioticelor
Inhibă legarea anticorpilor și a complementului
Fimbrii (pili de tip IV) Aderența la epiteliu
Fosfolipaza C Hemoliză
Lezarea tesutului
Distrugerea surfactantului
Histamina Pierderea integrității epiteliului
Leucocidina Citotoxică pentru neutrofile și limfocite

Lipaza Lezarea țesutului
Lipopolizaharide Determinant antigenic pe suprafața celulei

Proprietăți endotoxice mai slabe decat LPS a altor specii Gram negative
Pigmenți Inhibă mișcarea cililor
Toxici pentru alte specii bacteriene și celule umane
Stimulează metabolismul oxidativ al neutrofilelor
Inhibă proliferarea limfoccitelor
14
Proteaze Lezarea tesutului
Slăbirea joncțiunilor celulelor epiteliale
Degradarea fibronectinei
Clivarea anticorpilor
Inactivarea α 1-antitripsinei, componentelor complementului și
citokinelor
Clivarea receptorilor C3b de pe suprafața neutrofilelor
Stimulează secreția de mucus
Fig.8 Factorii de virulenta prezenti la Pseudomonas aeruginosa (după Chifiriuc și colab., 2011)
1.3.2.1 Implicațiile speciei Pseudomonas aeruginosa în patologia umană
Pseudomonas aeruginosa poate provoca o gamă variantă de infecții la nivelul

diferitelor zone ale corpului cum ar fi: la nivelul sistemului nervos central poate provoca
meningită, care este o boală fatală; la nivelul urechii, rar, poate provoca otită; la nivelul
ochiului poate provoca infecții devastatoare; poate provoca infecții ale tractului urinar, care
se dobândesc de obicei în spital; de asemenea poate produce și infecții gastro-intestinale sau
cutanate, însa cele mai importante afecțiuni produse de această bacterie sunt:
 bacteriemia produsă de Ps. aeruginosa, una dintre cele mai frecvente și letale forme
de bacteriemie cu tulpini Gram-negative. Este des asociată cu infecții nosocomiale. Se
caracterizează prin prezența bacteriei în sânge, bacteriile putând pătrunde în fluxul
sanguin fie ca urmare a unor complicații severe a unor infecții primare, fie în timpul
intervențiilor chirurgicale, în special atunci când este implicat tractul gastro-intestinal,
genital, țesutul cutanat sau mucoasa pulmonară (Blot și colab., 2003; Seifert, 2009;
Sligl și colab., 2015).
15
 endocardita este o inflamație a tunicii interne a inimii, endocardul. Este caracterizată
de leziuni și provocată în general de bacterii, clasificându-se în funcție de sursa
inflamației în endocardită infecțioasă sau neinfecțioasă (
https://www.healthline.com/). Endocardita infecțioasă afectează de obicei valvele.
Ps. aeruginosa cauzează mai multe tipuri de endocardită cum ar fi cea endemică, care
este întâlnită rareori, dar și cea nosocomială, care are o rată de mortalitate de până la
80%, necesitând o diagnosticare și intervenții rapide (Hassan și Al-Riyami, 2012).
Fig.9 Aspectul unei vegetații a valvei mitrale provocată de endocardită bacteriană

Sursa: https://en.wikipedia.org/
 infecțiile respiratorii provocate de Ps. aeruginosa apar la persoane care au disfuncții

la nivelul tractului respirator inferior. Cea mai cunoscută condiție favorizantă pentru
infecția produsă de Ps. aeruginosa este fibroza chistică, o boală genetică autozomală
recesivă care afectează plămânii, dar și alte organe cum ar fi pancreasul sau ficatul,
caracterizându-se prin dificultăți de respirație și tuse cu mucus. Este cauzată de
prezența mutațiilor în ambele copii ale genei pentru proteina CFTR, care este
implicată în producerea diferitelor fluide biologice (O'Sullivan și Freedman, 2009).
Ps. aeruginosa este principalul agent bacterian al infecției pulmonare asociate fibrozei
chistice. Acest agent patogen are tendința de a forma biofilme, reducând clearance-ul
mucociliar și afectând funcția pulmonară. Aceste biofilme declanșează un proces
inflamator și produc infecții cronice, care pot dura luni sau ani de zile
(https://cysticfibrosisnewstoday.com/). Colonizarea poate să apară atât în sinusurile
paranazale, cât și în plămâni (Fig. 10). În timpul perioadelor de tratament cu
antibiotice și a răspunsurilor imune ale gazdei, Ps. aeruginosa poate fi eradicată din
plămâni, ulterior însă plămânii pot fi recolonizați de același genotip de Ps.
16
aeruginosa, care a supraviețuit atacurilor imune și al antibioticelor (Folkesson și
colab., 2012).
Fig.10 Cursul colonizării și infectării cu Pseudomonas aeruginosa la pacienții cu fibroza chistică (după
Folkesson și colab., 2012)
Capitolul 2-Rezistența microorganismelor la substanțe antimicrobiene
Antibioticele sunt substanțe chimice cu o masă moleculară mică, produse de

microorganisme prin procese de biosinteză, sau obținute prin semisinteză sau sinteză chimică,
esențiale în tratamentul și prevenirea infecțiilor bacteriene, putând să omoare sau să inhibe
creșterea bacteriilor (Mihăescu și colab., 2007).
Studiul rezistenței la antibiotice a fost concentrat asupra analizei agenților patogeni
bacterieni și asupra consecințelor rezistenței pentrusănătatea umană, deoarece emergența
rezistenței la antibiotice este, extrem de relevantă din punct de vedere clinic, putând
compromite tratamentul bolilor infecțioase, precum și alte proceduri terapeutice avansate,
cum ar fi transplantul sau terapia anticanceroasă (Martinez, 2012).
2.1 Rezistența naturală la antibiotice

Deoarece originea rezistenței la antibiotice este microbiota mediului, ar fi necesar să
se studieze rezistența în mediile naturale, pentru a înțelege pe deplin aparțiia rezistenței la
agenții patogeni. Există un aspect important apărut în urma studiilor privind rezistența
17
naturală și anume microbiota de mediu conține un număr mult mai mare de gene de rezistență
decât cele observate la patogenii bacterieni (Wright, 2007).
Rezistența naturală se referă la mecanismele prin care toate bacteriile unei specii
sunt rezistente la un antibiotic, fără să dobândească factori de rezistență (Mihăescu și colab.,
2007).
Pseudomonas aeruginosa continuă să fie o cauză majoră a infecțiilor din societatea
occidentală, în mare parte din cauza rezistenței sale intrinsece ridicate la antibiotice. S-a
demonstrat că această rezistență intrinsecă provine din combinarea permeabilității membranei
externe neobișnuit de restrânsă cu mecanismele de rezistență secundară, cum ar fi efluxul
multidrug dependent de energie și β-lactamaza periplasmică codificată cromozomic
(Hancock și Speert, 2000).
Comparativ cu S.aureus, tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt rezistente
natural la o gamă mai largă de antibiotice, însă pot prezenta și rezistență dobândită în urma
tratamentului cu antibiotice. Pseudomonas aeruginosa prezintă o rezistență naturală la o
varietate de antibiotice cum ar fi: β lactamicele, inclusiv penicilinele, cefalosporinele sau
carbapenemuri, toate acestea mediind o varietate de mecanisme (Bălășoiu și colab., 2014).
2.2 Rezistența dobândită

Dobândirea rezistenței la antibiotice se referă la capacitatea unui microorganism de
a rezista la activitatea unui agent antimicrobian la care a fost anterior susceptibil. Acest lucru
poate rezulta din mutația genelor implicate în procesele fiziologice normale și în sinteza
structurilor celulare, prin dobândirea unor gene de rezistență prin transformare, transducție
sau conjugare ( https://amrls.cvm.msu.edu/ ) sau prin combinația acestor două mecanisme
(Mihăescu și colab., 2007).
Spre deosebire de rezistența naturală, trăsăturile asociate cu rezistența dobândită
(Fig.11) se regăsesc numai la unele tulpini sau subpopulații ale fiecărei specii bacteriene. Prin
urmare, sunt necesare metode de laborator pentru a detecta rezistența dobândită la speciile
bacteriene care nu sunt rezistente natural. Aceleași metode sunt utilizate pentru monitorizarea
ratelor de rezistență dobândită ca mijloc de combatere a apariției și răspândirii trăsăturilor de
rezistență dobândite la speciile bacteriene patogene și nepatogene.
18
Fig.10 Procesul de rezistență dobândită la antibiotice
Sursa: https://amrls.cvm.msu.edu/
2.2.1 Rezistența dobândită prin mutații

