Sinteza ADN/ului decurge numai în faza S a ciclului celular al eucariotelor

Unul din factorii care influenţează

sinteza ADN-ului este timpul necesar celulei
pentru a se divide. Bacteriile au nevoie de 20-
30 min pentru a-şi dubla numărul. Replicarea
este imediat urmată de diviziunea celulelor
fiică, după care are loc sinteza ADN-ului.
L. Hartwell a studiat celulele de drojdie
(eucariote). El a încercat să demonstreze cum
celulele controlează timpul de creştere şi
diviziunea celulară. Drojdiile sunt organisme
unicelulare care se divid prin “înmugurire”.
Procesul este similar cu cel al mitozei, cu
excepţia ca membrana nucleară rămâne intactă.
Pe parcursul experimentelor sale Hartwell a
descoperit faptul că în cazul celulelor eucariote Etapele ciclului celular al eucariotelor
se disting patru etape în decursul ciclului
celular. O celulă trebuie într-o prima fază să se dezvolte şi să se “aprovizioneze” cu
nutrienţii necesari. Această faza intermediară (faza G1; G = “gap”- trecere) are loc
înainte de a se declanşa sinteza ADN-ului. În etapa următoare (faza S) celulele
sintetizează ADN-ul (replicarea ADN-ului) şi practic celula se pregăteşte pentru
diviziunea celulară. După replicarea ADN-ului, celula intră într-o altă fază intermediară (
faza G2), fază în care aceasta îşi sintetizează alte proteine sau componente celulare
necesare pentru diviziunea celulară. M este faza mitotică, în care celulele se divid, după
care ciclul se repetă. Mitoza este dependentă de completarea tuturor celor 3 faze
premergătoare acesteia. În general faza S, faza în care are loc sinteza ADNului, se
caracterizează printro perioada mai largă de timp.

Replicarea ADN-ului este în majoritatea cazurilor bidirectional

O altă întrebare de interes în ceea ce priveşte procesul de replicare este: Cum
acţionează maşinăria de replicare a ADN-ului de-a lungul duplexului?
Câteva mecanisme de sinteză a ADN-ului (creştere a lanţului) permit replicarea
semiconservativă:
1) Un lanţ creşte dintr-un punct, numit ori-
gine de replicare (ori 1), iar celalalt lanţ este sinte-
tizat dintr-un alt punct (ori 2). Acest mecanism
apare în cazul ADN-ului liniar viral (adenovirus);
2) Existenţa unei singure furci de replicare
(regiunea în care catenele parentale sunt separate şi
servesc ca matriţă) şi a unui singure origini;
3) Sinteza poate porni dintr-un singur punct
şi se desfăşoara în ambele direcţii, bidirecţional,
fiecare lanţ fiind copiat în cadrul unei furci repli- Furca
cative. Datele din literatură vin în sprijinul replicativa
ultimului mecanism.
 În cromozomii circulari (caracteristici bacteriilor sau unor virusuri) este prezentă
o singura origine şi două furci de replicare
apar în parţi opuse ale cercului.
Astfel, modelul propus al replicării
cromosomului circular bacterian a fost cel de
tip  (teta), datorită formei pe care o ia
cromosomul bacterian în timpul replicării.
Cromozomii liniari lungi din eucari-
oate conţin multiple origini; cele două furci
de replicare rezultate dintr-o anumită origine
avansează până întâlnesc furcile de replicare
dintr-o zonă vecină. Fiecare zonă deservită de
o anumită origine poartă numele de replicon.

Furci replicative care apar in decursul replicarii
Replicarea bidirecţională a
fost pentru prima dată pusă în evi-
denţă prin intermediul audioradio-
grafiei. Studiile de microscopie
electronică au demostrat existenţa
“ochilor” sau “buclelor” lucru care
dovedeşte implicit posibilitatea re-
plicării bidirecţionale.

