TABLA DE CONTENIDOS

PRÁCTICA N° 1: PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES

DE MICROBIOLOGÍA.

PRÁCTICA N° 2: FORMULACIÓN, ESTERILIZACIÓN Y CONTROL DE

CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.

PRÁCTICA N° 3: TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y

HONGOS.

PRÁCTICA N° 4: COLORACIÓN DIFERENCIAL (COLORACIÓN GRAM) Y

COLORACIÓN DE ESPORAS.

PRÁCTICA N° 5: CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AMBIENTE

DE PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS.

PRÁCTICA N° 6: PRUEBAS PRESUNTIVAS Y CONFIRMATIVAS DE

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS.
YA DESPUES AL TERMINAR EL TRABAJO SE INSERTARA EL INDICE
 PRÁCTICA Nº 1

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL MICROBIOLÓGICO

 INTRODUCCIÓN

La esterilización implica la destrucción de todos los microorganismos, incluyendo las

esporas. La desinfección supone la destrucción de los microorganismos vegetativos que
pueden causar enfermedades o en el contexto de las industrias de alimentos, los que
pueden producir alteraciones. La desinfección no mata necesariamente a las esporas.

En el trabajo del laboratorio de Microbiología tienen importantísima aplicación los

procedimientos, técnicas y productos que suprimen o disminuyen la vitalidad de los
microorganismos patógenos. No existe un procedimiento de esterilización y desinfección
aplicable a todos los casos. El método de esterilización será seleccionado para cada caso
teniendo en cuenta la naturaleza física del objeto y la naturaleza biológica del
contaminante. Como rara vez se conoce la población de microorganismos sobre un objeto
que debe ser tratado, debemos presuponer que se encuentran presentes las formas
microbianas más resistentes: las endosporas. El método de esterilización a emplearse
debe ser previamente valorado. Actualmente existen valores tabulados de tiempo de
exposición, temperatura y concentración de principios activos para los métodos de
esterilización más usados que nos permiten elegir el más adecuado para cada caso.
1. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. OBJETIVOS GENERALES:

Capacitar al alumno en la preparación y acondicionamiento de

materiales de microbiología.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Esterilizar material de laboratorio (cajas de Petri y Tubos de ensayo)
para ser utilizados en prácticas futuras.

Obtener material sin bacterias para utilizarlo en medios de cultivo.

2.

En microbiología se exige el uso de material de vidrio limpio y estéril. Antes de

realizar un ensayo microbiológico es necesario primeramente preparar los
materiales desde lavado, secado y acondicionamiento previo al esterilizado. Los
materiales de vidrio como placas Petri, tubos de ensayo, pipetas, pinzas y cucharas
deben ser acondicionados cubriéndolos con papel craft y tapones de algodón y
papel aluminio.
Todo este procedimiento se debe realizar en un ambiente limpio y desinfectado
estas operaciones distintas se pueden realizar conjuntamente o
independientemente.

(Tiene que estar a esta altura)

3. MATERIALES Y METODOLOGÍA ¿?

3.1. MATERIALES (cambiar título)

3.1.1. MATERIAL USADO

Cualquier material contenido cultivos microbianos o haya podido ser

objeto de contaminación bacteriana debe esterilizarse previamente antes de
su limpieza, para ello son suficientes 20 minutos en autoclave a 121 ºC.
Esta operación además funde cualquier resto sólido, lo que facilitara su
limpieza. El material se enjuaga posteriormente con agua, se sumerge en
agua jabonosa y se lava cuidadosamente y preferiblemente con ayuda de
un cepillo. Se enjuaga al chorro de agua (primero del grifo y
posteriormente destilada) y se deja secar a temperatura ambiente.