Mutația reprezintă o cauză a rezistenței la antibiotice care are cel mai mare impact
clinic dar în același timp, poate modifica și modul în care sunt exprimate genele de rezistență
și, pe termen lung, poate juca un rol semnificativ în evoluția și diversificarea determinanților
de rezistență dobândiți. Dacă mutația cromozomială rămâne principalul mecanism de
rezistență pentru o combinație de "bacterie-medicament", atunci ar trebui să existe îngrijorări
cu privire la potențialul de răspândire a tulpinilor bacteriene rezistente, mai degrabă decât a
genelor de rezistență. Există un potențial clar de apariție a rezistenței prin mutații, incluzând
rezistența la agenți care nu au fost încă autorizați pentru utilizare clinică și acest lucru ar
trebui investigat în timpul procesului de dezvoltare a compușilor noi. Astfel de studii pot
ajuta la determinarea alegerii regimurilor de dozare adecvate pentru agenții antimicrobieni
nou introduși pe piață pentru a reuși prevenirea apariției rezistenței (Woodford și Ellington,
2007).
S. aureus este cunoscut pentru capacitatea sa de a deveni rezistent la multiple
antibiotice, iar infecțiile cauzate de tulpini rezistente la antibiotice se produc adesea în valuri
19
epidemice sau focare inițiate de una sau mai multe clone de succes (Chambers și DeLeo,
2010).
La Staphylococcus aureus rezistența poate apărea, de asemenea, prin mutații care
modifică situsurile de legare a medicamentului pe ținte moleculare și prin creșterea expresiei
pompelor endogene de eflux. Dezvoltarea rezistenței prin mutație poate fi redusă prin
utilizarea combinațiilor de inhibitori care țintesc diferite situsuri. De exemplu rezistența la
vancomicină a stafilococului auriu necesită până la șase mutații în diferite gene care au ca
rezultat remodelarea pereteluicelular pentru a reduce accesul antibioticuluila ținta (Foster,
2017).
Rezistența specifica tulpinii S.aureus la antibiotice beta-lactamice se instalează prin
producerea de β lactamaze, ce sunt enzime cu rol de a neutraliza aceste antibiotice, dar și prin
modificarea unor proteine ale peretelui celular cu rol de a reduce permeabilitatea bacteriană.
Aceste proprietăți oferă rezistență la peniciline și cefalosporine (Fisher și colab., 2005).
Tulpinile pot fi testate prin sensibilitatea lor la meticilină, iar dacă acestea sunt
rezistente la meticilină sunt rezistente la toată gama de antibiotice β lactamice (Carvalho și
colab., 2010). Un studiu realizat de French și colab. (1990) a demonstrat ca tulpinile de
Staphylococcus sp. sensibile la meticilină sunt la fel de virulente ca cele rezistente la
meticilină.
La Pseudomonas aeruginosa frecvența mutațiilor variază pentru diferite
antibiotice. Rata mutației poate crește în anumite condiții, cum ar fi în prezența agenților
mutageni sau în timpul creșterii în biofilm. De exemplu, frecvența de mutație pentru
meropenem a crescut de zece ori când cultura a fost preincubată cu concentrații
subinhibitoare de ciprofloxacină. În mod similar, o creștere de 100 de ori a frecvenței
mutației la rezistența la ciprofloxacină a fost observată în biofilme în comparație cu celulele
libere, posibil datorită dereglării enzimelor antioxidante în timpul creșterii în a biofilm care
duce la deteriorarea ADN. Frecvențele mutațiilor sunt crescute cu până la 70 de ori în
tulpinile care conțin mutații în genele implicate în repararea eficientă a erorilor de replicare
ADN. Aceste tulpini pot dobândi rezistență la mai multe antibiotice diferite. Exemple de
hipermutații sunt mutL și mutS, care se produc frecvent la tulpinile care infectează pacienții
cu fibroză chistică (Breidenstein și colab., 2011).
20
2.2.2 Rezistența dobândită prin transferul orizontal de gene
Transferul orizontal de gene este responsabil pentru diseminarea numeroașilor
determinanți de rezistență antimicrobiană la diferite specii bacteriene. Diseminarea rapidă și
largă a determinanților de rezistență și selectarea ulterioară a rezistenței impuse de utilizarea
antimicrobienilor amenință să submineze utilitatea antimicrobienelor. Cu toate acestea,
supravegherea vigilentă a rezistenței antimicrobiene emergente în setările clinice și studiile
ulterioare ale izolatelor rezistente creează un sistem puternic pentru studiul transferului
orizontal de gene și detectarea evenimentelor rare. Două dintre cele mai monitorizate
fenotipuri sunt rezistența la β-lactamice și rezistența la fluorochinolone. Studiile privind
rezistența la aceste antimicrobiene au arătat că se produce o transformare între diferite specii
de bacterii, inclusiv unele specii receptoare care anterior nu erau cunoscute ca fiind
competente pentru transformarea naturală(Barlow,2009).
O caracteristică importantă a patogenului majoritar oportunist, Staphylococcus
aureus, este capacitatea sa extraordinară de a dobândi rapid rezistență la antibiotice. Studiile
genomice relevă faptul că acesta poartă multe gene de virulență și rezistență localizate în
elementele genetice mobile, sugerând că transferul orizontal al genei joacă un rol critic în
evoluția sa. S. aureus este un agent patogen uman foarte versatil care se adaptează ușor
mediului în schimbare și dobândește genele rezistente la antibiotice printr-un număr de
mecanisme diferite, cum ar fi transducția generalizată. Această noțiune poate fi susținută de
constatările recente care dezvăluie fenomenul de autotransducție, care sugerează că fagii și
bacteriile pot chiar să colaboreze pentru a dobândi gene "utile" cum ar fi cele care oferă
rezistență la antibiotice. Cu toate acestea, conjugarea pare să joaceun rol mult mai important
în transferul genelor. În general, conjugarea pare a fi mecanismul de transfer preferat între
specii si genuri îndepărtate filogenetic (Haaber și colab., 2017).
La Pseudomonas aeruginosa transferul orizontal de gene se poate realiza cu variate
elemente genice mobile, cum ar fi plasmidele, transpozonii și integronii, care pot fi dobândite
prin conjugare, transformare sau transducție. Rezistența la antibiotice și chiar multi-rezistența
la mai multe medicamente se poate datora plasmidelor care pot conține mai multe casete de
rezistență. Un astfel de transfer orizontal afectează în principal rezistența la aminoglicozide și
rezistența la β-lactami dar a fost implicat și în rezistența la alte câteva clase de antibiotice
(Breidenstein și colab., 2011).
21
2.3 Mecanismele moleculare ale rezistenței microorganismelor la antibiotice
Bacteriile rezistente la antibiotice care sunt dificil sau imposibil de tratat devin din ce
în ce mai frecvente și provoacă o criză globală pentru sănătatea publică. Rezistența la
antibiotice este codificată de mai multe gene, dintre care multe pot fi transferate între bacterii.
Se descriu în mod constant noi mecanisme de rezistență, precum și noi gene și vectori de
transmitere. Efectul antibioticelor poate fi contracarat prin mai multe mecanisme, fie
intrinseci sau rezultate din mutațiile genelor ce codifică pentru structurile țintă sau din
dobândirea genelor ce modifică sau hidrolizează antibioticele (Mihăescu și colab., 2007).
Așadar, bacteriile pot fi rezistente atât pe cale naturală, dar pot dobândi rezistență la
antibiotice și prin mutații sau prin transfer orizontal de gene. Însă cel mai bine descris
mecanism de rezistență la antibiotice al unei specii bacteriene este cel al rezistenței sale
naturale sau intrinseci (Fig.11). Cel mai bun exemplu de acest fel îl reprezintă acțiunea
antibioticelor β-lactamice, care au ca țintă o proteină cu rol important în sinteza peretelui
celular și anume penicillin-binding protein (PBP). Antibioticul A poate pătrunde în celulă
printr-o porină membranară, atingând ținta și inhibând sinteza peptidoglicanului, antibioticul
B poate de asemenea fi internalizat în celulă printr-o porină, dar spre deosebire de antibioticul
A, acesta este îndepărtat eficient prin eflux, iar antibioticul C nu poate traversa membrana
externă și astfel nu poate accesa PBP țintă (Blair și colab., 2015).
Fig.11 Mecanisme intrinsece de rezistență la antibiotice (după Blair și colab., 2015).
Staphylococcus aureus a demonstrat o capacitate unică de a răspunde rapid la

fiecare nou antibiotic prin dezvoltarea unui mecanism de rezistență, începând cu penicilina și
meticilina, până la cele mai recente, linezolid și daptomicină. Mecanismele de rezistență
22
includ inactivarea enzimatică a antibioticului (enzime de modificare a penicilinei și a
aminoglicozidelor), modificarea țintei cu afinitate scăzută pentru antibiotic (exemplu notabil
fiind D-Ala-D- Lac, precursor de peptidoglican la tulpinile rezistente la vancomicină),
impermeabilitatea pentru antibiotic (pentru vancomicină și eventual daptomicină) și efluxul
activ prin pompe de eflux (pentru fluorochinolone și tetraciclină) (Pantosti și colab., 2007).
Comparativ cu S. aureus, Pseudomonas aeruginosa are capacitatea extraordinară de
a dezvolta rezistență împotriva unei game largi de antimicrobiene prin diferite mecanisme
moleculare care sunt adesea prezente simultan în izolatele clinice (Morodali și colab., 2017).
2.3.1 Inactivarea enzimatică a antibioticelor

Inactivarea enzimatică a antibioticului reprezintă cel mai comun mecanism de
rezistență la antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactivează diferite antibiotice
pot fi transferate prin conjugare mediată de plasmide, iar antibioticele pot fi inactivate prin
clivaj enzimatic sau prin modificare chmică care poate oferi rezistență la aminoglicozide,
cloramfenicol, peniciline, cefalosporine (Mihăescu și colab., 2007).
2.3.2 Efluxul activ al antibioticelor

Barierele de permeabilitate și efluxul activ al moleculelor de medicamente sunt
două mecanisme de rezistență care au fost evidențiate la tulpini implicate în diferite focare
infecțioase ale agenților patogeni rezistenți la antibiotice, sugerând că aceste mecanisme pot
fi ținte bune pentru noi medicamente. Sinergismul de permeabilitate redusă și eflux conferă
atît rezistența intrinsecă cât și / sau dobândită de nivel înalt la multe bacterii importante din
punct de vedere clinic, conferind adesea rezistența multiplă la antibiotice (MDR) (Kumar și
Schweizer, 2005).
Pompele de eflux pentru Staphylococcus aureus au fost clasificate în 5 familii de
proteine:superfamilia facilitatorilor majori (MFS= Major Facilitator Superfamily), familia
moleculelor mici (SMR= Small Multidrug Resistance), familia moleculelor de rezistență
nodulare-diviziune celulară (RND), familia moleculelor de rezistență multiplă și de eliminare
a compușilor toxici (MATE) și familia ABC (ATP-binding cassete). În ultimii ani, pompele
de eflux au generat o atenție sporită datorită corelației lor cu rezistența la antibiotice, dar și
datorită identificării mai multor proteine cu rol de transport cum ar fi: QacA, QacB și NorA.
Acestea conțin de obicei 380-520 de aminoacizi care sunt structurate în 12-14 fragmente
transmembranare, mediind rezistența la o varietate de medicamente diferite structural. Deși
23
mecanismele de reglare ale majorității pompelor de eflux nu au fost clar elucidate, studii in
vitro sugerează că supraexprimarea pompelor de eflux poate fi mecanismul major de
rezistență mediată de eflux. Prin urmare, modul de inducție a pompelor de eflux ar putea fi
schimbat dramatic în prezența antibioticelor (Jang, 2016).
Costa și colab. (2011) au investigat rezistența S. aureus la fluorochinoline asociată
cu 6 pompe de eflux, studiu care a demonstrat că diferite substraturi determină o
supraexprimare a genelor codificatoare pentru pompe de eflux, care pot fi afectate de
asemenea de concentrația substratului.
Studii recente sugerează faptul că pompele de eflux sunt probabil asociate cu
rezistența multiplă și în cazul S.aureus cu rezistență la meticilină, unde există o
supraexprimare a proteinei NorA (Kosmidis și colab., 2012).
De asemenea există și o asociere potențială între rezistența la antibiotice și
distribuția largă a genelor pentru pompe de eflux în cazul S. aureus, generând inhibitori ai
pompelor de eflux cu rol de agenți terapeutici împotriva infecțiilor. Pompele bacteriene de
eflux pot afecta rezultatele clinice ale infecțiilor și ale tratamentului (Fig.12) prin creșterea
patogenității bacteriene, prin extrudarea moleculelor antibacteriene produse de gazdă și prin
reducerea concentrațiilor intracelulare de antibiotice, care pot conduce la apariția sau
accentuarea rezistenţei (Jang, 2016).
Fig.12 Implicațiile clinice ale pompelor bacteriene de eflux (după Jang, 2016).
24
Pseudomonas aeruginosa este un agent patogen oportunist care este caracterizat
printr-o rezistență înnăscută ridicată. O contribuție majoră la această rezistență este asigurată
de un număr mare de sisteme de eflux de tip MDR (rezistență multiplă la antibiotice). S-au
caracterizat patru sisteme cu pompe de eflux la P. aeruginosa: MexA-MexB-OprM, MexC-
MexD-OprJ, MexE-MexF-OprN și MexX-MexY-OprM. Aceste pompe de eflux au diferite
specificități de substrat, iar producția și activitatea lor poate fi mărită de mulți factori prezenți
în mod obișnuit în infecții (de exemplu, densitatea înaltă a inoculului bacterian, pH scăzut și
creșterea în fază staționară) (Aeschlimann, 2003).
Primul sistem de eflux descris la Ps. aeruginosa a fost MexA-MexB-OprM este
exprimat în celulele cultivate pe medii standard de laborator, unde contribuie la rezistența
intrinsecă la un număr mare de agenți antimicrobieni incluzând fluorochinolonne, β-
lactamice, tetraciclină, macrolide, cloramfenicol și sulfonamide. Cel de-al doilea sistem de
eflux de la P. aeruginosa este MexC-MexD-OprJ, care nu este detectabil în toate celulele, dar
contribuie la rezistența la o mare varietate de agenți antimicrobieni inclusiv la macrolide,
cloramfenicol, novobiocină, tetraciclină și unele β-lactamice. Un alt sistem de eflux descris la
Ps. aeruginosa este MexE-MexF-OprN. După activare, conferă rezistență la fluorochinolone,
cloramfenicol, imipenem, alte β-lactamice și la aminoglicozide. Un ultim sistem de eflux la
Ps. aeruginosa este MexX-MexY-OprM, care este implicat în rezistența la aminoglicozide,
tetraciclină, eritromicină și fluorochinolone (Poole, 2001).
2.3.3 Rezistența prin impermeabilitate

