N 6

UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION
FACULTAD DE INGENERIA
ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE AMBIENTAL
INTRODUCCIÓN:
La calidad microbiológica del agua se evalúa en todo el mundo para proteger la salud humana y la
biodiversidad en el medio ambiente acuático. La detección y cuantificación de microorganismos
patógenos en el agua es importante para reducir los riesgos asociados a la salud pública y tomar las
acciones más adecuadas para prevenir la transmisión de enfermedades. Varios microorganismos
indicadores de la contaminación fecal se utilizan para evaluar la calidad y la seguridad de los distintos
tipos de agua. Enterococcus está recibiendo una amplia aceptación como indicador muy útil en la
determinación de la calidad microbiológica del agua, debido a que siempre están presentes en las
heces de los animales de sangre caliente, son incapaces de multiplicarse en las aguas y sobreviven
largos períodos en condiciones adversas de la naturaleza. Algunos estudios realizados con aguas
recreativas y potables consideran que los enterococos son indicadores más estables que Escherichia
col y los coliformes fecales. Existen dos métodos estándar para la detección de enterococos en aguas:
la técnica de fermentación de tubos múltiples (NMP = Número Más Probable) y la técnica de filtración
por membrana (FM). El método FM ha sido recomendado para la enumeración de enterococos en
varios tipos de muestras de agua y puede ser utilizado para analizar grandes volúmenes de muestra, y
es más rápido que el procedimiento NMP. Se han desarrollado diferentes procedimientos para la
detección de enterococos en aguas. La mayoría de ellos utilizan medios de cultivo selectivos que
contienen ingredientes como la azida de sodio y las sales biliares para inhibir el crecimiento de otros
microorganismos. Por otra parte, muchos de ellos requieren un aislamiento primario y
posteriormente una etapa de confirmación, lo que compromete la capacidad de tomar la acción más
apropiada. En la actualidad se han desarrollado medios de cultivo cromogénicos para la detección de
la actividad β-D-glucosidasa presente en Enterococcus. Estos constituyen herramientas útiles para la
enumeración y detección específica de enterococos en agua y contienen mezclas de sustratos
cromogénicos que son escindidos por ciertas enzimas producidas por el microorganismo, dando como
resultado colonias bacterianas de diferentes colores, proporcionando una identificación más simple y
rápida, ya que no requieren pruebas adicionales, lo que permite obtener los resultados en menos
tiempo y con gran precisión, en comparación con los métodos tradicionales.
OBJETIVOS:
Objetivo General:
 Determinar si hay presencia de microorganismos aerobios o coliformes fecales en el agua para
el consumo humano.
Objetivos Específicos:
 Aprender la correcta realización de análisis para el estudio de las aguas
 Determinar si el agua está apta para el consumo humano.
MATERIALES:
 Tubos de ensayo
 Cajas de Petri con agar
 Asa y aguja de inocular
 Mechero
 Agar Endo
 Agar MacConkey
 Algodón
 Masking tape
 Muestra mixta
 Contador de colonias
 Pipetas
 Encubadora
 Guantes quirúrgicos
MARCO TEÓRICO:
Determinación de la Calidad Sanitaria:
El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y sabores, pero estar aún contaminada.
Obviamente, se necesitan procedimientos especiales para determinar su calidad sanitaria.
Investigaciones sanitarias:
La investigación de los sistemas productores de agua por sanitarios e ingenieros calificados se llaman
investigaciones sanitarias. Estas incluyen la inspección de
a. La fuente sin tratar y las condiciones que influyen en su calidad
b. Las operaciones de la planta purificadoras o la construcción del pozo, y
c. El mecanismo para la distribución del líquido a los consumidores.
Las investigaciones sanitarias revelan si el agua se está produciendo en las condiciones estipuladas.
Pruebas Bacteriológicas de Contaminación:
Se presupone que el objetivo de los análisis rutinarios son para determinar la existencia de
microorganismos patógenos en el agua. Sin embargo, esto no es verdad, por las siguientes razones:
1. Los organismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo,
por lo tanto, pueden no estar en una muestra que se envíe al laboratorio.
2. Si se encuentran en pequeñas cantidades, pueden pasar desapercibidos a los procedimientos

empleados.
3. Se necesitan 24 horas o más para obtener resultados de los exámenes y si se encuentran

