“UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA”

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

SEMINARIO N°1

TITULO : ELECTROFORESIS DE ALTO VOLTAJE,

ELECTROFORESIS DE CORTINA (CONTINUA)
ELECTROFORESIS DE DISCONTINUA.

DOCENTE : Q.F. WILFREDO GUTIÉRREZ ALVARADO

ALUMNAS : MURRIETA ROMAINA MARGARITA.

PINEDO ISLA PRISCILA.

NIVEL : V

FECHA DE ENTREGA: 5/01/07

IQUITOS – PERÚ

2007
 ELE CTROFORESIS DE ALTO VOLTAJE

La electroforesis de alto voltaje en papel es un método que se

aplica frecuentemente en el fraccionamiento de péptidos y la
identificación cualitativa de aminoácidos. Los aparatos de
electroforesis se clasifican de acuerdo al voltaje a usarse y la
p0osición del papel. De acuerdo al voltaje pueden ser:
a) Bajo voltaje: gradiente de voltaje de 2 a 10 v/cm
b) Voltaje medio: tiene un gradiente voltaje de 20 a 10 v/cm
c) Alto voltaje: tiene un gradiente de 50 a 10 v/cm.

De acuerdo a la posición del papel puedes ser un sistema

horizontal o vertical.

Principios del Método

Cuando se aplica un campo eléctrico a través de u papel de
filtro humedecido apropiadamente con buffer, los componentes
de una mezcla de proteínas migran en la dirección y con
velocidad correspondientes a su patrón de carga.

Aparato de electroforesis:- el alto voltaje así cierto punto es un

tanto problemático por el calor que se genera por electroforesis
( tomar en cuanta que se trabaja hasta con 300v ). Sin
embargo, este calor generado puede minimizarse pues
generalmente los aparatos de electroforesis son hechos de
exiglass, un pobre conductor de calor y por otro lado, formando
parte del todo el sistema tenemos las placas de enfriamiento de
metal a través de la cuales circula agua muy fría (5ºC). esto
para el sistema de electroforesis horizontal y vertical se puede
usar solventes orgánicos como el varsol que tiene un índice
bajo de enfriamiento.

La electroforesis de alto voltaje en papel desempeña un rol

protagónico en los análisis de complejas mezclas de péptido tal
como los hidrolizados enzimáticos de proteínas; pues en
combinación con la cromatografía dan lugar a los llamados
“finger prints” los cuales a demás pueden tener mayor
efectividad en cuanto a separación de péptido por la
introducción de una técnica de “cosido” que abrevia el tiempo
de obtención de datos.

Cuando se separa compuesto de bajo peso molecular median

electroforesis de bajo voltaje de papel, se produce una
considerable difusión.
Esto se evita en gran parte, utilizando voltaje mucho más
elevados que produce mejores resolución y separaciones muy
rápidas (10 a 60 min.) se pueden conseguir grupos
electrógenos de alto voltaje que proporcionan hasta 10 000v y
5000mA y produce gradientes de potencial de hasta 200v. cm -1
Descripción del aparato
El bloque de crecimiento que forma parte del aparato tiene un
circuito en paralelo a través del cual pasa el líquido de
enfriamiento que puede ser :
Una mezcla de etanol – acetona o usando una máquina
refrigerante, la temperatura del agua será 6ºC sobre esta placa
se coloca el papel de filtro apropiadamente humedecido el cual
tendrá los extremos reforzados en una de los compartimentos
de la cámara que se comunicará luego con el compartimiento
del electrodo a través de un puente de papeles de filtro. La
fuente de poder tiene un voltaje máx. de 2000v y una intensidad
de 130 a 200 mA.

La electroforesis de alto voltaje produce tanto calor que se

requiere un sistema de refrigeración. Existen 2 métodos
principales para enfriar el medio:

Un sistema de inmersión total o un sistema de placa refrigerada

Sistema De Inmersión Total, el papel (después de saturado

con tampón y de aplicada la muestra) se sumerge en un gran
volumen de un liquido refrigerante que actúa como liquido
intercambiador para difundir el calor del papel. El líquido
refrigerante debe ser eléctricamente inerte e inmiscible en la
muestra y en el tampón. Con esta finalidad se ha utilizado
ampliamente disolventes orgánicos tales como el tolueno o
serpentín por el que circula agua para proporcionar un
refrigerante tienen a ser tóxicos e inflamables.