Această formă de rezistență a fost descrisă cel mai bine la bacteriile Gram-negative,
a căror membrană externă oferă o barieră formidabilă care trebuie depășită. Există în esență
două căi pe care antibioticele pot traversa membrana externă: o cale mediată de lipide pentru
antibiotice hidrofobe, cum ar fi: aminoglicozide (gentamicină, kanamicină), macrolide
(eritromicină), rifamicine, novobiocin, acid fusidic și peptide cationice și respectiv, prin
porine pentru antibiotice hidrofilice. Compoziția lipidică și proteică a membranei externe are
un impact puternic asupra sensibilității bacteriilor la multe tipuri de antibiotice, iar rezistența
la medicamente este deseori datorată modificărilor acestor porine (Delcour, 2010).
Membrana externă a bacteriilor Gram-negative îndeplinește rolul crucial de a
asigura un strat suplimentar de protecție microorganismului fără a compromite schimburile
cu mediul. Aceasta este alcătuită dintr-un bistrat de fosfolipide, proteine și lipopolizaharide
(LPS). Regiunea de bază a LPS joacă un rol major în asigurarea unei bariere pentru
antibioticele hidrofobe și alți compuși, iar tulpinile care exprimă LPS integre au rezistență
25
intrinsecă la aceste antibiotice. Pe de altă parte, agenții de permeabilizare membranară, cum
ar fi Tris / EDTA, polimixina B și polimixina B (PMBN), au capacitatea de a crește
sensibilitatea la antibioticele hidrofobe menționate mai sus de zeci până la sute de ori , în
funcție de tratament și de antibioticele particulare (Delcour, 2010).
De asemenea a fost demonstrat rolul porinelor în modularea difuziei β-lactamicelor,
obținute prin purificarea și reconstituirea porinelor în lipozomi și folosind fie un test de
umflare a lipozomilor, fie măsurarea ratei de degradare a antibioticelor de către o β-lactamază
(Delcour, 2010).
2.3.4 Modificarea mutațională a țintei antibioticului

Modificările situsurilor țintă ale antibioticelor sunt mecanisme comune de
rezistență. Exemple de tulpini clinice care prezintă o astfel de rezistență se pot găsi pentru
fiecare clasă de antibiotice, indiferent de mecanismul de acțiune. Modificările țintei
antibioticelor sunt adesea rezultatul mutației spontane a unei gene bacteriene de pe cromozom
și selecției în prezența antibioticului. Exemplele includ mutații ale ARN polimerazei și ADN
girazei, rezultând rezistență la rifamicine și, respectiv, chinolone. În unele cazuri, modificarea
structurii țintă necesară pentru a produce rezistență necesită alte schimbări în celulă pentru a
compensa modificarea caracteristicilor țintei. Acesta este cazul transpeptidazei modificate,
MecA la tulpinile de Staphylococcus aureus care conferă rezistență la meticilină (tulpini
MRSA) și la majoritatea altor antibiotice β-lactamice (Lambert, 2005).
2.3.5 Utilizarea unei căi metabolice accesorii (de ocolire a căii metabolice inhibate)
Antibioticele actuale, derivate în principal din surse naturale, inhibă spectrul îngust
al proceselor celulare, și anume replicarea ADN, sinteza proteinelor și biosinteza peretelui
celular. Odată cu explozia globală a rezistenței la medicamente, există un interes reînnoit în
cercetarea proceselor celulare alternative esențiale, inclusiv a căilor metabolice metabolice
bacteriene, ca ținte pentru următoarea generație de antibiotice. Succesul în descoperirea unui
antibiotic nou direcționat către metabolismul central bacterian va apărea după înțelegerea
exactă a modului în care celulele reglează fluxul nutrienților în căi care sunt esențiale pentru
biosinteză și metabolismul energetic în condiții de creștere relevante (Fig.13). Rata reală de
reacție in vivo (adică fluxul metabolic în celulă) depinde, de asemenea, de concentrațiile
reactantului. În consecință, fluxurile metabolice sunt sumele nete ale ratelor de reacție
enzimatice, dependente de abundența proteinelor, parametrii cinetici, concentrațiile
metabolitului și termodinamica metabolitului. Infecția bacteriană modifică fluxul metabolic al
26
celulelor gazdă. În plus, fluxul metabolic al bacteriilor este diferit in vivo în comparație cu
culturile axenice (Murima și colab., 2014).
Fig.13 Interacțiunile dintre componentele moleculare care dau naștere fluxurilor metabolice (după Murima și
colab., 2014)
Capitolul 3- Caracterizarea fenotipică a tulpinilor bacteriene utilizate în studiile in

vivo
Anumiți factori de virulenţă au evoluat în urma competiției pentru supravieţuire,
deoarece se speculează că iniţial au fost utilizaţi pentru a paraliza organismele prădătoare
unicelulare eucariote, iar ulterior s-au adaptat în vederea invadării gazdelor animale. De fapt,
unii factori de virulenţă sunt încă activi împotriva microorganismelor unicelulare eucariote.
De exemplu, sistemul de secreţie de tip III caracteristic speciei Pseudomonas aeruginosa
induce moartea protozoarelor de tipul Dictyostelium discoideum (mucegaiul de noroi) şi de
asemenea, joacă rol important în interacţiunea cu gazdele mamifere (Kessin şi colab., 2001).
Apariţia mecanismelor de rezistenţă a fost o ameninţare constantă, încă de la începutul erei
descoperirii antibioticelor. Decalajul dintre introducerea unui nou antibiotic în tratamentul
clinic şi apariţia rezistenţei la acel antibiotic este de doar câţiva ani. De exemplu, tulpini de
Staphylococcus aureus rezistente la penicilină au fost izolate doar după doi ani de la
introducerea antibioticului pe piaţă (Kirby și colab.,1944).
27
3.1. Scopul și obiectivele lucrării
Scopul acestei lucrări este reprezentat de evidenţierea la nivel fenotipic a

mecanismelor de patogenitate şi virulenţă și a profilurilor de rezistență la antibiotice ale unor
tulpini bacteriene de Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus izolate din mediul
spitalicesc.
Obiective:
1. Studiul fenotipic al factorilor de virulențǎ solubili ai tulpinilor izolate;
2. Studiul capacităţii de aderenţă la substratul abiotic care reflectă potenţialul de
iniţiere a unui proces infecţios și evidenţierea capacitǎții de aderenţǎ la substratul
celular;
3. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotic al tulpinilor analizate.
3.2. Materiale şi metode
3.2.1. Tulpini bacteriene analizate
Pentru efectuarea studiului în vederea evidenţierii mecanismelor de virulenţă,

patogenitate si rezistență s-au utilizat 20 de tulpini bacteriene, aparţinând speciilor
Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa, recent izolate de la pacienţi spitalizați.
Diagnosticul microbiologic s-a realizat în urma însămânţării cu anse calibrate de 1 µl a
produselor biologice pe medii specifice, respectiv Columbia agar cu adaos 5% sânge de
berbec (pentru izolarea cocilor Gram-pozitivi) şi CLED (Cystine lactose electrolyte deficient
agar, mediu lactozat pentru izolarea bacililor Gram-negativi). După incubare timp de 24 ore
la 37o C, s-a continuat diagnosticul cu identificarea tulpinilor bacteriene pe baza aspectului
coloniilor, prin realizarea testelor oxidazei, catalazei şi a coagulazei.
Ssursele de izolare ale tulpinilor analizate sunt prezentate în tabelul 2.
Tabelul 2. Sursa de izolare a tulpinilor bacteriene.

Nr. Crt. Specia bacteriană Sursa de izolare
1 Pseudomonas aeruginosa 1 Hemocultură

5 Pseudomonas aeruginosa 5 Exsudat faringian
28
6 Pseudomonas aeruginosa 6 Urocultură
7 Pseudomonas aeruginosa 7 Urocultură
8 Pseudomonas aeruginosa 8 Urocultură recoltată intraoperator
11 Staphylococcus aureus 1 Hemocultură
15 Staphylococcus aureus 5 Exsudat faringian
16 Staphylococcus aureus 6 Cateter
17 Staphylococcus aureus 7 Lichid peritoneal
18 Staphylococcus aureus 8 Exsudat faringian
19 Staphylococcus aureus 9 Exsudat nazal
20 Staphylococcus aureus 10 Exsudat nazal
3.2.2. Evidenţierea factorilor de virulenţă solubili la tulpinile patogene
S-a realizat pe medii speciale cu substrat încorporat.
3.2.2.1 Evidențierea producerii de lecitinaze şi lipaze
Sunt enzime implicate în patogeneza unor tulpini bacteriene prin capacitatea lor de a
induce formarea de pori în membrana celulelor eucariote, alterând conţinutului lipidic al
acesteia.
Mediu cu gălbenuş de ou: 40.0g proteaze peptone, 5.0g KH2PO4, 2.0g NaCl, 0.1g
MgSO4, 2.0g dextroză, 5mg/ml heminǎ, 20.0g Agar în 1000 ml apă distilată. Se sterilizează
15 min. la 1150C. Se răceste mediul la 500C şi se adaugă emulsie de gălbenuş de ou (1ml la
20ml mediu). Mediul astfel preparat a fost utilizat pentru evidenţierea producerii de
lecitinază.
Mediu cu TWEEN (pH = 7,4): 10.0g peptonă pepsică, 5.0g NaCl, 0.1g CaCl2, 25.0g
geloză în 1000 ml AD. Se lichefiază mediul pe baie de apă clocotită, se menţine la 45-500C şi
se adaugă 1% TWEEN 80 (sterilizat în prealabil la 1200C). Mediul astfel preparat a fost
utilizat pentru evidenţierea lipazei.
Producerea de lecitinază: Tulpinile au fost însămânţate în spot pe agar conţinând
gălbenuş de ou (2,5%) şi incubate 24-48h la 37oC ȋn condiții de aerobiozǎ. Apariţia unei zone
29
de precipitat în jurul spoturilor a fost înregistrată drept reacţie pozitivă (producere de
lecitinază).
Producerea de lipază: Tulpinile bacteriene au fost însămânţate în spot pe agar cu
adaos de 1% Tween 80 (monooleat de sorbitol) şi incubate 24-48h la 37oC. Prezenţa unei
zone opace de precipitare în jurul spotului de cultură, dată de formarea cristalelor de oleat de
calciu insolubile (cristale formate între acizii graşi eliberaţi şi Ca2+), a fost considerată o
reacţie pozitivă.
3.2.2.2 Evidențierea producerii de amilază
Amilazele se detectează utilizând o geloză simplă la care se adaugă amidon de orez,

iar hidroliza se revelează prin inundarea plăcii cu HCl (halou transparent în jurul spotului de
cultură) sau soluţie Lugol (inel galben în jurul spotului de cultură, în timp ce restul mediului
se colorează în albastru). Tulpinile au fost însămânţate în spot pe geloză suplimentată cu 1%
amidon. După incubare la 37oC timp de 24-48h s-a înregistrat prezenţa zonei de clarificare a
mediului în jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive.
3.2.2.3 Evidențierea producerii de proteaze
Proteazele sunt enzime extracelulare cu specificitate scăzută, care hidrolizează