microorganismos patógenos, muchas personas pueden haber tomado agua antes de que se
conozcan los resultados, y así haberse expuestos a la infección.
Puestos que los exámenes de laboratorio para encontrar microorganismos patógenos en el agua
tienen las desventajas enumeradas, se han desarrollado técnicas para detectarlas en las excretas,
particularmente las del grupo coliforme.
Este propósito ha probado ser satisfactorio en la práctica y tiene las siguientes ventajas:
1. Los microorganismos coliformes, sobre todo E. Coli, habitan constantemente en el intestino
humano en grandes cantidades.
2. Estos microorganismos viven más tiempo en el agua que los patógenos.

3. Obviamente, una persona sana en general, no elimina microorganismos patógenos, pero

puede desarrollársele una infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en las
materias fecales.
Las especies clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. La relación de estos
microorganismos con otros del grupo entérico Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas y
alcaligenes, todos los cuales son bacilos gramnegativos no esporulados.
Como estas especies tienen gran semejanza en su aspecto morfológicos y características de cultivo, es
necesario recurrir a pruebas bioquímicas para diferenciarlas. Reacciones que tengan las siguientes
cuatro características son muy importantes para lograr este propósito:
1. Capacidad para producir Indol. E. Coli lo produce, y Ent. Aerogenes no.
2. Cantidad de ácido producida en un medio especial de caldo glucosado, adicionado del

indicador rojo de metilo. Los dos microorganismos producen ácido de la glucosa. Sin embargo, E.
Coli produce pH más bajo, lo que hace que vire al rojo de metilo mientras que Ent. Aerogenes no
cambia el color.
3. Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un medio de peptona glucosado. Este

compuesto químico se detecta por medio de la reacción de Voges Proskauer. E. Coli no produce
acetilmetilcarbinol mientras que Ent. Aerogenes sí lo hace.
4. Utilización de citrato de sodio. Ent. Aerogenes es capaz de utilizar el citrato de sodio como su
única fuente de carbono, esto es, se desarrollará en un medio de cultivo químicamente definido
en el cual el citrato de sodio es el único compuesto de carbono. E. Coli no se desarrolla en estas
circunstancias.
Por conveniencia, a estas pruebas se las ha designado en forma colectiva reacciones IMViC (I = Indol,
M = rojo de metilo, Vi = reacción Voges – Proskauer y C = citrato).
Es necesario cuidar los siguientes detalles cuando se sometan muestras de agua a análisis
bacteriológicos:
1. La muestra se tomará en frasco estéril.
2. La muestra ha de ser representativa de la fuente original.
3. Se evitará la contaminación de la muestra durante y después de obtenerla.
4. La muestra se analizará lo más pronto posible.
5. Si no es posible examinar la muestra enseguida, deberá guardarse en refrigeración entre 0 y

10 ºC.
Los procedimientos bacteriológicos de rutina son:

a. Cuenta en placas para determinar el número de bacterias.
b. Pruebas que revelen la presencia de bacterias coliformes
Cuenta estándar en placa:

Se efectúan cuentas de colonias después de haber sembrado en la placa cantidades alícuotas de la
muestra. La cuenta estándar en placa no se recomienda en el caso del agua porque la que contiene
pocas bacterias patógenas obviamente es más peligrosa que las que contiene muchas saprofitas. Sin
embargo, lo cual el agua es de buena calidad tenga cuentas bajas, menos de 100 por mililitro.
Pruebas para determinar la presencia de bacterias coliforme:
Varios medios selectivos diferenciales facilitan mucho el proceso para examinar muestras de agua en
busca de microorganismos coliformes, el examen supone tres pasos sucesivos:
a. Prueba de presunción
b. Prueba de confirmación
c. Prueba de consumación.
Técnica de filtración por membranas:

Consiste en los siguientes pasos; un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.
Se hace pasar un volumen de agua por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en la superficie
de la membrana.
Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorbente que previamente se ha
saturado con el medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los discos filtrantes se
acomodan en cajas de Petri de tamaño especial, las cuales se incuban.
Después de la incubación se desarrollarán colonias sobre el disco filtrante en cualquier lugar donde
hayan quedado bacterias atrapadas durante el proceso de filtración.
Esta técnica tiene muchas aplicaciones útiles, unas de las cuales son:
1. Se pueden examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier volumen de
agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedarán
en el disco.
2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar

los microorganismos.
3. Se obtienen resultados más rápidos que con los métodos convencionales.
4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias, como coliformes, cuando se

usan los medios apropiados.
Microorganismos deferentes de las bacterias coliformes:

Muchas bacterias de los sistemas de aguas son denominadas bacterias indeseables porque crean
problemas de olor, color, sabor y la precipitación de compuestos insolubles en las tuberías los cuales
reducen u obstruyen el paso del líquido.
Estreptococos fecales:
Los estreptococos fecales son bacterias entéricas que viven en el intestino de los animales de sangre
caliente y del hombre. Streptococcus faecalis es representante de este grupo; otras especies son S.
Faecium, S bovis y S. Equinus. Debido a que S. Faecalis, abunda en el intestino grueso del hombre, su
presencia en el agua significa contaminación fecal.
Recuento por dilución:
Con esta técnica se logra una estimación del número de bacterias en la población, que pueden
multiplicarse en un medio líquido. Cualquier medio puede emplearse, siempre que fomente el
crecimiento de los microorganismos por estudiar.
El recuento por dilución es más exacto si se inoculan varios tubos de medios de cultivos en porciones
de 1 ml de cada dilución. Varias porciones de las diluciones críticas, en estas circunstancias, contienen
un microorganismo viable y otras no lo contienen. Se han calculado tablas para saber en un momento
dado el número más probable de bacterias en la muestra.
Características sanitarias del agua potable:
Para ser potable, es necesario que el agua sea limpia, fresca, sin sabores u olores desagradables o que
causen rechazo de quien las consumen, y sin sustancias químicas y microorganismos nocivos. De estas
características deseadas la más difícil de lograr es la falta de microorganismos nocivos. No es
imposible, pero entraña vigilancia constante y valoración o análisis repetidos.
El problema se intensifica dado que la eliminación de aguas negras suele ser completada el eliminar el
líquido sobrenadante en grandes cantidades de agua, y la necesidad suele hacer que las mismas
aguas en que se eliminaron las otras, se empleen como fuentes de agua potable por otras
comunidades.
Bacterias que indican contaminación:
El método ideal de analizar el agua respecto a la seguridad o sanidad bacteriológica incluye la
búsqueda de patógenos transmitidos por el agua.
El agua que contenga pocos patógenos por litro puede estar lo suficientemente contaminada para
causar algunos casos de enfermedad. Si la excreta de una persona enferma de fiebre tifoidea se
eliminan y llegan a un depósito empleado para contener agua potable, pueden aparecer casos de
fiebre tifoidea. Los patógenos son bastante pocos y están dispersos, y es necesario examinar grandes
muestras para observar un microorganismo patógeno.
Se han empleado varios grupos de bacterias que aparecen normalmente en el intestino del hombre o
los animales para indicar la contaminación del agua potable por aguas negras: los denominados
estreptococos fecales, algunos anaerobios esporógenos y las bacterias coliformes. Las bacterias
coliformes son los indicadores de contaminación más empleados, especialmente en los Estados
unidos de Norteamérica.
Bacterias coliformes:
Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y
fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en características pequeñas;
se diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen seis. Se sabe que
dos aparecen con frecuencia suficiente como para mencionarse: E. Coli y Aerobacter aerogenes.
Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gramnegativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y
gas. Son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.
Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un
centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con
luz refleja. Las colonias de A. Aerogenes en el mismo medio son mayores, muy mucoides, y de color
Rosado; con frecuencia tienen un centro parduzco pequeño.
Análisis sanitario del agua:
El diagnostico o determinación de las bacterias coliformes en las muestras de agua se basa en la
capacidad de dichos microorganismos para producir gas a partir de lactosa. Se inocula parte de la
muestra (cinco partes de 10 ml cada una) en tubos de fermentación de lactosa y se incuban a 37 ºC
durante 48 horas. Se observan los tubos después de 24 y 48 horas, y la aparición de gas en ambos
periodos constituye una prueba positiva de presunción.
Bacterias distintas de las coliformes pueden producir gas en lactosa; en consecuencia, se necesita
aislar las especies que fermentan la lactosa, cosa que suele hacerse al inocular la superficie de placa
de agar E.M.B. con muestras de uno o más tubos de fermentación que contengan gas. El aspecto de
las colonias coliformes típicas es una prueba positiva confirmada. Después de ello se hace el paso de
una o más colonias (típicas, si las hay; de lo contrario cualquier colonia sospechosa) a tubos de
concentración de lactosa, y placas inclinadas de agar y se incuban durante 24 horas. Gas en el tubo de
lactosa y la coloración de Gram en la placa inclinada de agar que, indique bacilos gramnegativos sin
esporas, harán que el resultado se designe como prueba positiva completa con respecto a bacterias
coliformes.
Purificación de Agua, Protección de las Fuentes Hídricas:
El primer paso para lograr la obtención de agua pura sea para una casa aislada, para toda una ciudad,
es proteger las fuentes de agua contra la contaminación por aguas negras o desechos. Es necesario
que las fuentes o pozos estén situados a distancias importantes de los estanques sépticos, establos y
otras fuentes de contaminación; es necesario que estas construcciones de abasto hídrico estén
hechas con cuidado para impedir filtraciones del agua superficial y conviene cubrirlas con una capa
de concreto.
Filtración
La filtración es un medio eficaz para eliminar microorganismos y otras sustancias de suspensión del
agua. Se emplean en la filtración de agua a gran escala dos tipos de filtro de arena.
Los filtros lentos de arena están hechos de capas de arena fina, arena gruesa, grava y roca. El agua
pasa lentamente por el filtro, y bacterias, algas, protozoos son captados en las capas superficiales de
la arena fina. Estos microorganismos se multiplican y producen una masa gelatinosa en la que se
absorben otros microorganismos y partículas de suspensión.
Parámetros Microbiológicos para Determinar la Calidad del Agua.
Ya KOLKWITZ y MARSSON (1908) utilizaron bacterias, además de otros seres vivos vegetales y
animales, como organismos indicadores de la calidad de las aguas y mencionan también diversas
especies que toman parte en las distintas etapas de la descomposición -por ejemplo, Zoogloea
ramigera y Sphaerotilus natans.
Es preciso hallar el número de gérmenes saprofitos o de colonias y de bacterias procedentes del
intestino humano como indicadores de contaminación fecal (BONDE, 1977; DAUBNER y PETER, 1974;
COL, 1975). A este respecto, conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y
coliformes, así como el título colimétrico. Son bacterias coliformes las pertenecientes a las
enterobacteráceas que fermentan la lactosa con producción de gas y ácido (H2, CO2). Pertenecen a
los géneros Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.
Para determinar el número de estas bacterias, se suele emplear el medio selectivo de Endo (agar-
fucsina-sulfito-lactosa). Después de 24 – 48 horas de incubación a 37 ºC, se halla el número total de
coliformes y a 44 ºC el de coliformes fecales. La declaración obligatoria de estos gérmenes requiere su
diferenciación por medio de las pruebas bioquímicas correspondiente (serie colorimétrica, prueba
IMViC; DAUBNER, Y PETER, 1974; REICHARDT 1978).
En la mayoría de los países se han admitido los límites máximos admisibles para el agua potable, la de
uso doméstico y la de baño. La primera no debe contener ningún agente patógeno, así se considera
cuando en 10 ml de agua no se encuentran gérmenes coliformes y, por tanto, no estén presente
tampoco la especie Escherichia coli. Para las aguas de baños tienen validez los siguientes requisitos de
calidad en varios países (Comunidad Económica Europea): el número total de coliforme debe ser, en
lo posible, inferior a 500 y en todo caso no llegará a 10.000 por 100 ml – el de coliforme fecales,
menor de 100 y 2.000, respectivamente, por 100 ml de agua. El primer número tiene valor indicativo,
el segundo es de cumplimiento obligatorio. Si se llega a este en más del 20 % en los análisis de las
muestras tomadas durante 14 días por lo menos, es necesario prohibir el baño en las aguas afectadas.
Como complemento de la cantidad de gérmenes coliformes, a veces se determina el número de
estreptococos fecales (enterococos) (RITTER, 1974), que es generalmente más bajo que el de
aquellos. Si el número de esto estreptococos es elevado, hay que pensar en una contaminación fecal
reciente.
Estimación del Número más Probable (NMP):
Se basan estos métodos en la presunción de que las bacterias se hallan normalmente distribuidas en
un medio líquido, esto es, en las muestras repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, debe
esperarse contengan el mismo número de gérmenes como promedio; naturalmente, algunas de las
muestras pueden contener algunos gérmenes más o menos. La cifra media es el número más
probable (Most Probable Number o MPN).
Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de
MacConkey, pero puede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras líquidas si puede
observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez y producción de ácido. Ejemplos de
ellos son las levaduras y hongos en jugos y bebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos,
cadenas de esporos en suspensiones de harina.
Agar MacConkey:
Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo; contiene violeta cristal para
inhibir el crecimiento de cocos grampositivos y rojo neutro como indicador de pH, que le otorga
propiedades diferenciales. Los bacilos gramnegativos desarrollan fácilmente ; los fermentadores de
lactosa producen metabolismo ácidos que disminuyen el pH de medio próximo a la colonia. En esa
zona el rojo neutro vira al rojo. Los no fermentadores de lactosa permanecen incoloros y translúcidos.
PROCEDIMIENTOS:
Muestreo 1
Materiales
 Muestra
Agua almacenada
 Material por equipo