3.1.2. LAVADO DE MATERIALES:

El lavado de materiales de vidrio se efectúa por medios manuales, lo

importante es que quede limpio sin residuos de detergente ni ácidos
empleados.
Se recomienda borrar todas las inscripciones de los materiales de vidrio
antes de enviar a la esterilización y /o al lavado.
Todos los materiales de vidrio deben ser lavados con detergente
tensioactivo removedor de grasa y residuos de alimentos con ayuda de
escobillas o esponjas y proceder a un buen enjuague con agua potable y
agua destilada por las paredes interiores del material de vidrio.
Es aconsejable el uso de indicador o del medidor de pH para comprobar
que no queden residuos ácidos o alcalinos en el material lavado. Dejar
secar a la estufa 60 a 70ºC por 30 minutos aproximadamente.

3.1.3. MATERIAL NUEVO

El tratamiento del material nuevo de vidrio se realiza en función de su

composición, si el cristal es boro silicato (tipo de pírex) basta con lavarlo
 normalmente, pero si es sódico, debe sumergirse en ácido clorhídrico 1N
durante 12 horas para neutralizar parcialmente el álcali contenido en el
vidrio antes de su lavado.

3.2. PREPARACIÓN DE MATERIALES DE LABORATORIO

Una vez seco el material se procede a envolver las placas petri y pipetas con
papel craft. Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodón y
gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que se colocaran un
capucho de papel. Los materiales se deben envolver en papel cratf amarrados
con hilos de pabilo para ser llevados a la estufa para su esterilizado y una vez
estériles los materiales se dejan enfriar pasa luego usarlo en el procesamiento.
Los materiales que no se logran usar al día se deben colocar en un lugar
limpio y exclusivo para evitar su contaminación.

3.3. DESINFECCIÓN

La desinfección es una operación cuyo fin básico es reducir la carga

microbiana, principalmente patógenos, que suelen contaminar el ambiente, las
superficies, las manos y por lo tanto también los alimentos. En los procesos
de desinfección el rol más importante corresponde a los desinfectantes.
Las limpieza y desinfección de las instalaciones locales, maquinarias, equipos
y vehículos de las industrias elaboradoras de alimentos, constituye una
importante medida de control que deben implantar las industrias alimentarías,
esta medida de control resulta necesario para una adecuada prevención de los
riesgos y es una herramienta imprescindible para evitar las contaminaciones
cruzadas en los alimentos.
La eficacia de los desinfectantes químicos se resiste por la presencia de
suciedad y cuanto más limpia está la superficie a desinfectar más eficaz
resultara el desinfectante utilizado. La desinfección debe seguir
inmediatamente a la limpieza, aunque si el equipo se dejó estar inactivo
mucho tiempo se recomienda desinfectar las superficies por segunda vez,
inmediatamente antes de poner en marcha una desinfección. mEsta acción
 destructora de gérmenes (germicida o microbicida), en función del tipo de
germen que se destruya puede ser:
Bactericida, se destruyen bacterias.
Fungicida, se destruyen hongos.
Viricida, se destruyen virus.
Esporicida, se destruyen esporas.

3.4. ESTERILIZACIÓN

Proceso que mata o elimina todas las clases de microorganismos y esporas,

asegurando la destrucción de endosporas que son las estructuras bacterianas
más resistentes al calor.
Las altas temperaturas provocan efectos letales o sub letales sobre los
microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que
normalmente crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos
nucleicos. Estos primeros daños impiden que la bacteria se reproduzca y, por
consiguiente, forme una colonia sobre un medio de cultivo adecuado. La
esterilización a temperaturas altas elimina a los microorganismos, los daños
se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad
de formar colonias.