proteinele până la peptide şi aminoacizi, implicate în distrugerea integrităţii ţesuturilor gazdei
şi în progresia infecţiei. Pentru evidenţierea producerii de proteaze, tulpinile au fost
însămânţate în spot pe două tipuri de medii solide - cu cazeină, respectiv cu gelatină şi
incubate 24-48h la 37oC. Prezenţa unei zone de precipitare în jurul ariei de creştere a indicat
proteoliza cazeinei/gelatinei (prezenţa cazeinazei/gelatinazei).
Mediu cu cazeină: pentru 1000 ml Bulion Tripticar: 15.0g Agar se dizolvă în 700 ml
bulion prin încălzire, iar 15.0g cazeina se dizolvă la cald în restul de 300 ml bulion. Se
amestecă cu agarul şi se ajustează pH-ul la 7.5-7.6. Se sterilizează la 1100C, 30 min.
Mediu cu gelatină (pH final = 6.8+/-0.2): 5.0g peptonă, 3.0g extract carne, 12.0g
gelatină în 1000 ml apă distilată. Sterilizare prin autoclavare la 1210C, 15 minute. Acest
mediu s-a folosit pentru determinarea capacităţii microorganismelor de a lichefia gelatina.
3.2.2.4 Evidențierea producerii de DN-ază
Această enzimă acţionează asupra ADN eliberând mono- sau dinucleotidele.
30
S-a utilizat mediu cu ADN: 42.0g agar ADN în 1000 ml apă distilată. Sterilizarea s+a
efectuat timp de 15 min. la 121oC.
Tulpinile au fost însămânţate în spot pe geloză cu ADN şi incubate 24-48h la 37oC ȋn
condiții de aerobiozǎ. După incubare, plăcile au fost inundate cu soluţie de HCl 1N, care a
precipitat ADN nedegradat conţinut în mediu, producând opacifierea acestuia, cu excepţia
zonelor din jurul spoturilor de cultură ale tulpinilor pozitive, care au rămas transparente,
datorită fragmentării anterioare a lanţului de ADN la mononucleotide, datorită acţiunii DN-
azei bacteriene.
3.2.2.5 Hidroliza esculinei
Tulpinile au fost însămânţate cu ansa prin înţepare în placi conţinând mediu cu

esculină conc. 1% și citrat de fier. După incubare timp de 24-48h la 37o C, reacţia pozitivă s-
a înregistrat ca fiind înnegrirea mediului la nivelul însamânţării ca urmare a hidrolizei
exculinei și formării esculetolului care prin combinaţie cu sărurile de fier au determinat
înnegrirea mediului.
Mediu cu esculină: peptonă 25.0g, extract din carne 25.0g, esculină 10.0g, bilă 20.0g,
citrat de fier 10.0 g, agar 10.0g în 1000 ml apă distilată. Se topeste mediul pe baie de apă. Se
verifică pH-ul și dacă este cazul, se ajustează la valoarea 7,4 folosind o soluţie de NaOH 10%,
sau o soluţie de HCl 10%. Se sterilizează prin autoclavare la 1210C, 15 minute.
3.2.2.6 Detectarea producerii de hemolizine

Se evidențiază prin apariția unui halou transparent în urma însămânțării pe geloză cu
adaos de 5% sânge de berbec și după incubare la 370C timp de 24h.
3.2.3. Determinarea hidrofobicității invelisului celular bacterian

Pentru determinarea hidrofobicității suprafeței celulelor microbiene s-au însămânțat
în tuburi Eppendorf 200 µl inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland într-un
volum de 1 ml bullion lichid TSB (Tryptic soy broth) și s-au incubat 24 h la 37 0C. Celulele
microbiene au fost spălate în prealabil de 2x cu tampon fosfat salin PBS (phosphate buffered
saline), centrifugate 10 min. la 10.000 rot/min., sedimentele au fost reluate în PBS și
vortexate. Turbiditatea ajustată la 2 McFarland s-a citit spectrofotometric absorbanța la
λ=620 nm (A0). Peste suspensiile microbiene ramase s-a adaugat 0.5 ml izooctan și s-au
vortexat timp de 2 min.. Probele au fost lăsate în repaus 60 min. pentru a se separa faza
apoasă de faza organică și ulterior s-a determinat absorbanța fazei apoase (strat inferior) la
31
λ=620 nm.
3.2.4. Studiul capacităţii de aderenţă la substrat inert

Testul producerii de factor slime prin metoda microtitrării
Pentru evidenţierea cantitativă a gradului de aderenţă la substrat inert prin metoda
microtitrării, s-au preparat suspensii microbiene ajustate conform standardului de turbiditate
McFarland 0,5 din culture proaspete. Tulpinile bacteriene au fost cultivate în 150 µl bulion
nutritiv repartizat în plăci cu 96 de godeuri și incubate timp de 24-48h la 37oC. După
incubare, placile au fost spălate cu apa fiziologic sterilă 3X) pentru îndepartarea
microorganismelor din suspensie, fixate 5 minute cu 150 µl etanol, colorate cu cristal violet
timp de 20 minute, spălate cu apă de la robinet şi uscate la temperatura camerei. Pentru
determinarea capacităţii de aderenţă se resuspendă plăcile în acid acetic glacial 33% şi se
măsoară spectrofotometric la 490 nm intensitatea suspensiei colorate care este direct
proporţională cu capacitatea de aderenţă la substrat inert .Dupa 48 h, se poate determina
formarea biofilmului la nivelul substratului inert, respectând aceeaşi pasi, însă după 24 h se
adaugă mediu de cultură proaspat.
3.2.5. Evidenţierea capacitǎții de aderenţǎ la substratul celular - Metoda Cravioto

modificată
Aderenţa la suprafaţa celulelor s-a determinat în urma ȋndepǎrtarii mediului de

creștere suplimentat cu antibiotice prin spǎlarea (3 X) substratului celular reprezentat de linii
celulare HEp – Human Epithelioma. Fiecare tulpină bacteriană de densitate optică standard
McFarland 0,5 s-a repartizat într-un volum de 1 ml peste monostratul celular. Plǎcile s-au
incubat la 37ºC, timp de 2 h, timp ȋn care bacteriile au aderat la suprafața celulelor
substratului. Monostratul celular infectat s-a spalat cu TFS (3x), s-a fixat cu metanol (5 min)
şi s-au colorat celulele aderate cu soluţie Giemsa - 20 min. Pattern-ul de aderenţă (localizat,
difuz sau agregativ) s-a determinat prin vizualizarea la microscopul optic, cu ulei de imersie,
după spalarea cu apă de robinet a godeurilor cu monostrat celular şi uscarea la temperatura
camerei.
3.2.6. Determinarea capacității de aderență și invazie la substratul celular prin

aprecierea numărului de celule bacteriene viabile
Aderenţa și invazia la nivelul celulelor s-a determinat în urma ȋndepǎrtarii mediului
de creștere suplimentat cu antibiotice prin spǎlarea (3 X) substratului celular reprezentat de
32
linii celulare HEp – Human Epithelioma. Fiecare tulpină bacteriană de densitate optică
standard McFarland 0,5 s-a repartizat într-un volum de 1 ml peste monostratul celular. Plǎcile
s-au incubat la 37ºC, timp de 2 h, timp ȋn care bacteriile au aderat la suprafața celulelor
substratului. După primele 2 ore de incubare s-a adăugat câte 1 ml de mediu cu gentamicină
în godeurile unde se va aprecia numărul total de bacterii invazive. Plăcile s-au incubat timp
de o ora la 37 0C. Pentru îndepărtarea bacteriilor neaderate s-a îndepărtat mediul și s-a spălat
monostratul celular cu TFS de 3x. În toate godeurile s-a adaugat câte 1 ml Triton X 1%
(diluție în TFS) și s-a incubat 5 min. la 37 0C pentru eliberarea bacteriilor aderate și a celor
invadante intracelular. S-au făcut diluții zecimale din suspensiile din fiecare godeu (până la
diluția 1/108) în apă fiziologică sterilă (AFS), care s-au însămânțat câte 10 µl, pe geloză
nutritivă, în duplicat, pentru determinarea UFC/ml.
3.2.7. Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice – Metoda

difuzimetrică (Kirby-Bauer)
Pentru realizarea antibiogramelor s-au preparat suspensii bacteriene la densitatea
corespunzătoare standardului 0,5 Mc Farland (1.5 x 108 UFCml) din culturi tinere (cultură de
24 h, dezvoltate pe mediu solid- Cetrimid - pentru tulpinile de Pseudomonas aeruginosa şi
Chapman - pentru tulpinile de Staphylococcus aureus). Plăcile cu mediu Mueller Hinton s-au
însămânţat prin tehnica însămânţării ,,în pânză’’, cu tamponul, folosind tulpinile de testat. La
suprafaţa mediului însămânţat s-au dispus în mod steril, discurile cu antibiotice la distanţe
egale cu ajutorul pensei sterile. S-au utilizat antibiotice semnificative clinic, și anume pentru
tulpinile de Staphylococcus aureus s-au testat: penicilină (10 µg), ampicilină (30 µg),
cefoxitin (30 µg), gentamicină (30 µg), amikacină (30 µg),rifamicină (30 µg), tetraciclină(30
µg), linezolid (30 µg),eritromicină (15 µg), clindamicină (2 µg), ciprofloxacin (5 µg),
levofloxacin (5 µg), trimethoprim-sulphamethoxazol (25 µg) și vancomicină (30 µg).Spectrul
de sensibilitate pentru tulpinile de Pseudomonas aeruginosa s-a stabilit testându-se
urmatoarele antibiotice: colistin, amoxicilină-acid clavulanic (3 µg), ampicilină-sulbactam
(30 µg), piperacilină-tazobactam (40 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg), cefotaxim
(30 µg), ceftazidim (10 µg), cefepim (30 µg), gentamicină (30 µg), amikacină (30 µg),
ciprofloxacin (5 µg), levofloxacin (5 µg) și trimethoprim-sulphamethoxazol (25 µg). Plăcile
au fost incubate la 37 ºC, timp de 24 h. Citirea şi interpretarea rezultatelor s-a realizat în
conformitate cu normele CLSI 2017 (Clinical and Laboratory Standards Institute).
3.2.8. Evidentierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotice.
33
3.2.8.1. Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat
Pentru evidențierea metalo β-lactamazelor produse de tulpinile de Pseudomonas

aeruginosa, s-a insămânțat ,,în pânză’’ o tulpină de Escherichia coli sensibilă la
carbapeneme, s-a dispus în centrul plăcii un disc de imipenem și s-au însămânțat în striuri
perpendiculare pe disc tulpinile de testat. Apariția unui aspect de treflă datorat inducerii zonei
de inhibiție indică prezența carbapenemazelor.
3.2.8.2. Evidențierea fenotipului MLSb inductibil
Pentru evidențierea mecanismului de rezistență inductibilă la tulpinile de