Frasco de boca ancha con tapón esmerilado Papel
Kraf
1 pipeta de 1mL
 Reactivos
Solución de tiosulfato de sodio 10%
Etanol
Algodón
Metodología
a) Preparación de los frascos
1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabón o detergente:
2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)

3. Colocar una tira de papel kraf de 1 x 5cm entre tapón y cuello (frascos refractarios con tapón
esmerilado)
4. Cubrir el tapón y el cuello del frasco con papel krafin
5. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
b) Toma de la muestra
1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%

2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodón y etanol y dejar correr el agua por 3
minutos.
3. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo.
4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.
5. Para la recolección de agua a partir de depósitos naturales y cuerpos receptores, retirar la
cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua 30cm.
6. Destapar y llenar contra corriente o moviéndolo al frente, llenar hasta 2/3 del recipiente y
tapar inmediatamente.
7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos.
8. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes de que
transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
1ª sesión
Técnicas de Dilución y vaciado en placa, NMP, y Filtración.
Materiales
 Material por equipo 2

mecheros
Tripié y tela de asbesto
Gradilla
Equipo Millipore estéril
Accesorios de equipo Millipore
 Medios de cultivo
1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estándar.
5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración (3X) 1 caja
con Agar Bilis Rojo Violeta
 Material de los alumnos

3 tubos con 9mL de solución salina estéril
Pipetas serológicas de 10, 5 y 1mL estériles
10 cajas petri estériles de vidrio o plástico estériles
 Muestras requeridas
Agua de sabor (10mL)
Hielo raspado (600mL)
Metodología
a) Determinación de mesófilos aeróbios
1. Homogenizar la muestra de agua de sabor.

2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI.
3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilución en cada caja de Petri estéril (esquema 1).
Realizar cada dilución por duplicado.
4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estándar, fundido y
enfriado a 45°C, homogenizar y dejar solidificar.
5. Etiquetar cada una de las cajas.
6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control.
7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35°C durante 24 horas.
8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250.
Esquema 1
1mL 1mL
Muestra
Homogenizar
1mL 10-1 10-2
1mL 1mL
20mL
Agar cuenta
estándar
Control
b) Determinación del NMP de coliformes en agua o hielo potables (esquema general)
37°C
24 - 48 h
Siembra con asa bacteriológica de los tubos CLSS

Tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de + 20.0mL de muestra positivos (producción de gas) en caldo
sodio (CLSS) triple concentración (3X)
lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37°C 44.5°C
24 – 48 h
24 – 48 h
ME1515 – 2012/2 - Práctica 7 - página 7

Tubos con 10.0mL de Lectura de tubos positivos en Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en
caldo lactosa verde tablas. NMP de coliformes caldo EC o EC-MUG
tablas. NMP de coliformes
brillante bilis 2% totales /100mL de muestra fecales /100mL de muestra.
Siembra de tubos positivos en

placas de Agar EMB para la
búsqueda de Escherichia coli
ME1515 – 2012/2 - Práctica 7 - página 7