3.4.1. ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO:

La esterilización al calor seco del material que se efectúa a 180 °C por 1

hora o 170 º C por 2 horas.
Antes de esterilizar los materiales se cubren con papel craf con el objeto de
que mantengan su esterilidad al ser retirados de la estufa y durante su
almacenamiento.
El material esterilizado se debe colocar en un lugar limpio en estantes o
cajas herméticas hasta el momento de su uso.
La esterilización por calor seco deshidrata las bacterias, virus, etc. y
facilita la coagulación o desnaturalización de las proteínas. Se requieren
mayores temperaturas para producir daño irreversible (muerte). Se acepta
que el calor seco actúe oxidando los constituyentes intracelulares. En el
 proceso de esterilización son prioritarios los procesos oxidativos y de
fusión de membranas por sobre la desnaturalización. Resulta lento por la
menor eficacia del calor seco y por la lentitud del transporte del calor
(convección y radiación).
3.4.2. ESTERILIZACIÓN POR VAPOR A PRESIÓN:

Se realiza en autoclave y se usa para esterilizar ciertos materiales de

laboratorio, como botellas de tapa plástico, botellas de plástico resistentes
a la esterilización (policarbonato, polipropileno, etc.) que deben estar
esterilizados en autoclave a 121 ºC/15 lb., de presión/15 minutos.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de
cultivo, soluciones y cultivos bacterianos.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor
como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. Se esteriliza por
filtración en membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y para el caso
de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como el óxido de
etileno o radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan
con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como los
fenoles. Compuestos de amonio cuaternario, formaldehido, alcoholes,
halógenos y detergente.

3.4.3. ESTERILIZACIÓN POR MÉTODOS QUÍMICOS:

Esta tipo de esterilización se utiliza para algunos instrumentos muy
delicados, cuyo temple y filo conviene proteger del calor. Los productos
químicos que se utilizan son bactericidas o desinfectantes. Tales
productos, en unos casos destruyen la bacteria, actuando como
desinfectantes y en otros impiden su desarrollo por lo que se denominan
antisépticos.
La eficiencia de estos bactericidas está en razón directa de la
concentración del producto, del tiempo que el instrumento permanezca
dentro de ellos y de su prolija limpieza, ya que la sangre, así como los
detritos adheridos al instrumento demoran y anulan la acción del agente
químico que se utilice.
 Otros esterilizantes son las soluciones químicas que tienen, por si mismas,
propiedades bactericidas, tales como: alcohol, agua oxigenada, fenol,
timol, yodo, solución de formol, solución de hipoclorito, permanganato de
potasio, bicloruro de mercurio, etc., estos son bactericidas que se usan
puros o en solución acuosa o alcohólica. Esta esterilización también se
llama esterilización en frío.
AGENTES QUÍMICOS USADOS:
1. Óxido de etileno
2. Plasma de peróxido de hidrógeno
3. Pastillas de formol
4. Soluciones químicas

Instrumentos que se esterilizan con estos medios químicos:

Fresas
Bisturíes
Agujas
Instrumentos de Endodoncia.

3.4.4. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES:

Cuando el material que se va esterilizar es sensible al calor, o cuando s
necesario esterilizar una gran cantidad de material a la vez, se utilizan las
denominadas técnicas de esterilización en frio, cuyo prototipo es la
esterilización mediante radiación ultravioleta o utilización de radiaciones
ionizantes (radiesterilizacion).
a. RADIACIÓN UV: La mayor acción bactericida se obtiene con
longitudes de onda de 2.500 a 2.800 A°. este tipo de desinfección debe
limitarse a las superficies y al aire, debido a su poder de penetración.
b. RADIOESTERILIZACIÓN: Se trata, en general, de grandes
instalaciones en las que una fuente de cobalto 60 (o cesio 137) emite
radiaciones de hasta 500.000 curios con un gran poder de penetración
(rayos y) que esteriliza todo el material al ser capaz de ionizar los
átomos moléculas de cualquier material. Este va individualmente o en
pequeños lotes introducidos en envases de plásticos, donde mantiene
su esterilidad durante meses o hasta su apertura.
3.5. FACTORES QUE AFECTAN A LA ESTERILIZACIÓN Y A LA
DESINFECCIÓN:

3.5.1. HIDRATACIÓN
La temperatura de coagulación de proteínas está claramente influida por su
estado de hidratación. Esta afirmación es válida para la coagulación por
calor y para algunos agentes químicos. Es posible que la resistencia de las
endosporas al calor se deba a su estado prácticamente deshidratado.