Sistema De Placa Refrigerada, es mas seguro y eficaz las dos

placas, que normalmente son de aluminio, están aisladas del
medio de soporte median politeno, y hacen presión contra el
medio de soporte aislado mediante una almohadilla de presión
hinchadle. Se pueden conseguir aparatos con placa de hasta 50
por 50 cm, que permiten utilizar grandes hojas de papel. Se
hace circular agua fría por los canales de las placas de
refrigeración, y en las grandes placas se requieren flujo de
entre 10 y 15 dem3. min.-1 para dispersar el calor producido en
los países tropicales, el agua refrigerante debe ser previamente
enfriada; en las áreas en que el agua es muy dura se
recomienda el empleo de una agente ablandador, para evitar
que se deposite sales en los canales de las placas.
Deben evitarse los gradientes térmicos a través de las placas
pues una diferencia de 1ºC provoca una variación del 3% en la
velocidad de migración, lo que afecta a la reproducibilidad. Es
vital un aislamiento completa del aparato puesto que se utiliza
voltajes que son letales.

ELECTROFORESIS DE CORTINA (CONTINUA)

Esta es una forma de electroforesis de bajo voltaje de papel en

el cual la muestra disuelta o suspendida en un tampón
apropiado se aplica continuamente a la parte alta de una hoja
de papel colocado verticalmente. La muestra es transportada
hacia abajo por el flujo del tampón por acción de la gravedad,
mientras que sus componentes con carga son desplazados
horizontalmente por el campo eléctrico.

El aparato esta encerrado en un recipiente de Perspex, y se

aplican hasta 500v a través del papel mientras que se alimenta
la muestra en una velocidad aprox. De 0,2cm3 por hora.

Un recipiente de reserva de nivel constante asegura una

velocidad del flujo del tampón uniforme. Los componentes
separados se recogen en tubos dispuestos de bajo del borde
inferior al papel que tiene forma de sierra. Se puede continuar
la separación hasta durante 2 días. Las separaciones óptimas
de mezclas determinadas se pueden conseguir estableciendo
empíricamente las combinaciones adecuadas de la posición de
aplicación de la muestra, la velocidad del flujo de esta y del
tampón y voltaje aplicado. El uso de este aparato es engorroso,
para obtener bueno resultados se requiere una considerable
habilidad y experiencia, de suerte que esta técnica solo se
utiliza para la investigación de suerte que esta técnica solo se
utiliza para investigaciones especializadas. También como para
la separación de moléculas cargadas, puede utilizarse para la
separación de distintos tipos de células, de fracciones de
células, de membranas y de organelos celulares.

Procedimiento experimental

El montaje típico para electroforesis en papel a bajo voltaje

(20v/cm). La tira de papel se sumerge primero en la disolución
tampón y luego se coloca la cubeta tal y como se indican. La
muestra se aplica seguidamente bien como un mancha (igual
que la cromatografía de papel) o bien como un línea, pero
usualmente en el centro. El papel se satura con el tampón y los
extremos de aquel se colocan en el reservorio del tampón para
establecer así contacto con la fuente de voltaje. El papel queda
encerrado en una cubeta para evitar la evaporación y se aplica
el voltaje deseado. Cuando la separación llega a su fin se
recoge el papel y se seca. Si la muestra contiene suficiente
materia este puede ser localizado por su color, fluorescencia o
por diversos método de tinción si se requiere una medición
cuantitativa, puede realizarse una elusión del colorante y
determinarlo por espectrofotometría debido a la incorporación
de colorante es raramente cuantitativa, la exactitud de este
método es del 20% aprox.

Si la muestra es radioactiva las manchas pueden ser localizadas

cortando el papel y cortando la radioactividad o por
autoradiografia del papel entero utilizando una película
sensible a los rayos x. la combinación de colorantes con
radioactividad para determinar que sustancias son radioactivas,
es una técnica especialmente útil.

Aplicaciones

La electroforesis de papel a bajo voltaje a sido una de las

técnicas mas utilizadas para el análisis de mezclas proteicas
que se separan mal por cromatografía sin embargo esta técnica
ha sido superada en muchas de sus aplicaciones por la
electroforesis en gel.
La electroforesis de bajo voltaje es ineficaz para moléculas
pequeñas por ejemplo: aminoácido y nucleótidos, por que
poseen carga demasiado reducido para proporcionar una
movilidad suficiente (la separación es muy lenta) y por otra
parte, su pequeño tamaño, les confiere una considerable
difusión.

ELECTROFORESIS DISCONTINUA

La electroforesis discontinua fue propuesta inicialmente por L.

Ornstein y B. Davis en el año 1964 como una forma de
incrementar la resolución de las electroforesis en gel,
permitiendo que a partir de muestras de varios centímetros de
ancho se produjesen zonas de partida para la electroforesis tan
estrechas como 10 micras, con el gran poder de resolución que
eso supone y con la posibilidad de analizar muestras diluidas
sin concentración previa. La técnica se basa en la observación
(en 1897) de Kohlrausch de que, bajo determinadas
condiciones, dos iones de distinta movilidad pueden
desplazarse a igual velocidad en un campo eléctrico.