Staphylococcus aureus, s-au plasat discuri cu eritromicină și clindamicină, pe aceeași placă,
la o distanță de 25 mm. Apariția fenomenului de antagonism între cele doua discuri indică
prezența mecanismului de rezistență inductibilă la lincosamide și streptogramine.
3.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII
În prezent, patologiile infecțioase reprezintă o problemă importantă de sănătate cu

care ne confruntăm, fiind printre primele 10 cauze principale de mortalitate la nivel mondial,
fapt carese datorează mai multor factori, printre care: schimbările produse în mediul
inconjurător, lipsa metodelor de prevenire a infecțiilor, călătoriile și comerțul global, apărarea
deficitară a gazdei și în special, schimbările adaptative survenite la nivelul
microorganismelor.
Determinarea profilurilor factorilor de virulenţă solubili la tulpinile studiate a

evidenţiat prezenţa unui echipament enzimatic slab reprezentat (Tabelul 3). Factorii de
virulenţă cei mai frecvent exprimati în cazul tulpinilor de Ps.aeruginosa sunt reprezentați de
cazeinază și esculinază (Fig. 14, 15).
34
Factori de virulență
Nr.crt Tulpina Lecitinază Lipază Amilază DN-ază Cazeinază Gelatinază Esculinază Hemolizine
1 Ps. aeruginosa 1 - - ++ - +++ + +++ +
2 Ps. aeruginosa 2 +- +- - - +++ + - ++
3 Ps. aeruginosa 3 - +- - - +++ + - +++
4 Ps. aeruginosa 4 +- +- - - ++ + - ++
5 Ps. aeruginosa 5 - - - - ++ + + +++
6 Ps. aeruginosa 6 - - - - +++ - +++ +
7 Ps. aeruginosa 7 +- - +- - +++ +- +++ +
8 Ps. aeruginosa 8 +- - +- - +++ - +++ +
9 Ps. aeruginosa 9 +- - +- - +++ + ++ ++
10 Ps. aeruginosa 10 +- - ++ - +++ + ++ +
11 S. aureus 1 ++ +++ - - - - ++ +
12 S. aureus 2 - - - - + - - -
13 S. aureus 3 +++ +++ - - + - + -
14 S. aureus 4 +++ +++ - - + - ++ ++
15 S. aureus 5 +++ +++ - - +++ - +- -
16 S. aureus 6 +++ - - - + - - +
17 S. aureus 7 +++ +++ - - + - ++ ++
18 S. aureus 8 ++ +++ - - + - + +++
19 S. aureus 9 - + - - + + - - -
20 S. aureus 10 - - - - ++ - - +++
Tabelul 3. Factorii de virulență solubili.

Notă:“- “ - absența factorului de virulență
’’+”- activitate moderată
“++”-activitate enzimatică ridicată
“+++”-activitate enzimatică foarte ridicată
Proteazele hidrolizează proteinele gazdei și duce la distrugerea integrității țesuturilor
și astfel favorizează progresia infecției. Gelatinaza implicată în distrugerea țesuturilor și
generarea unui răspuns inflamator a fost sintetizată cu o rată scăzută de tulpinile incluse în
studiul de față (Balasubramanian și colab., 2013). Un număr semnificativ de tulpini datorită
sintezei esculinazei prezintă capacitatea de a hidroliza esculina, eliberând esculetolul care
reprezintă un important chelator al fierului. În conformitate cu numeroase studii realizate în
România ce au la bază caracterizarea tulpinilor izolate din aceleași produse biologice cu cele
analizate în acest studiu, s-a evidențiat incapacitatea patogenilor de a hidroliza moleculele de
acizi nucleici și de a elibera fosfomononucleotidele pe care să le utilizeze în propria sinteză,
prin producere de DN-ază (Delcaru și colab., 2017; Holban și colab., 2013; Cotar și colab.,
2010). Amilaza este o enzimă implicată în patogeneza bacteriilor, sintetizată însă de un
35
procent redus de tulpini Ps. aeruginosa. Cercetări similare în literatura de specialitate au
indicat faptul că enzimele de formare a porilor cum ar fi lecitinaza și lipaza joacă un rol
important în diseminarea infecției și a extinderii rănilor în cazul infecției cu Ps. aeruginosa
(Georgescu și colab., 2016). Dintre tulpinile testate, un procent relativ scăzut prezintă
invazine de tipul lipazei şi lecitinazei. În ceea ce privește sinteza hemolizinelor toate tulpinile
de Ps. aeruginosa studiate s-au evidențiat prin apariția unor halouri transparente, ce
caracterizează o hemoliză completă sau prin apariția unei hemolize incomplete caracterizată
de un halou verde/roz (Fig. 14).
Fig.14. Evidenţierea factorilor de virulenţă solubili – lipază, cazeinază, hemolizine (de la stânga la dreapta).
Tulpinile de S. aureus sunt caracterizate în principal de sinteza lipazelor și lecitinazelor
(Fig.15, 16). Lipazele şi lecitinazele sunt enzime ce alterează lipidele membranare şi
plasmatice cu rolul de a forma pori în membrana celulelor gazdă.
Fig.15. Evidenţierea factorilor de virulenţă solubili – lecitinază, lipază, cazeinază, hemolizine (de la stânga la
dreapta).
Tulpinile de S. aureus ce s-au evidentiat printr-o paletă mai extinsă de factori de

virulență sunt tulpinile izolate din hemocultură, exsudat faringian și lichid peritoneal,
respectiv tulpinile codificate 3, 4, 5, 7, 8. Amilaza, DN-aza și gelatinaza sunt factorii de
virulență absenți la tulpinile de S. aureus testate.
36
Fig.16 Ratele de pozitivitate pentru factorii de virulență solubili la tulpinile analizate
Aderența bacteriilor la diferite suprafețe abiotice și biotice este influențată și de

carcteristicile suprafeței celulare bacteriene. Hidrofobicitatea relativă și încărcătura de
suprafață joacă un rol important în atașarea bacteriilor la suprafața materialelor, forțele
hidrofobe aducând bacteriile la o distanță minimă necesară pentru ca structurile hidrofobe ale
celulei bacteriene să poate forma legături cu substratul. Hidrofobicitatea celulară favorizează
atât stabilirea interacțiunilor cu substratul cât și formarea legăturilor între celulele bacteriene,
contribuind astfel la procesul de aderență si de formare a biofilmelor. De asemenea un alt
principiu important ce ține de acest fenomen este că microorganismele pot comuta între
fenotipuri hidrofobe și hidrofile ca răspuns la modificările condițiilor de mediu (temperatura,
compoziția nutrienților etc.) și fazele de creștere (Krasowska și Sigler, 2014). Unele studii au
demonstrat că aderența este primul pas spre colonizarea țesuturilor, iar prevenirea acestui
proces pare a fi o bună strategie pentru menținerea sănătății, iar hidrofobicitatea celulară este
o caracteristică importantă a aderării (Hazen, 2004).
Prin determinarea spectrofotometrică a absorbanței amestecurilor culturilor
bacteriene cu izooctan, s-au obținut valorile reprezentate grafic în Fig. 4 și 5. Tulpinile
caracterizate printr-un nivel crescut de hidrofobicitate sunt: S. aureus 5, 7, 9 și Ps. aeruginosa
3, 9, 5, 2. Unul din mecanismele prin care tulpinile de Ps. aeruginosa prezintă o creștere
semnificativă a hidrofobicității suprafeței celulare este eliberarea unor vezicule de către
membrana externă. Prin acest mecanism se favorizează interacția cu celulele și penetrarea
țesuturilor gazdei (Krasowska și Sigler, 2014).
37
Fig.17. Hidrofobicitatea suprafeței celulare a tulpinilor de S. aureus.
Fig.18. Hidrofobicitatea suprafeței celulare a tulpinilor de Ps.aeruginosa
Microorganismele au evoluat de-a lungul anilor şi au dezvoltat noi mecanisme care

să le ajute să supravieţuiască atât în mediu cât şi în organismul uman. Printre diferitele
strategii de supravieţuire utilizate de către patogeni se numără producerea factorului slime.
Prin capacitatea lor de a adera şi de a forma biofilme la suprafaţa cateterelor sau a altor
suprafeţe inerte prezintă rezistenţă la concentraţii semnificative de antibiotice datorită
faptului ca sunt protejate de matricea exopolizaharidică şi astfel provoacă infecţii severe şi
greu de tratat. Factorul slime (exopolizaharid hidrofil secretat de unele tulpini care determinǎ
aderenţa celulelor bacteriene la suprafeţe inerte, abiotice) este un indicator al gradului de
rezistenţă şi al capacităţii de supravieţuire a tulpinilor bacteriene în mediul extern. El poate
constitui un factor de virulenţă, în cazul infecţiei unui organism gazdă, și prin blocarea
procesului de fagocitoză (Hrv R. şi colab., 2016).
38
În urma studiului de evaluare cantitativă al gradului de aderenţă la substrat inert mai
mult de 50% din totalul tulpinilor au fost pozitive la testul producerii de factor slime,
cunatificat prin metoda microtitrării. Tulpinile care s-au remarcat printr-un nivel crescut al
gradului de aderență la substrat inert sunt: S. aureus 3, 7, 9 (izolate din hemocultură, lichid
peritoneal și exsudat nazal) și Ps. aeruginosa 6, 9, 10 (izolate din urocultură) (Fig. 19, 20).
În urma incubării tulpinilor timp de 48 de ore pentru evidenţierea formării biofilmelor
la nivelul substratului inert reprezentat de plăcile cu 96 de godeuri, s-a demonstrat că nivelul
de aderenţă a crescut la majoritatea tulpinilor studiate în raport cu datele obţinute după
incubarea timp de 24 de ore. O creştere semnificativă a absorbanţei echivalentă cu un grad
ridicat în formarea biofilmului este asociată tulpinilorde Ps. aeruginosa codificată cu numărul
1 (izolată din hemocultură) și S. aureus codificat cu numarul 5 (izolată din exsudat faringian).
0.14
0.12
0.1
D.O. 490 nm
0.08
0.06
0.04
0.02
0
Ps. a. 1 Ps.a. 2 Ps. a. 3 Ps. a. 4 Ps. a. 5 Ps. a. 6 Ps. a. 7 Ps. a. 8 Ps. a. 9 Ps. a. 10 Martor
24 h 48 h bulion
Fig.19. Exprimarea cantitativă a gradului de aderenţă la substrat inert a tulpinilor de Ps.aeruginosa.
0.14
0.12
0.1
D.O. 490 nm
0.08
0.06
0.04
0.02
0
S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus Martor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bulion
24 h 48 h
Fig.20. Exprimarea cantitativă a gradului de aderenţă la substrat inert a tulpinilor de S.aureus.
Aderenţa bacteriilor la suprafaţa celulelor reprezintă o etapă esenţială în colonizarea şi

formarea biofilmului în procesului infecţios. Capacitatea de a adera la celulele eucariote este
39
caracteristică unui procent de 90% din totalul tulpinilor incluse în studiu. Pattern-ul de
aderenţă de tip localizat este exprimat de către 40% dintre speciile aderente, iar un procent de
30% dintre tulpini determină aderenţa de tip agregativ (Fig. 21).
Fig.21 Aderenţa de tip agregativ (dreapta) şi aderenta de tip localizat (stânga) a tulpinilor de P. aeruginosa la
celulele HEp-2 (Colorație Giemsa, Ob. 100x).
Tulpinile de Ps. aeruginosa izolate din urocultură, prezintă un pattern de aderență

predominant agregativ,din acest motiv infecţiile cauzate de aceşti agenţi patogeni fiind dificil
de tratat şi de eradicat recurenţa acestora şi prin urmare sunt justificate diferitele metode de
diagnostic și terapie (Fig. 22).
Fig.22 Evaluarea cantitativă a gradului de aderenţă la substrat celular a tulpinilor de Ps. aeruginosa
În ceea ce privește tulpinile de S. aureus incluse în studiu, majoritatea sunt