Técnica de filtración:
1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta con los siguientes datos:
1515-11-# de equipo
Filtración (muestra)
dd/mm/aa
2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones de
asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato,
colocar una membrana de 0.45m estéril sobre la base del filtro conector. Las pinzas de
punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana.
3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra líquida solicitada,
si presenta partículas en suspensión filtrar previamente con algodón y gasa.
4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo pasado
todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de Petri
con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie para favorecer la adherencia
de la membrana.
7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a 37ªC
durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en refrigeración.
2ª sesión
Resultados de técnicas de NMP, Dilución y vaciado en placa, y Filtración.
Materiales
 Por equipo
2 gradillas
2 asas
 Por grupo
3 cuentacolonias
5 tubos con 10.0mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2% 5
tubos con 10.0mL de caldo EC
2 cajas con agar EMB
Metodología
a) Interpretación de resultados de la técnica de dilución y siembra por vertido en placa.
1. l término del periodo de incubación, hacer el recuento de UFC (Unidades Formadoras de

Colonias), para ello:
a. Seleccionar las cajas de la dilución cuyo número de colonias oscile entre 25 y 150
UFC
b. Contar el número de colonias con ayuda de un cuentacolonias.
2. Multiplicar el promedio por el inverso de la dilución para obtener las UFC/mL de muestra.
3. Promediar el número de colonias de las cajas que cumplan con el criterio establecido.
4. Revisar la caja testigo para descartar cualquier tipo de contaminación. En caso de haber
desarrollo en la caja, la prueba deberá ser invalidada.
b.2) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a

tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
3. Incubar a 35  2C durante 24 a 48 horas.
4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 horas.
5. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos
coliformes totales/100mL.
b.3) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales
1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a

tubos con caldo EC.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
3. Incubar a 44.5  0.1C en incubadora o un baño de agua con circulación durante 24 a 48
horas.
4. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de
gas después de un período de incubación de 24 a 48 horas.
5. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos
coliformes fecales/ 100mL.
 Control de calidad para coliformes fecales

1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.
c) Interpretación de resultados de la técnica de filtración:
1. Contar las colonias que desarrollaron en la membrana y anotar los resultados.

2. Ubicar la presencia de colonias rojas (lactosa positiva).
3. Utilizar un cuentacolonias para contar las colonias con las características antes descritas y
calcular el número de UFC/100 mL de muestra.
4. Consultar la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, que señala los límites permitidos
de bacterias coliformes fecales y confirmar si el agua analizada reúne y cumple con lo
establecido.
3ª sesión
Identificación de bacterias coliformes
Materiales
 Por equipo
2 gradillas
2 asas
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
1 caja con Agar Cuenta Estándar o BHI 2
tubos con medio SIM
4 tubos con caldo RMVP
2 tubos con Agar Citrato de Simmons
Solución salina isotónica
Metodología
b.4) Prueba confirmativa para Escherichia coli
1. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría cruzada
en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
2. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 horas.
3. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con
centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar
una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta
estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
4. Incubar las placas a 35°C por 18-24 horas.
5. Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o
cocobacilos Gram-negativos.
b1.4.1) Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC)
A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en 2mL de
solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.
a. Producción de indol (I)

 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona, incubarlo
a 35°C por 24 ± 2 horas.
 Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich.
 La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera como prueba
positiva para la presencia de indol.
b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP,
incubar a 35°C por 48 ± 2 horas.
 Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
 Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es
una prueba negativa.
 c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP,
incubar a 35°C por 48 ± 2 horas.
 Finalizada la incubación, adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agitar y
0.2mL de solución alfa- nafol (VP2 ) y agitar.
 Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva
cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilización del citrato (C)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo citrato
de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35°C por 96 horas.
 El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser, se
considera una prueba positiva.
4ª sesión
Técnicas Redox, Turbidimetría y Microscopia.
Materiales
 Por equipo
2 mecheros 1
gradilla
1 microscopio
1 objetivo micrométrico
1 ocular micrométrico
1 juego de colorantes de Gram
 Material que deben tener los alumnos

Portaobjetos
2 tubos de ensayo con tapón de rosca estériles
4 pipetas serológicas estériles. 4
tubos con SSI estériles
 Material y equipo por grupo