La situación inicial supone dos

iones de igual carga, A y B, y un Supongamos concentraciones
contraión común, C. La iguales de A y B. Teniendo en
movilidad de A (el ión trasero cuenta la relación entre el campo
respecto al campo) es menor eléctrico y la conductividad de las
que la de B (el ión delantero). Al disoluciones es fácil entender
aplicar el campo eléctrico, se porqué el campo es mayor en la
observa que la interfase entre A zona del electrolito trasero A, que
y B se mantiene estable, y se en la zona del electrolito
desplaza a velocidad constante. delantero, B. Otra manera de ver
En la zona de la interfase, las este efecto es que, si un ión A
velocidades de A y B son entra en la zona de B, se moverá
 más despacio que estos ya que su
movilidad es menor. Si un ion B se
iguales. retrasa y entra en la zona de A, se
moverá más rápido que estos, ya
que su movilidad es mayor.

Ahora bien, la función reguladora de Kohlrausch predice, no

sólo que la interfase permanecerá estable, sino que el cociente
de las concentraciones entre A y B tenderá a un valor que viene
determinado por la siguiente expresión:

donde µA, µB y µC corresponden a las movilidades de los iones A, B y C, y Z son las

cargas de dichos iones. En el caso de que la concentración de A sea inicialmente
demasiado baja para cumplir esta ecuación, se irá acumulando ión A en la parte trasera
de la interfase hasta que se alcance este valor, que es, por otro lado, independiente de las
concentraciones iniciales de A y de B. Lo contrario ocurre si la concentración de A es
demasiado elevada: se mueve más despacio que B, disminuyendo su concentración en la
interfase. Estos cambios se deben a que en la interfase, el perfil del campo no es
constante y, por consiguiente, tampoco lo es la velocidad de A en esa zona. (En esta
discusión se omite el comportamiento del contraión C para mayor simplicidad)

El campo en la zona alejada de El campo en la zona alejada de

la interfase es demasiado bajo la interfase es alto, al haber
para que A tenga la misma una concentración baja de A;
movilidad que B: las moléculas este anión se mueve rápido; al
de A se mueven más despacio, acumularse en la interfase
se "separan" de la interfase aumenta la concentración de A,
pero, en esa zona, el campo el campo disminuye y la
aumenta al haber menor velocidad de A también lo hace,
concentración de iones; en la hasta igualarse a la de B. No
interfase, las velocidades de A hay moléculas de A que
y B son iguales (no quedan adelanten a las de B, ya que en
"huecos" sin aniones entre las esa zona se frenan al ser menor
zonas ocupadas por A y B). la movilidad de A que la de B.

Este estado estacionario, una vez alcanzado, se mantiene

indefinidamente siempre que se mantengan las condiciones
iniciales.

Se obtiene un resultado similar cuando en el sistema hay tres o

más iones del mismo signo y un contraión común, siempre que
haya un ión delantero de mayor movilidad que cualquier otro, y
un ión trasero de menor velocidad, y ambos se encuentren en
cantidad superior a cualquiera de los iones de movilidad
intermedia.

En este sistema, µA <µM <µB. La concentración de M es mucho

menor que la de A y B, de tal forma que [A]/[M] es mayor que
CKAM y [M]/[B] es menor que CKMB

Inicialmente, la velocidad del la Cuando se alcanza el estado

interfase AM es mayor que la de estacionario, la concentración
la interfase MB, ya que el de M ha aumentado hasta un
campo es mayor. En la interfase valor que permite cumplir la
AM la concentración de M función de Kohlrausch para
tiende a aumentar, (y A a ambas interfases. Si la
disminuir) para ajustar el concentración inicial de M es
cociente de concentraciones a muy baja (como sucede cuando
la relación CKAM. En la se trata de macromoléculas), el
interfase MB también tiende a volumen ocupado por M puede
aumentar la concentración de
M. La única forma que hay de
aumentar la concentración de
ser notablemente menor que el
M en ambas interfases es
que tenía inicialmente, incluso
disminuyendo el volumen que
aunque no se llegue a alcanzar
ocupa este ión, ya que su
el estado estacionario final.
cantidad es limitada (a
diferencia de lo que sucede con
A y con B).

Este efecto puede concentrar la muestra significativamente,

cómo se puede comprobar en el ejemplo.

Si en la muestra existen diferentes iones M, N, O... etc, de

movilidades decrecientes en ese orden y que se encuentran a
baja concentración, el sistema tenderá a un estado estacionario
en el que

 Los distintos iones M, N, O... se ordenan por sus

movilidades, originando una serie de zonas discretas. El
primero será el más rápido, M; el segundo N y así
sucesivamente.
 La concentración de cada ión se ajusta a la ecuación de
Kohlrausch para cada interfase en la que participa; las
concentraciones se ajustan desde el ión más rápido al mas
lento. Esto es, la concentración de M depende de la
concentración del ión delantero; la de N depende de la de
M, la de O de la de N, y así sucesivamente hasta llegar al
ión más retrasado.