caracterizate de un pattern de adenreță localizat, iar singura tulpina care aderă la substratul
celular cu un pattern de aderență de tip agregativ este tulpina izolată din hemocultură
codificată cu indicativul 2 (Fig. 23).
40
Fig.23 Evaluarea cantitativă a gradului de aderenţă la substrat celular a tulpinilor de S. aureus.
Aderența și invazia bacteriană la nivelul diferitelor substraturi naturale reprezintă

procesul cheie esențial pentru persistența, virulența și transmiterea infecției. Rezultatele
obținute relevă faptul că în special tulpinile uropatogene manifestă in vitro proprietăți de
aderență și de invazie față de un substrat celular eukariot sensibil. Atât tulpinile de Ps.
aeruginosa cât și cele de S. aureus izolate din hemoculturi exprimă un nivel scăzut de
aderențăși invazie la nivelul celulelor, excepție fiind tulpina de Ps. aeruginosa 3 (Fig. 24).
Tulpinile de Ps. aeruginosa 6, 8, 10 prezintă un potențial crescut de a adera la nivelul
celulelor, iar tulpinile 3 și 9 au o capacitate crescută de a invada celulele gazdei. Acest lucru
relevă prin capacitatea mare de aderență, dar care însă nu este urmată de internalizarea în
celulele gazdei.
Ps. aeruginosa 10
Ps. aeruginosa 9
Ps. aeruginosa 8
Ps. aeruginosa 7
Ps. aeruginosa 6
Ps. aeruginosa 5
Ps. aeruginosa 4
Ps. aeruginosa 3
Ps. aeruginosa 2
Ps. aeruginosa 1
0 10 20 30 40 50 60 70
Aderenta si invazie (UFC/ml) Invazie (UFC/ml)
Fig.24 Determinarea cantitativă a capacității de aderenţă și invazia tulpinilor de Ps. aeruginosa la celulele HEp-
2.
Tulpinile de S. aureus studiate nu prezintă mecanisme care sa le confere abilitatea de

a evita acțiunea mecanismelor antimicrobiene ale gazdei și de a se internaliza, supraviețui și
41
multiplica intracelular. S. auresus este cunoscut ca un patogen extracelular și prin urmare
majoritatea tulpinilor testate, în special tulpinile 2, 5 și 7 posedă propietatea de a se atașa la
moleculele matricei extracelulare (Fig. 25).
S. aureus 10
S. aureus 9
S. aureus 8
S. aureus 7
S. aureus 6
S. aureus 5
S. aureus 4
S. aureus 3
S. aureus 2
S. aureus 1
0 10 20 30 40 50 60 70
Aderenta si invazie (UFC/ml) Invazie (UFC/ml)
Fig.25 Determinarea cantitativă a capacității de aderenţă și invazia tulpinilor de S. aureus la celulele HEp-2.
Multirezistenţa bacteriilor la antibiotice rămâne o problemă încă neelucidată pe

deplin.Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic este compromisă deoarece rezistența
multiplă la medicamente (MDR= Multidrug Resistance) este un fenotip asociat cu tot mai
mulți patogeni. O gamă largă de mecanisme biochimice și fiziologice pot fi responsabile de
apariția toleranței sau rezistenței față de agenții terapeutici. Un mecanism major implică
inactivarea agentului antimicrobian cu ajutorul enzimelor, cum ar fi β-lactamazele sau
enzimele care modifică aminoglicozidele (Chang și colab., 2015). De asemenea rezistența
poate fi indusă şi prin mutaţii care afectează ţinta intracelulară a unui antibiotic. Chiar dacă
antibioticul pătrunde în mediul intracelular şi nu se produc schimbări la nivelul moleculei
ţintă, bacteriile pot manifesta rezistenţă prin eliminarea activă a antibioticului din celulă. Un
alt mecanism de rezistenţă este indus prin limitarea pătrunderii antibioticului în celulă, ca
urmare a modificărilor suprafeţei celulare bacteriene (reducerea numărului de porine). Chiar
şi în absenţa unor modificări de permeabilitate, absorbţia este diminuată de membrana
externă semipermeabilă, iar acest mecanism acţionează sinergic cu alte procese ce oferă
rezistenţă, cum ar fi degradarea enzimatică şi efluxul activ al antibioticului (Kim S. si colab.,
2016).
În urma citirii și interpretării rezultatelor antibiogramei difuzimetrice s-a constatat că
majoritatea tulpinilor incluse în studiu sunt multirezistente (Tabelele 4,5 ).
42
Tabelul 4. Profilul de rezistență al tulpinilor de S. aureus.
Nr.crt. Tulpina Antibiotice
Staphylococcus VA LZD CIP RF LEV AK SXT CN AMP P FOX E DA TE

aureus
1 MRSA 1 MLSbi S S S S S S S S R R R R R R
2 MRSA 2 MLSbi S S R R R R S R R R R R R R
3 MRSA 3 MLSbc S S S S S S S S R R R R R R
8 MRSA 8 S S S S S S S S R R R R S R
Tabelul 5. Profilul de rezistență al tulpinilor de Ps. aeruginosa.
Nr.crt. Tulpina Antibiotice
Pseudomonas CT AMC CAZ FEP AK IMP TZP MEM CN CIP LEV SXT SAM CTX
aeruginosa
1 P1 S R R R R R R R R R R R R R
2 P 2 metalo β S R R R R R I R R R R R R R
lactamaze
3 P 3 metalo β S R R R R R R R R R R R R R
lactamaze
5 P5 S R S S S S R S R R R R R R
8 P 8 metalo β S R R R R R I R R R R R R R
lactamaze
9 P9 S R R R S R S R R R R R R R
10 P 10 S R R R R R S R R R R R R R
Tulpinile de S. aureus cu un spectru larg de rezistență sunt: S. aureus 2, 6 și 7 (izolate

din hemocultură,de la nivelul cateterului și din lichid peritoneal) (Fig.26).
43
Fig.26 Reprezentarea grafică a profilului de rezistență al tulpinilor de S. aureus
Comparativ, tulpinile de Ps. aeruginosa prezintă un pattern de multirezistență net

crescut față de tulpinile de S. aureus. Singura tulpină sensibilă la acțiunea mai multor clase de
antibiotice și anume: cefalosporine, carbapeneme și aminoglicozide este Ps. Aeruginosa 5
izolată dintr-un exsudat faringian (Fig.27).
Fig.27 Reprezentarea grafică a profilului de rezistență al tulpinilor de Ps. aeruginosa.
Prin plasarea discurilor de antibiotice pe placă într-o anumită ordine, s-a permis
citirea interpretativă a testelor de sensibilitate și detectarea fenotipică a unor mecanisme de
rezistență. Rezistența la cefoxitin, un marker al polirezistenței la antibiotice beta-lactamice a
44
evidențiat faptul că toate tulpinile de S. aureus sunt tulpini meticilino-rezistente (MRSA),
tulpini care în mediul intraspitalicesc creează probleme terapeutice dificile de tratat.
Macrolidele, lincosamidele şi streptogramina B sunt antibiotice cu structură diferită,
dar cu aceeași țintă de acţiune. Aceste antibiotice inhibă sinteza proteinelor bacteriene prin
legarea la ARNr 23S în subunitatea ribozomală 50S. Eritromicina (macrolid) şi clindamicina
(o lincosamidă) sunt utilizate la scară largă în tratamentul infecţiilor cu S. aureus.
Clindamicina reprezinta o opțiune de tratament ideală datorită absorbției orale foarte
eficientă,capacității crescute de a penetra ţesuturi șiposibilitatea utilizării acesteia ca
antibiotic alternativ la pacienţii alergici la penicilină. De asemenea, s-a demonstrat că
clindamicina inhibă producerea toxinelor şi a factorilor de virulență datorita faptului că inhibă
sinteza proteinelor (Abbas și colab., 2015). Cu toate acestea, rezistenţa la eritromicină şi
clindamicina este într-o continuă creştere în rândul izolatelor clinice de S. aureus. Expresia
rezistenței la MLSb poate fi consititutivă (ARN-metilaza este sintetizată continuu, fără
preexpunere la antibiotic) sau inductibilă (ARN-metilaza este produsă numai în prezența unui
agent inductor). Șase dintre tulpinile testate prezintă fenotipul de rezistență inductibilă
(Fig.28), iar 3 dintre tulpini sunt caracterizate de rezistență constitutivă.
Fig.28 Fenotipul de rezistență MLSb inductibil evidențiat la tulpini de S. aureus.
Tulpinile de Ps. aeruginosa producătoare de metalo-β-lactamaze sunt patogeni

nosocomialide temut datorită faptului că prezintă rezistență la toate antibioticele β-lactamice,
cu excepția monobactamilor. Prin realizarea testului Hodge modificat, s-a evidentiat că 3
dintre tulpinile de Ps. aeruginosa sunt producătoare de metalo-β-lactamaze, și anume
tulpinile 2, 3, 8 (izolate din hemoculturi și urocultura) (Fig. 29).
45
Fig.29 Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat - evidențierea metalo β-lactamazelor la tulpini de Ps. aeuruginosa.
Datorită rezistenței sale antimicrobiene intrinseci și dobândite, numai anumite clasele de

antibiotice sunt eficiente în tratamentul infecțiilor cu Ps. aeruginosa. Dintre aceste
antibiotice, carbapenemele au fost considerate ca fiind cele mai eficiente antibiotice β-
lactamice împotriva bacililor Gram negativi MDR, inclusiv Ps. aeruginosa datorită afinității
lor înalte pentru proteinele care leagă penicilina, stabilității față de β-lactamazele cu spectru
extins (ESBL) și permeabilității ridicate a membranei externe bacteriene pentru aceste
antibiotic (Hong și colab., 2015). Rezistența la carbapeneme este considerată o provocare în
clinică, deoarece acestea reprezintăpilonii principali în tratamentul infecțiilor cu tulpini
rezistente de Ps. aeruginosa. În momentul de față există puține opțiuni terapeutice rămase
pentru pacienții infectați cu tulpini de Ps. aeruginosa și rezistența la carbapeneme este din ce
în ce mai frecvent asociată cu multirezistența.
CONCLUZII
Infecţiile nosocomiale produse de tulpini de Ps. aeruginosa și S. aureus sunt printre