Numărul de furci de replicare şi viteza lor de deplasare

Autoradiografia ADN-ului din celulele etichetate la intervale de timp diferite a
permis estimarea vitezei de deplasare a furcilor de replicare. În cazul Ecoli ciclul celular
este de aproximativ 30 de minute. Dat fiind faptul ca cromozomul circular al E.coli are 3
x 106 perechi de baze este replicat prin intermediul a două furci de replicare, rata de
deplasare a fiecarei furci este de aproximativ 1000 pb/s (pb = perechi de baze). Rata de
deplasare a furcilor în celulele umane este de 100 pb/s. Dat fiind faptul că întregul genom
uman are 3 x 109 perechi de baze care se replică în timp de 8 h, acesta trebuie sa conţina
cel puţin 1000 de furci replicative. Dacă există acest număr de furci replicative fiecare
trebuie să contribuie la replicarea a 106 pb. Rezultatele experimentale au demonstrat
faptul că aceste furci nu sunt aşa de îndepărtate. Furcile replicative funcţionează grupat,
la un moment dat putându-se evidenţia pe un cromosom existenţa mai multor furci care
funcţionează, în timp ce alte regiuni sunt în repaus. Astfel, originile de replicare sunt
activate grupat, câte 20-80 de origini. Grupurile de origini de replicare care sunt activate
simultan poartă numele de unităţi replicative. În timpul fazei S a ciclului celular, după ce
o unitate replicativă şi-a terminat activitatea, este activată următoarea, până in momentul
în care este replicată toată secvenţa de ADN. În cadrul unei unităţi replicative, fiecare
origine de replicare este separată de cealaltă printr-un spaţiu de 30.000-300.000 de
nucleotide.
 Iniţierea şi propagarea lanţului de ADN la nivelul furcilor de replicare
ADN-ul duplex este un helix antiparalel (cele doua lanţuri sunt opuse 3’5’
respectiv 5’3’ şi au polarităţi diferite). Toate polimerazele catalizează adăugarea
nucleotidelor la capatul 3’ al lanţului părinte, iar lanţul nou format creşte în direcţia
5’3’. Mai mult toate polimerazele descoperite până în prezent continuă secvenţa de noi
polinucleotide pornind de la o secvenţă de ADN sau ARN preexistentă.
ADN-ul dublu catenar este desfăcut de către proteina de iniţiere, helicaza, în
regiunile numite origini de replicare (OriC). Aceste regiuni se caracterizează printr-o
secvenţă specială de nucleotide, reprezentată de perechi de baze A-T. Aceste perechi
nucleotidice sunt mai uşor de clivat, deoarece ele conţin mai puţine legături de hidrogen,
faţă de perechile G-C. Ori C este recunoscuta şi de către proteina dnaA. Proteina dnaA
recunoaşte şi denaturează ADN-ul într-o regiune de 13 nucleotide în principal baze A sau
T. Această etapă este asistată şi de proteina HU. La această regiune se leagă proteina
dnaB (helicaza), proces asistat de o altă proteina dnaC (această proteină ajută la
împachetarea adecvată a proteinei dnaB pe furca de replicare). Din fiecare origine de
replicare pleacă două furci de replicare care se îndepărtează de locul de origine,
desfăcând dublul helix de ADN pe măsură ce înaintează. Deci, replicarea ADN-ului în
cromosomii procariotelor şi eucariotelor este bidirecţională.
După legarea helicazei, o nouă proteină, SSB (single-stranded DNA binding)
stabilizează ADN-ul monocatenar din bucla de replicare.
Primozomul, un complex de proteine (format din dnaB, dnaC, primaza şi alte
proteine), constituie elementul cheie al iniţierii. Acest complex se deplasează simultan cu
furca de replicare (consumând ATP-ul) şi este responsabil pentru sinteza unui segment de
ARN necesar replicării lanţului.
La nivelul furcii se află dispozitivul de replicare reprezentat de ADN-polimeraza,
enzimă care catalizează ataşarea de deoxiribonucleotide la capătul 3' al segmentului de
ARN iniţial, ulterior la capatul 3’ al lanţului de ADN în creştere. ADN-polimeraza nu se
disociază de ADN ori de câte ori adaugă un nou nucleotid pe lanţul de ADN în creştere,
dimpotrivă, ea rămâne ataşată pe ADN şi se mişcă pas cu pas de-a lungul lui timp de mai
multe cicluri ale reacţiei de polimerizare.