 El ancho de cada banda -es decir, el volumen del medio en

el cual se encuentra el ión- depende de la cantidad de ese
ión presente en la muestra (recuerde que la concentración
que alcance viene fijada por la ecuación de Kohlrausch
aplicada a cada una de las interfases entre iones)

 Todos los iones se desplazan a igual velocidad hacia el

electrodo correspondiente.

Este es el principio de la ISOTACOFORESIS, o electroforesis a

igual velocidad.

Aunque la isotacoforesis tiene interés como método de análisis

de compuestos de bajo peso molecular, como nucleótidos, por
ejemplo, este fenómeno se emplea como método de
concentración de la muestra en electroforesis discontinua. Este
tipo de electroforesis tiene dos fases:

1. Concentración de la muestra mediante un proceso

isotacoforético, hasta que las zonas ocupadas por cada
componente sean muy estrechas: fase de "empaquetado"
2. "Desempaquetado" y separación de los componentes de la
muestra en un gel bajo un campo eléctrico constante

En esta discusión vamos a referirnos a proteínas, dado que así

fue propuesto inicialmente este método, pero es igualmente
válida para cualquier tipo de moléculas presentes en la muestra
a estudiar.

Primera fase. Empaquetado de la muestra

Para conseguir que las moléculas de la muestra se concentren

es preciso que se muevan entre un ión más rápido que ellas (lo
que es sencillo, ya que generalmente las movilidades de los
iones inorgánicos pequeños en un gel son muy superiores a las
movilidades de las macromoléculas), y un ión más lento. Esto ya
es más complicado de encontrar, pero la solución propuesta por
Ornstein y Davies es simple: se trata de usar un ión anfotérico a
un pH ligeramente superior a su punto isoeléctrico (si se quiere
que se mueva como anión). En esas condiciones, sólo una
pequeña fracción de las moléculas tendrán carga distinta de 0
(Z será mucho menor de 1) y, por consiguiente, su movilidad
electroforética será baja. La molécula escogida por ellos fue la
glicocola, con un pI de 6,1. Para asegurar que las proteínas no
se ven frenadas por el gel, la muestra se aplica sobre un gel de
poro grande, poco reticulado. En esas condiciones, la glicocola
tiene menor movilidad que las proteínas de la muestra, que a su
vez son más lentas que el ión más rápido, generalmente
cloruro. Es preciso considerar también el contraión adecuado.
Generalmente se emplea Tris, que tampona adecuadamente en
el rango de pH en el que se realiza la electroforesis.
 Al aplicar el campo
Montaje eléctrico, la Gly El frente de Gly
experimental. La entra en el gel continúa su avance
muestra se aplica en superior. El sistema en el gel superior;
un pocillo formado formado por la Gly, las proteínas se
en el gel superior, la muestra y el Cl concentran cada vez
-

de empaquetado. cumple la condición más por lo que la

Este gel tiene pH de Kohlrausch, y zona que ocupan es
bajo, y es poco empieza el cada vez más
restrictivo empaquetado de las estrecha.
proteínas

Segunda fase. Separación de los componentes de la muestra

Para obtener información hay que conseguir que las moléculas

se desempaqueten. Para ello se aumenta la movilidad de la
glicocola y se disminuye la movilidad de las proteínas. Esto se
consigue con una doble discontinuidad: de pH y de reticulación
del gel. El pH aumenta, con lo que la carga de la glicocola, y
con ella su movilidad, aumenta también. Y el aumento de
reticulación frena a las proteínas en mucha mayor medida que
a la glicocola.
 La glicocola sigue
Cuando la glicocola avanzando en el gel, y
ha recorrido un entre ella y el Cl
espacio adecuado siguen los iones con
(entre 0,5 a 1 cm) la movilidad intermedia
zona ocupada por la (por ejemplo, el
muestra es muy colorante azul de
estrecha. Al llegar a la bromofenol usado
interfase entre los dos como marcador). Las
geles, se acelera la proteínas, ahora
glicocola y se frenen retrasadas, se separan
las proteínas en un campo eléctrico
constante.

En cuanto las proteínas entran en el gel empiezan a separarse

de acuerdo a sus movilidades respectivas, como en una
electroforesis de zona convencional. Ahora bien, gracias a este
método se consigue que la zona de partida sea extremadamente
delgada, con lo que la eficiencia de la separación es muy alta.
 BIBLIOGRAFIA

 http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-nucleicos.html

 http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas
/apquim-an-instr-14/skoog/30.html

 Bjellqvist B. inventor; Pharmacia Biotech AB, assignee. Buffer system for

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