cele mai frecvente infecţii bacteriene, cumulând costuri ridicate pentru îngrijirile medicale și
indirect, pentru societate. Numărul mare de gene care codifică pentru rezistență. dar şi pentru
o gamă largă de factori de virulenţă, ameninţă eficiența antibioticelor curente față de aceste
tulpini.
Factorii de virulență solubili enzimatici cel mai frecvent exprimați în cazul tulpinilor
de Ps. aeruginosa analizate sunt reprezentați de cazeinază si esculinază, în timp ce tulpinile
de S. aureus se remarcă în principal prin producerea lipazelor și lecitinazelor.
În urma evaluării cantitative al gradului de aderență la substrat inert mai mult de 50%
din totalul tulpinilor au fost pozitive la testul producerii de factor slime. Tulpinile de S.
aureus ce prezintă un nivel crescut de hidrofobicitate, proprietate ce indică capacitatea
46
acestora de a forma biofilme pe substraturi inerte, sunt izolate din exsudat faringian și nazal și
cele de Ps. aeruginosa din hemocultură si urocultură.
Aderenţa bacteriilor la suprafaţa celulelor a fost evidențiată la majoritatea tulpinilor
incluse în studiu. Pattern-ul de aderenţă de tip localizat a fost exprimat de 40% dintre
tulpinile aderente, iar un procent de 30% au prezentat aderenţă de tip agregativ.
Tulpinile uropatogene manifestă cea mai intensă capacitate de aderență și invazie a
substratului celular utilizat. Tulpinile de S. aureus nu prezintă capacitatea de invazie a
celulelor HEp-2.
Tulpinile de Ps. aeruginosa prezintă profiluri de multirezistență mult mai extinse
comparativ cu cele de S. aureus. Toate tulpinile de S. aureus sunt meticilino-rezistente, iar
peste 50% prezintă concomitent fenotipul de rezistență inductibilă la macrolide, lincosamide
și streptogramina B. Testul Hodge modificat a evidentiat producerea de metalo-β-lactamaze
la unele dintre tulpinile de Ps. aeruginosa.
Evidențierea profilurilor de patogenitate şi virulenţă și corelarea acestora cu pattern-ul
de sensibilitate/rezistență la antibiotice poate furniza informații importante pentru
optimizarea tratamentelui și pentru dezvoltarea unor strategii de prevenșie a apariției și
cronicizării proceselor infecțioase.
Bibliografie
1. Abbas A., Srivastava P., Nirwan P. S., 2015. Prevalence of MLSB Resistance and
Observation of erm A & erm C Genes At A Tertiary Care Hospital. J Clin Diagn
Res. 9, DC08-DC10.
2. Adrejko M., Mizerska-Dudka M., 2012. Effect of Pseudomonas aeruginosa elastase B on
level and activity of immune proteins/peptides of Galleria mellonella hemolymph. J.
Insect Science. 12, 1536-2442.
3. Aeschlimann J. R., 2003. The role of multidrug efflux pumps in the antibiotic resistance
of Pseudomonas aeruginosa and other gram-negative bacteria. Insights from the Society
of Infectious Diseases Pharmacists. Pharmacotherapy. 23, 916-924.
4. Ahmed E., Holmström S. J., 2014. Siderophores in environmental research: roles and
applications. Microb Biotechnol. 7, 196–208.
47
5. Alessandrini A., Viero G., Dalla Serra M., Prévost G., Facci P., 2013. γ-Hemolysin
oligomeric structure and effect of its formation on supported lipid bilayers: An AFM
Investigation. Biochim. Biophys. Acta. 1828, 405-411.
6. Bălășoiu M., Bălășoiu A. T., Mănescu R., Avramescu C., Ionete O., 2014. Pseudomonas
Aeruginosa Resistance Phenotypes and Phenotypic Highlighting Methods. Curr Health
Sci J. 40, 85–92.
7. Balasubramanian D., Schneper L., Kumari H., Mathee, K. 2013. A dynamic and intricate
regulatory network determines Pseudomonas aeruginosa virulence. Nucleic Acids Res,
41, 1–20.
8. Barlow M., 2009. What antimicrobial resistance has taught us about horizontal gene
transfer. Methods Mol Biol. 532, 397-411.
9. Becker K., Friedrich AW., Lubritz G., Weilert M., Peters G., Von Eiff C.,
2003. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins
amog strains of Staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens. J. Clin.
Microbiol. 41, 1434–1439.
10. Bhakdi S., Tranum-Jensen J., 1991. α-toxin of Staphylococcus aureus. Microbiol.
Rev. 55, 733–751.
11. Blair J. M., Webber M. A., Baylay A. J., Ogbolu D. O., Piddock L. J., 2015. Molecular
mechanisms of antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 13, 42-51.
12. Blot S., Vandewoude K., Hoste E., Colardyn F., 2003. Reappraisal of attributable
mortality in critically ill patients with nosocomial bacteraemia involving Pseudomonas
aeruginosa. J Hosp Infect. 53, 18-24.
13. Breidenstein E. B., de la Fuente-Núñez C., Hancock R. E., 2011. Pseudomonas
aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19, 419-426.
14. Buhren B. A., Schrumpf H., Hoff N. P., Bölke E., Hilton S., Gerber P. A., 2016.
Hyaluronidase: from clinical applications to molecular and cellular mechanisms. Eur J
Med Res. 21, 5.
15. Carpenter M. R., Rozovsky S., Boyd E. F., 2015. Pathogenicity Island Cross Talk
Mediated by Recombination Directionality Factors Facilitates Excision from the
Chromosome. J Bacteriol. 198, 766-776.
16. Carvalho K. S., Mamizuka E. M., Gontijo Filho P. P., 2010. Methicillin/Oxacillin-
resistant Staphylococcus aureus as a hospital and public health threat in Brazil. Braz J
Infect Dis. 14, 71-76.
48
17. Chambers H. F., DeLeo F. R., 2010. Waves of Resistance: Staphylococcus aureus in the
Antibiotic Era. Nat Rev Microbiol. 7, 629-641.
18. Chang H. H., Cohen T., Grad Y. H., Hanage W. P., O’Brien T. F., Lipsitch, M., 2015.
Origin and proliferation of multiple-drug resistance in bacterial pathogens. Microbiol.
Mol. Biol. Rev. 79, 101–116.
19. Chelikani P., Fita I., Loewen PC., 2004. Diversity of structures and properties among
catalases. Cell. Mol. Life Sci. 61, 192–208.
20. Chen L. H., Xiong Z, H., Sun L. L., Yang J., Jin Q., 2012. VFDB 2012 update: toward the
genetic diversity and molecular evolution of bacterial virulence factors. Nucleic Acids
Res. 40, 641-645.
21. Chifiriuc M. C., Diţu L. M., Mihăescu G., 2007. Microbiologie generală. Editura
Universităţii din Bucureşti.
22. Chifiriuc M. C., Lazăr V., Mihăescu G., 2011. Microbiologie şi virologie medicală.
Editura Universităţii din Bucureşti.
23. Costa S. S., Falcão C., Viveiros M., Machado D., Martins M., MeloCristino J., Amaral
L., Couto I., 2011. Exploring the contribution of efflux on the resistance to
fluoroquinolones in clinical isolates of Staphylococcus aureus. BMC Microbiol. 11, 241.
24. Cotar A. I., Chifiriuc M. C., Dinu S., Bucur M., Iordache C., Banu O., Lazar V. 2010.
Screening of molecular virulence markers in Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa strains isolated from clinical infections. Int. J. Mol. Sci. 11, 5273–5291.
25. Delcaru C., Podgoreanu P., Alexandru I., Popescu N., Măruţescu L., Bleotu C., Lazăr V.
2017. Antibiotic Resistance and Virulence Phenotypes of Recent Bacterial Strains
Isolated from Urinary Tract Infections in Elderly Patients with Prostatic Disease.
Pathogens. 6, 22.
26. Delcour A. H., 2010. Outer Membrane Permeability and Antibiotic Resistance. Biochim
Biophys Acta. 1794, 808–816.
27. Dinges M. M., Orwin P. M., Schlievert P. M., 2000. Exotoxins of Staphylococcus aureus.
Clin. Microbiol. Rev. 13, 16-34.
28. Donnenberg M. S., Whittam T. S., 2001. Pathogenesis and evolution of virulence in
enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. J Clin Invest. 107, 539–548.
29. Fisher J. F., Meroueh S. O., Mobashery S., 2005. Bacterial Resistance to β-Lactam
Antibiotics: Compelling Opportunism, Compelling Opportunity. Chem. Rev. 105, 395-
424.
49
30. Folkesson A., Jelsbak L., Yang L., Johansen H. K., Ciofu O., Høiby N., Molin S., 2012.
Adaptation of Pseudomonas aeruginosa to the cystic fibrosis airway: an evolutionary
perspective. Nat Rev Microbiol. 10, 841-851.
31. Foster T. J., 2017. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and
future prospects. FEMS Microbiol Rev. 41, 430-449.
32. French G. L., Cheng A. F. B., Ling J. M. L., Mo P., Donnan S., 1990. Hong Kong strains
of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus have similar
virulence. J Hosp Infect. 15, 117-125.
33. Fries B. C., Varshney A. K., 2013. Bacterial Toxins—Staphylococcal Enterotoxin B.
Microbiol Spectr. 1, 1-12.
34. Georgescu M., Gheorghe I., Curuțiu C., Lazăr V., Bleotu C., Chifiriuc M. C., 2016.
Virulence and resistance features of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from
chronic leg ulcers. BMC Infect Dis. 16, 92.
35. Haaber J., Penadés J. R., Ingmer H., 2017. Transfer of Antibiotic Resistance in
Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 25, 893-905.
36. Hacker J., Kaper JB., 2000. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu
Rev Microbiol. 54, 641–679.
37. Hancock R. E., Speert D. P., 2000. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa:
mechanisms and impact on treatment. Drug Resist Updat. 3, 247-255.
38. Hassan K. S., Al-Riyami D., 2012. Infective Endocarditis of the Aortic Valve caused by
Pseudomonas aeruginosa and Treated Medically in a Patient on Haemodialysis. Sultan
Qaboos Univ Med J.12, 120-123.
39. Haveman L. M., Fleer A., Gerards L. J., Staphylococcal scalded skin syndrome in two
very low birth weight infants. J Perinat Med. 31, 515-519.
40. Hennekinne J. A., De Buyser M. L., Dragacci S., 2012. Staphylococcus aureus and its
food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev.
36, 815-836.
41. Holban A., Chifiriuc M. C., Cotar A., Bleotu C., Grumezescu A., Banu O., Lazar V.,
2013. Virulence markers in Pseudomonas aeruginosa isolates from hospital- acquired
infections occurred in patients with underlying cardiovascular disease. Rom Biotechnol
Lett. 18. 8843.
42. Hong D. J., Bae I. K., Jang I. H., Jeong S. H., Kang H. K., Lee K. 2015. Epidemiology
and Characteristics of Metallo-β-Lactamase-Producing Pseudomonas aeruginosa. Infect
Chemother. 47, 81.
50
43. Hrv R., Devaki R., Kandi V. 2016. Evaluation of Different Phenotypic Techniques for the
Detection of Slime Produced by Bacteria Isolated from Clinical Specimens. Cureus, 8,
e505.
44. Huseby M., Shi K., Brown C. K., Digre J., Mengistu F., Seo K. S., Bohach G.
A., Schlievert P. M., Ohlendorf D. H., Earhart C. A., 2007. Structure and biological
activities of beta toxin from Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 189, 8719-8726.
45. Jang S., 2016. Multidrug efflux pumps in Staphylococcus aureus and their clinical
implications. J Microbiol. 54, 1-8.
46. Kessin R., Mekalanos J., Pukatzki S., 2001. The human pathogen Pseudomonas
aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba
Dictyostelium discoideum. PNAS. 99 , 3159-3164.
47. Ki V., Rotstein C., 2008. Bacterial skin and soft tissue infections in adults: A review of
their epidemiology, pathogenesis, diagnosis, treatment and site of care. Can J Infect Dis
Med Microbiol. 19, 173-184.
48. Kim S. H., Park C., Chun H. S., Lee D. G., Choi J. K., Lee H. J., Yoo J. H., 2016. Pilot
Screening to Determine Antimicrobial Synergies in a Multidrug-Resistant Bacterial Strain
Library. Microb Drug Resist. 22, 372–378.
49. Kirby M., Rantz L. A., 1944. The absorption and excretion of penicillin following
continuous intravenous and subcutaneous administration. J. Clin. Invest. 23 , 789-794.
50. Klemm P., Schembri MA., 2000. Bacterial adhesins: function and structure. Int. J. Med.
Microbiol. 290, 27–35.
51. Kochut A., Dersch P., 2013. Bacterial invasion factors: Tools for crossing biological
barriers and drug delivery?. Eur. J. Pharm. Biopharm. 84, 242-250.
52. Kosmidis C., DeMarco C. E., Frempong-Manso E., Seo S. M., Kaatz G. W., 2010. In
silico genetic correlations of multidrug efflux pump gene expression in Staphylococcus
aureus. Int. J. Antimicrob. Agents. 36, 222–229.
53. Krasowska, A., Sigler, K., 2014. How microorganisms use hydrophobicity and what does
this mean for human needs? Front Cell Infect Microbiol, 4, 112.
54. Lambert P. A., 2005. Bacterial resistance to antibiotics: modified target sites. Adv Drug
Deliv Rev. 57, 1471-1485.
55. Martinez J. L., 2012. Natural Antibiotic Resistance and Contamination by Antibiotic
Resistance Determinants: The Two Ages in the Evolution of Resistance to
Antimicrobials. Front Microbiol. 3, 1.
51
56. McAdow M., Missiakas D. M., Schneewind O., 2012. Staphylococcus aureus Secretes
Coagulase and von Willebrand Factor Binding Protein to Modify the Coagulation
Cascade and Establish Host Infections. J Innate Immun. 4, 141–148.
57. Michalska M., Wolf P., 2015. Pseudomonas Exotoxin A: optimized by evolution for
effective killing. Front Microbiol. 6, 963.
58. Mihăescu G., Chifiriuc M. C., Dițu L. M., 2007. Antibiotice și substanțe
chimioterapeutice antimicrobiene, Editura Academiei Române.
59. Morodali M. F., Ghods S., Rehm B. H., 2017. Pseudomonas aeruginosa Lifestyle: A
Paradigm for Adaptation, Survival, and Persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39.
(de întrebat de pagini).
60. Mulcahy L. R., Isabella V. M., Lewis K., 2014. Pseudomonas aeruginosa biofilms in
disease. Microb Ecol. 68, 1–12.
61. Murima P., McKinney J. D., Pethe K., 2014. Targeting bacterial central metabolism for
drug development. Chem. Biol. 21, 1423-1432.
62. Neilands J. B., 1995. Siderophores: Structure and Function of Microbial Iron Transport
Compounds. J. Biol. Chem. 270, 26723–26726.
63. O'Sullivan B. P., Freedman S. D., 2009. Cystic fibrosis. Lancet. 373, 1891-1904.
64. Pantosti A., Sanchini A., Monaco M., 2007. Mechanisms of antibiotic resistance in
Staphylococcus aureus. Future Microbiol. 2, 323-334.
65. Poole K., 2001. Multidrug Efflux Pumps and Antimicrobial Resistance in Pseudomonas
aeruginosa and Related Organisms. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 255-264.
66. Rietschel E. T., Kirikae T., Schade F. U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A.
J., Zähringer U., Seydel U., Di Padova F., 1994. Bacterial endotoxin: molecular
relationships of structure to activity and function. FASEB J. 8, 217–225.
67. Rocha C. L., Coburn J., Rucks E. A., Olson J. C., 2003. Characterization
of Pseudomonas aeruginosa Exoenzyme S as a Bifunctional Enzyme in J774A.1
Macrophages. Infect Immun. 71, 5296–5305.
68. Seifert H., 2009. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and
management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245.
69. Silversides J. A., Lappin E., Ferguson A. J., 2010. Staphylococcal toxic shock syndrome:
mechanisms and management. Curr Infect Dis Rep. 12, 392-400.
70. Sligl W. I., Dragan T., Smith S. W., 2015. Nosocomial Gram-negative bacteremia in
intensive care: epidemiology, antimicrobial susceptibilities, and outcomes. Int. J. Infect.
Dis. 37, 129-134.
52
71. Spaulding A. R., Salgado-Pabón W., Kohler P. L., Horswill A. R., Leung D.
Y., Schlievert P. M., 2013. Staphylococcal and streptococcal superantigen exotoxins. Clin
Microbiol Rev. 26, 422-447.
72. Stryjewski M. E., Chambers H. F., 2008. Skin and Soft-Tissue Infections Caused by
Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 46,
S368–S377.
73. Tang J., Zhou R., Shi X., Kang M., Wang H., Chen H., 2008. Two thermostable nucleases
coexisted in Staphylococcus aureus: evidence from mutagenesis and in vitro expression.
FEMS Microbiology Letters. 284, 176–183.
74. Toma Săcărea F., 2006. Bacteriologie Medicală, University Press, Târgu Mureş.
75. Wen Z., Zhang J. R., 2015. Bacterial Capsules. În: Molecular Medical Microbiology
(Second Edition) Tang Y. W., Sussman M., Liu D., Poxton I., Schwartzman J., (eds),
Academic Press, 33-53.
76. Woodford N., Ellington M. J., 2007. The emergence of antibiotic resistance by mutation.
Clin Microbiol Infect. 13, 5-18.
77. Wright G. D., 2007. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic
diversity. Nat. Rev. Microbiol. 5, 175–186.
78. Xie W., Khosasih V., Suwanto A., Kim H. K., 2012. Characterization of lipases from
Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis isolated from human facial
sebaceous skin. J Microbiol Biotechnol. 22. 84-91.
79. Zarnea G., 1983. Tratat de Microbiologie generală. Editura Academiei Republicii
Socialiste România.
80. http://resscientiae.wikia.com/wiki/File:Staphylococcal-Toxic-Shock-Syndrome-
%E2%80%93-Causes-Symptoms-Diagnosis-Treatment-and-Ongoing-care.jpg
81. https://amrls.cvm.msu.edu/microbiology/molecular-basis-for-antimicrobial-
resistance/acquired-resistance
82. https://basicmedicalkey.com/22-pathogenesis-of-bacterial-infections/
83. https://cysticfibrosisnewstoday.com/pseudomonas-aeruginosa/
84. https://en.wikipedia.org/wiki/Infective_endocarditis#/media/File:Haemophilus_parainflue
nzae_Endocarditis_PHIL_851_lores.jpg
85. https://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcal_scalded_skin_syndrome#/media/File:OSC_
Microbio_21_02_SSSS.jpg
86. https://lethow.com/disease/what-is-mrsa-staph-infection/
87. https://www.biologicscorp.com/blog/bacterial-endotoxin-definition/#.WwaHPUiFNPY
53
88. https://www.healthline.com/health/endocarditis
89. https://www.microrao.com/micronotes/exotoxin.htm
54