Deoarece, cele două catene ale dublului helixului sunt orientate în direcţii opuse,
furca de replicare este asimetrică. Astfel, una dintre noile catene de ADN este sintetizată
pe o matriţă parentală 3'5', iar cealată catenă este sintetizată pe o matriţă parentală
5'3'.
ADN-polimeraza poate cataliza creşterea catenei noi numai în direcţia 5'3',
întrucât adaugă noi nucleotide numai la capătul 3' al catenei parentale. Imediat după ce
replicarea s-a declanşat s-a introdus în mediu timidină marcată cu tritriu. S-a constatat
apariţia temporară la nivelul furcii replicative a unor fragmente scurte de ADN, lungi de
1000-2000 de nucleotide, denumite fragmente Okazaki.
Fragmentele Okazaki sunt sintetizate, discontinuu, în direcţie opusă sintezei
catenei prioritare (în ceea ce priveşte modul de ataşare al nucleotidelor acesta este
identic), şi mai târziu alipite prin intermediul ADN-ligazei, pentru a forma o catenă nouă,
neîntreruptă de ADN.
 Sinteza catenei întârziate se realizează întotdeauna în urma sintezei catenei
prioritare, întrucât fragmentele Okazaki rezultă numai după ce furca replicativă s-a
desfăcut cu un număr de nucleotide egal cu lungimea acestor fragmente.
Replizomul este un amsamblu de proteine care include enzimele şi factorii
necesari replicării ADN-ului. Acest complex este responsabil pentru sinteza a două
catene noi de ADN.
ADN polimerazele
ADN polimerazele au fost descoperite în extractele celulare datorită capacităţii lor
de a încorpora deoxinucleotide în ADN, utilizând trifosfaţii deoxinucleozidelor drept
substrat. Aceste enzime copie numai o matriţă de ADN preexistentă şi împerecherea
bazelor din noului lanţ sintetizat cu cele din lanţul părinte se face după aceleaşi reguli
postulate de Watson şi Crick. Iniţial ADN polimeraza a fost purificată din Ecoli şi mai
târziu din alte microorganisme. În toate cazurile s-a constatat faptul că enzima are nevoie
de un segment de start care posedă un capăt 3’-OH liber.
Trei ADN polimeraze (I, II si III) au fost purificate din Ecoli.
Deoarece bacteriile în care existau o mutaţie specifică pentru polimeraza III,
mutaţie sensibilă la temperatura, încetau să mai producă ADN la temperaturi mai mici s-a
acordat o atenţie deosebită acestei enzime, încercându-se să se obţină furci de replicare în
vitro.
ADN polimeraza I este importantă în corectarea erorilor care apar în procesul de
copiere al ADN-ului. Polimeraza de tip II joacă un rol în repararea ADN-ului în situaţia
în care acesta a suferit denaturări fizice sau chimice.
Odata ce polimeraza III este ataşată la ADN-ul matrită este dificilă desprinderea
enzimei, în timp ce polimerazele I şi II se detaşeaza de pe ADN-ul matriţă după
adaugarea unui segment de oligonucleotide. Polimeraza III împreună cu ceilalţi factori de
replicare poate sintetiza ADN în vitro la aproximativ 500 pb/secundă.
Ambele polimeraze (I şi III) posedă activitate exonucleazică (ADN polimeraza I
îndepărtează resturile de segment ARN). ADN polimerazele adaugă nucleotidele cu o
eroare de 1 la 10000. Datorită activităţii exonucleazice, ambele enzime pot îndepărta
nucleotidele “greşite” şi după aceea să adauge nucleotidele corespunzătoare. În acest fel
frecvenţa de apariţie a unuei erori este de o
nucleotidă într-un milion.
ADN polimeraza III din E.coli (vezi
figura) este o enzimă cu mai multe subunităţi,
cu o masa moleculara de peste 600 KDa.