Solución de resazurina (diazoresorcinol)
Solución de azul de metileno tiocianato
Baño de agua a 37° C
5 matraces nefelométricos
 Azul de metileno
Calidad Tiempo de incubación en el que se presenta Número de bacterias/mL
la decoloración
Excelente No se decolora en 5.5 h < de 500 000
Buena Se decolora entre las 2 y 5.5 h 500,000 a 4 000 000
Mala Se decolora entre los 20 minutos y 2 h 4 a 20 millones
Muy mala Se decolora en 20 minutos > de 20 millones
 Resarzurina
Calidad Coloración de la resazurina
Excelente Violeta
Buena Violeta rosado
Mala Rosa
Muy mala Decoloración total
d) Técnica turbidimétrica.
1. Inocular 24 horas antes cuatro de los cinco matraces de caldo nutritivo con una cepa de
levadura e incubar a 28ºC en agitación.
2. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de levaduras, insertar el tubo lateral en
el nefelómetro y tomar la lectura en Unidades Klett, emplear como blanco el matraz sin
inocular.
3. Determinar las Unidades Klett en el resto de los matraces y en la curva de Mac Farland.
4. Graficar la curva de Mac Farland: UK en el eje Y y número de microorganismos en el eje X.
5. Determinar la ordenada al origen (0) y la pendiente de la recta.
6. Determinar el número de microorganismos en las muestras problema.
7. Asignar un matraz por mesa y a partir de este realizar tres diluciones decimales.
8. Inocular por duplicado 0.1mL de la dilución 10-3 en una caja con agar PDA y extender con
varilla de vidrio.
9. Incubar a 28ºC durante 48 horas.
Cultivo de Nefelómetro Curva de Mac Farland
levaduras
UK
1mL
1mL Número de
1mL
microorganismos
0.1m
L
10-1 10-2 10-

3 Vaciado
en placa
Cuenta de Breed
e)Recuento microscópico (cuenta de Breed).
1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2

2. Agitar la dilución de 10-1 hasta homogenizar completamente.
3. Con un asa calibrada o una micropipeta tomar 0.01mL de la leche y transferirlo al
portaobjetos en el área marcada. Extender la muestra y dejar secar al aire.
4. Fijar con calor y teñir con cristal violeta de Gram 1 minuto.
5. Lavar con agua. Dejar secar al aire.
6. Observar en el microscopio con objetivo de inmersión y contar el número de
7. microorganismos por campo, obteniendo el promedio de 5 campos.
8. Calcular el factor microscópico (FM): medir el diámetro del campo microscópico por medio
del micrómetro objetivo, en mm.
9. Determinar el área del campo: elevar el radio al cuadrado y multiplicar por 3.1416. Dividir
este resultado entre 100 para obtener el área del campo en centímetros cuadrados.
10. Determinar el número de dichos campos en 2 cm2, dividiendo 2 cm2 entre el área del campo
obtenido antes.
11. Calcular el número de levaduras/mL en el matraz.
12. De ser necesario repetir la operación con la dilución 10-2.
0.01m Tinción Observar Contar de
L simple con 5 a 10
Cristal
Violeta campos y
obtener un
Área de la promedio.
muestra
10-2 A= (b x a)
Área del campo / área de la muestra = FM

Campo
microscópico Factor microscópico o factor de dilución
A=( x r2)/2
CUESTIONARIO:
¿EN QUE TIPO DE AGUA SE UTILIZA PARA SU ANALISIS EL FILTRO DE MEMBRANA EN EL
PERU?
En el Peru se usara el filtro de membrana en aguas residuales, La presencia de

Escherichia coli indica contaminación fecal en agua, ya que este microorganismo es
habitante normal del tracto digestivo de animales de sangre caliente y rara vez se
encuentra en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo d contaminación fecal, por
ello se considera como indicador universal. Este microorganismo genera una alerta a
cualquier sistema de suministro de agua ya que su presencia por si sola puede generar
gastroenteritis y causar la muerte como el caso de la cepa E coli O157:H7 o puede
sugerir la presencia de otros microorganismos altamente patógenos como son la
Salmonella, Shigella, Klebsiella, Listeria etc. La identificación de Coliformes totales es
más difícil ya que estos pueden provenir de suelo, y de superficies de agua dulce por lo
que no siempre son intestinales. La presencia de Coliformes sugiere fallas en la eficacia
del tratamiento y la integridad del sistema de distribución. La identificación de las
cepas aisladas puede a veces dar una indicación sobre el origen.
La filtración por membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan en la