Licenta

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Licenta

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

Stabilirea profilurilor fenotipice de

Coordonator științific: Prof. dr. Carmen Chifiriuc

Capitolul 1- Mecanisme de patogenitate și virulență................................................................. 4

1.1 Definiții ............................................................................................................................... 4

1.2 Genele ce codifică patogenitatea. Evoluţia bacteriilor patogene ........................................ 5

1.3 Factorii de virulență ............................................................................................................ 6

1.3.1 Patogenitatea cocilor Gram pozitivi de importanță medicală. Staphylococcus

1.3.1.1 Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia infecțioasă umană ....... 11

1.3.2 Patogenitatea cocilor Gram negativi de importanță medicală. Pseudomonas

1.3.2.1 Implicațiile speciei Pseudomonas aeruginosa în patologia umană ................... 15

Capitolul 2- Rezistența microorganismelor la substanțe antimicrobiene .............................. 17

2.1 Rezistența naturală la antibiotice ...................................................................................... 17

2.2 Rezistența dobândită ......................................................................................................... 18

2.2.1 Rezistența dobândită prin mutații .............................................................................. 19

2.2.2 Rezistența dobândită prin transferul orizontal de gene .............................................. 21

2.3 Mecanismele moleculare ale rezistenței microorganismelor la antibiotice ...................... 22

2.3.1 Inactivarea enzimatică a antibioticelor ..................................................................... 23

2.3.2 Efluxul activ al antibioticelor ................................................................................... 23

2.3.3 Rezistenta prin impermeabilitate .............................................................................. 25

2.3.4 Modificarea mutațională a țintei antibioticului ........................................................ 26

Capitolul 3- Caracterizarea fenotipică a tulpinilor bacteriene utilizate în studiile in vivo .. 27

3.1. Scopul și obiectivele lucrării ............................................................................................ 28

3.2.1. Tulpini bacteriene analizate ....................................................................................... 28

3.2.2. Evidenţierea factorilor de virulenţă solubili la tulpinile patogene ............................. 29

3.2.2.1 Evidențierea producerii de lecitinaze şi lipaze................................................... 29

3.2.2.2 Evidențierea producerii de amilază .................................................................... 30

3.2.2.3 Evidențierea producerii de proteaze................................................................... 30

3.2.2.4 Evidențierea producerii de DN-ază .................................................................... 30

3.2.2.5 Hidroliza esculinei .............................................................................................. 31

3.2.2.6 Detectarea producerii de hemolizine ................................................................... 31

3.2.3. Determinarea hidrofobicității invelisului celular bacterian ...................................... 31

3.2.4. Studiul capacităţii de aderenţă la substrat inert ........................................................ 32

3.2.5. Evidenţierea capacitǎții de aderenţǎ la substratul celular - Metoda Cravioto

3.2.6. Determinarea capacității de aderență și invazie la substratul celular prin

3.2.7. Determinarea calitativă a spectrului de sensibilitate la antibiotice – Metoda

3.2.8. Evidentierea fenotipică a mecanismelor de rezistență la antibiotice. ........................ 33

3.2.8.1. Testul ,,treflei’’ sau Hodge modificat .............................................................. 34

3.2.8.2. Evidențierea fenotipului MLSb inductibil ....................................................... 34

3.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII .................................................................................................. 34

Capitolul 1- Mecanisme de patogenitate și virulență

1.2 Genele ce codifică patogenitatea. Evoluţia bacteriilor patogene

Fig.1. Structura unei insule de patogenitate-V1-4 (gene de virulență), IS(secvențe de inserție)

În studiul evoluției bacteriilor patogene (Fig.2), E. coli este un veritabil exemplu al

1.3 Factorii de virulență

Factorii de virulență sunt reprezentați de diferite structuri bacteriene, cu diferite roluri

Fig.3 Rolul adezinelor în colonizarea unui substrat celular

1.3.1 Patogenitatea cocilor Gram pozitivi de importanță medicală. Staphylococcus

Colorația Gram, utilizată în mod special pentru a clasifica bacteriille în funcție de

1.3.1.1 Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia infecțioasă umană

Fig.5 Leziune provocată la nivelul țesutului cutanat de S. aureus rezistent la meticilină

2. Alte tipuri de infecții :

Fig.7 Erupție cutanată apărută în sindromul șocului toxic stafilococic

Colorația Gram diferențiază bacteriile în funcție de proprietățile chimice și fizice ale

Factor de virulență Activitatea biologică

Exotoxina A Citotoxică prin inhibarea sintezei proteinelor

Leucocidina Citotoxică pentru neutrofile și limfocite

Lipopolizaharide Determinant antigenic pe suprafața celulei

1.3.2.1 Implicațiile speciei Pseudomonas aeruginosa în patologia umană

Pseudomonas aeruginosa poate provoca o gamă variantă de infecții la nivelul

Fig.9 Aspectul unei vegetații a valvei mitrale provocată de endocardită bacteriană

 infecțiile respiratorii provocate de Ps. aeruginosa apar la persoane care au disfuncții

Capitolul 2-Rezistența microorganismelor la substanțe antimicrobiene

Antibioticele sunt substanțe chimice cu o masă moleculară mică, produse de