Complexul se prezintă sub forma unui dimer
asimetric. Subunităţile ,  şi  formează
miezul polimerazei şi au rolul de a menţine
enzima pe lanţul matrice. Subunităţile  din
polimeraza III formează un inel care alunecă
pe ADN-ul matriţă.
În celule mamiferelor se află 5 tipuri de
polimeraze:  (multiplicarea ADN-ului nucle-
ar),  (rol în corectarea ADN-ului),  (replicarea ADN-ului mitocondrial),  (este polime-
raza principală care participă la procesul de replicare al ADN-ului eucariotelor; se
asociază cu proteina PCNA (eng proliferating cell nuclear antigen), proteina care
formeaza un trimer – un inel asemeni subunităţilor  din polimeraza III a E.coli) şi  (rol
neelucidat în replicarea ADN-ului).
Încheierea replicării se face prin intermediul situsurilor de terminare (Ter), porţi-
uni de circa 23 pb, care permit trecerea furcii de replicare numai într-o singura direcţie.
Situsurile Ter forţeaza cele două furci de replicare să se întâlnească numai într-un anumit
punct. La aceste situsuri se leagă o proteină monomeră (Tus, M 35 KDa), proteina care
se leagă Dna B (helicaza), inhibând astfel procesul de desfacere a ADN-ului duplex.
Digestia enzimatică
Endonucleazele de restricţie sunt enzime bacteriene ce recunosc specific anumite
secvenţe de ADN dublu catenar şi clivează ambele catene în interiorul sau în apropierea
situsului de recunoaştere. Lungimea enzimelor de restricţie este variabilă (între 150 AA
la PvuII şi 1250 AA la CjeI). Enzimele de restricţie protejează bacteriile faţă de infecţiile
virale, având astfel rolul unui sistem imunitar microbian. În lipsa enzimei de restricţie la
E coli, aceasta suferă o infecţie virală rapidă. Enzimele de restricţie sunt prezente în
combinaţie cu una sau două enzime de modificare (ADN-metiltransferaze), care protejea-
ză celula împotriva clivării propriului ADN de către enzima de restricţie cu care acesta se
asociază. Enzimele de modificare recunosc acelasi situs catalitic asemeni enzimei de
restricţie pe care o însoţesc, dar în loc de clivare, acestea metilează una din bazele azotate
la fiecare catenă. Gruparile metil pătrund în adâncitura majoră a ADN-ului la nivelul
situsului de restricţie. Enzima de restricţie împreună cu enzimele de modificare formează
împreuna un sistem de restricţie şi modificare (R-M). În anumite sisteme cele două
enzime acţionează independent una faţă de cealaltă. În alte sisteme, cele două
componente se prezintă sub forma a două subunităţi separate, ale unei enzime mai mari,
ce combină ambele activităţi catalitice (de restrictie şi de modificare).
Enzimele de restricţie sunt clasificate în funcţie de compoziţia subunităţii de
clivare, a situsului de restricţie, a specificităţii secvenţei şi a cofactorilor necesari. Enzi-
mele care fac parte din prima categorie sunt enzimele de tip I, care conţin subunităţi
multiple care se prezintă sub forma de combinaţii R-M şi care taie ADN-ul aleator faţă de
secvenţele de recunoaştere. În categoria enzimelor de tip II se găsesc enzime care taie
ADN-ul în apropierea sau în interiorul secvenţei de recunoaştere. Aceasta generează
fragmente de restricţie discrete, fragmente care migrează diferit în geluri de agaroză
(electroforeză orizontală) faţă de cel neclivat. Cele mai cunoscute enzime de tip II sunt
HhAI, HindIII, Not I, care taie în interiorul secvenţei de recunoaştere. Enzimele de acest
tip sunt cele mai des utilizate. De exemplu, enzima NotI recunoaşte următoarea secvenţă:
5’-GCGGCCGC-3′
3′-CGCCGGCG-5′
NotI taie ADNul uman în medie la fiecare 10 Mb.