superficie de la membrana microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del
poro 0.45 um, esto gracias a que una bomba eléctrica ejerce una presión diferencial
sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los contaminantes de tamaño menor
que el específico del poro atraviesan la membrana o se quedan retenidos en su interior,
las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego está es llevada a un
medio de enriquecimiento selectivo, en el Peru se utiliza el medio de cultivo
Chromocult el cual promueve el crecimiento y la identificación.
¿SEGÚN EL ANALISIS REALIZADO EL AGUA DE PASCO SE CONSIRERA POTABLE O NO Y

POR QUE?
Según el Análisis el agua de Pasco no es considerado potable debido que al analizar en

la práctica , pudimos encontrar bacterias y microorganismos.
Para nosotros poder considerar potable ae tiene que considerar varios requisitos de los
cuales es mas importante que este libre de bacterias y microorganismos
para poder comprobar puede hacerse el estudio de filtro de membrana y recuento de

colonias.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION

 Determinar si el agua está apta para el consumo humano.

b. Las operaciones de la planta purificadoras o la construcción del pozo, y

c. El mecanismo para la distribución del líquido a los consumidores.

2. Si se encuentran en pequeñas cantidades, pueden pasar desapercibidos a los procedimientos

3. Se necesitan 24 horas o más para obtener resultados de los exámenes y si se encuentran

2. Estos microorganismos viven más tiempo en el agua que los patógenos.

3. Obviamente, una persona sana en general, no elimina microorganismos patógenos, pero

2. Cantidad de ácido producida en un medio especial de caldo glucosado, adicionado del

3. Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un medio de peptona glucosado. Este

2. La muestra ha de ser representativa de la fuente original.

3. Se evitará la contaminación de la muestra durante y después de obtenerla.

4. La muestra se analizará lo más pronto posible.

5. Si no es posible examinar la muestra enseguida, deberá guardarse en refrigeración entre 0 y

Los procedimientos bacteriológicos de rutina son:

b. Pruebas que revelen la presencia de bacterias coliformes

Cuenta estándar en placa:

Técnica de filtración por membranas:

2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar

3. Se obtienen resultados más rápidos que con los métodos convencionales.

4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias, como coliformes, cuando se

Microorganismos deferentes de las bacterias coliformes:

 Material por equipo

a) Preparación de los frascos

1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabón o detergente:

2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)

1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%

Técnicas de Dilución y vaciado en placa, NMP, y Filtración.

 Material por equipo 2

 Material de los alumnos

10 cajas petri estériles de vidrio o plástico estériles

a) Determinación de mesófilos aeróbios

1. Homogenizar la muestra de agua de sabor.

1mL 10-1 10-2

Siembra con asa bacteriológica de los tubos CLSS

ME1515 – 2012/2 - Práctica 7 - página 7

Siembra de tubos positivos en

ME1515 – 2012/2 - Práctica 7 - página 7

Resultados de técnicas de NMP, Dilución y vaciado en placa, y Filtración.

a) Interpretación de resultados de la técnica de dilución y siembra por vertido en placa.

1. l término del periodo de incubación, hacer el recuento de UFC (Unidades Formadoras de

b.2) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a

b.3) Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a

 Control de calidad para coliformes fecales

c) Interpretación de resultados de la técnica de filtración:

1. Contar las colonias que desarrollaron en la membrana y anotar los resultados.

Identificación de bacterias coliformes

b1.4.1) Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC)

a. Producción de indol (I)

b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

Técnicas Redox, Turbidimetría y Microscopia.

 Material que deben tener los alumnos

 Material y equipo por grupo

10-1 10-2 10-

e)Recuento microscópico (cuenta de Breed).

1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2

Área del campo / área de la muestra = FM

En el Peru se usara el filtro de membrana en aguas residuales, La presencia de

La filtración por membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan en la

¿SEGÚN EL ANALISIS REALIZADO EL AGUA DE PASCO SE CONSIRERA POTABLE O NO Y

Según el Análisis el agua de Pasco no es considerado potable debido que al analizar en