Majoritatea enzimelor de restricţie de tip II recunosc secvenţe de ADN care sunt
simetrice deoarece ele se cuplează la ADN sub forma de dimeri, în timp ce unele se
cuplează sub forma de heterodimeri deoarece recunosc secvenţele de ADN asimetrice
(BbvCI). Unele recunosc secvenţe continue (EcoRI-GAATTC), în care cele două
jumatăţi de recunoaştere sunt adiacente, în timp ce altele recunosc secvenţe discontinue
(Bgl I recunoaşte secvenţa GCCNNNNNGGC) în care cele două situsuri sunt separate.
Asemeni multor altor endonucleaze de restricţie EcoRI scindează ADN-ul la situsul de
restricţie din secvenţa palindromică. EcoRI scin-
dează legăturile fosfodiesterice din ambele catene
ale ADN-ului între G şi A. Resultă două capete
monocatenare complementare (AATT), care iniţi-
al erau în contact una cu cealaltă. Acestea pot fi
separate la încălzire, dar pot fi realiniate la
temperaturi mai mici. Situsurile scindate pot fi
din nou realipide cu ajutorul unei enzime numită
ADN ligaza. Prin clivare se genează un capăt
hidroxil 3’ şi unul fosfat 5’. Activitatea enzimelor
se face în prezenţa magneziului (enzima de
restricţie) şi a S-adenozil-metioninei (enzima de
modificare corespunzătoare).
Clonarea ADN-ului
Majoritatea segmentelor de ADN (de pe
gene) se găsesc în cantităţi mici în celulă. Pentru
Scindarea ADNului dublu-catenar cu
a lucra experimental cu ADN-ul este nevoie de o ajutorul enzimei de restrictie EcoRI
cantitate mare de copii (clone). Procedura clasică de
clonare a ADN-ului se bazează pe abilitatea bacteriilor de a prelua şi replica secvenţe
relativ mici de ADN circular cunoscute sub numele de plasmide.
Segmentul care trebuie copiat trebuie taiat din ADNul amplificat (prin intermediul
tehnicii PCR) cu ajutorul enzimelor de restrictie
O hartă de restricţie reprezintă o secvenţă liniară sau circulară pe care sunt
reprezentate situsurile particulare pentru enzimele de restricţie. Distanţa dintre aceste
situsuri de restricţie este măsurată în funcţie de numărul perechilor de baze din ADN sau
ARN. În cazul în care molecula de ADN este tăiată cu o enzimă de restricţie
corespunzătoare aceasta este scindată în fragmente distincte. Aceste fragmente sunt
separate pe baza mărimii cu ajutorul gelurilor de agaroză sau poliacrilamidă. Construirea
unei hărţi de restricţie necesita folosirea mai
multor enzime de restricţie. În unele tehnici, se
foloseşte o grupare fosfat radioactivă la
capatul 5’ sau 3’ al secvenţei scindate.
În situaţia simplă în care vectorul
(plasmidul) este deschis (scindat) cu ajutorul
enzimei de restricţie EcoRI şi recircularizarea
se face după adăugarea fragmentului de ADN
izolat, fragment care posedă capete comple-
mentare cu ale plasmidei. Astfel după alipirea
acestui fragment de ADN rezultă o plasmidă
nouă. Prin preîncălzirea unui număr de celule
bacteriene cu ADN-ul circular modificat unele
dintre acestea pot prelua plasmidul nou şi să îl
replice ca pe propriul ADN. Pentru a fi siguri
de faptul ca bacteria gazdă conţine plasmidul
Obtinerea unui plasmid recombinat cu în scopul replicării aceşti plasmizi conferă
ajutorul enzimelor de restrictie
suplimentar şi rezistenta acestei gazde la diverse antibiotice. În cazul în care bacteriile
sunt incubate în prezenta acelor antibiotice, numai celulele care vor conţine plasmidul
nou se vor replica. Plasmidul este izolat mai târziu din celule, scindat cu enzima de
restricţie EcoRI şi fragmentele sunt separate utilizând electroforeza. Fragmentele de
interes pot fi identificate după mărime şi extrase din gelul de agaroză pentru experimente
ulterioare.