3.5.2. TIEMPO
Ningún agente es instantáneo, debe contactar físicamente con el
microorganismo un tiempo suficiente para provocar alteraciones físicas o
reacciones químicas, según su mecanismo de acción.

3.5.3. TASA DE ACCIÓN

En las mismas condiciones de todos los microorganismos, ni siquiera
diferentes generaciones de un mismo microorganismo, presentan frente a
un agente ni la misma vulnerabilidad ni la misma tasa de mortandad.

3.5.4. TEMPERATURA
Con respecto a la acción microbiana del calor, la temperatura necesaria
suele estar en función inversa del tiempo de acción, una vez superada una
temperatura mínima, con respecto a los agentes químicos, suele ser más
activos en caliente, como normal en cualquier reacción química.

3.5.5. CONCENTRACIÓN
Dentro de unos límites, al aumentar la concentración aumenta la
efectividad, no linealmente sino exponencialmente, para a partir de un
punto conseguir incrementos insignificantes.
 3.5.6. EFECTO DE PH
Como regla general, cualquier alejamiento del pH fisiológico tiende
aumentar el efecto letal de cualquier agente físico, u otro agente químico
distinto a los ácidos y los álcalis.

4. CONCLUSIÓN

Un material esterilizado es de suma importancia, ya que debemos protegerlos de la

contaminación por suciedad, polvo y bacterias para que al emplearlos una vez ya
esterilizados tengamos un óptimo resultado en nuestros trabajos de laboratorio luego para
poder cultivar microorganismos porque de lo contrario podrían crecer otros organismos
que no son requeridos.

ANEXOS: (FALTA NOMBRE A LAS IMÁGENES)

BIBLIOGRAFÍA

Corregir, según APA

http://uvsfajardo.sld.cu/tema-7-metodos-de-esterilizacion
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_M%C3%
A9todos_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf
https://es.slideshare.net/mariiluu_92/mtodos-de-limpieza-desinfeccin-y-esterilizacin-
utilizados
https://www.monografias.com/trabajos89/limpieza-desinfeccion-materiales-laboratorio-
clinico/limpieza-desinfeccion-materiales-laboratorio-clinico.shtml
 PRÁCTICA Nº 2

FORMULACIÓN, ESTERILIZACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE

MEDIOS DE CULTIVO.
 INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias que en
conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en función del grupo
microbiano que se pretende estudiar, y la preparación del medio depende de la
complejidad química (composición), el estado físico y otras condiciones requeridas (pH,
concentración, etc.).
Existen medios de cultivo comerciales empleados para el desarrollo de los
microorganismos más comunes, sin embargo en muchas ocasiones se requiere preparar el
mismo mediante la mezcla de sus componentes. Para el estudio de los microorganismos
es indispensable contar entre otras cosas con material y medios de cultivo estériles.
En Microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el cual se
eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto,
medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el
material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de esterilización,
entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire),
radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico).
1. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. OBJETIVOS GENERALES

Realizar un primer acercamiento a la manipulación de
microorganismos; además, adquirir la idea de la importancia del trabajo
en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para
realizarlo.
Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de
cultivo.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Elaborar y formular medios de cultivo selectivo y no selectivo. Para
bacterias y hongos.
Evaluar el proceso de esterilización y control de calidad de los medios
de cultivo.

2. MARCO TEÓRICO:

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el

crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la
especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en
medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan
determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: fuentes de carbono
(azúcares), fuentes de nitrógeno (aminoácidos y proteínas), sales, vitaminas,
minerales, etc.
Los nutrientes en el medio de cultivo deben contener todos los elementos
necesarios para la síntesis biológica de nuevos microorganismos.

2.1. LAS BACTERIAS

Las bacterias son más grandes que los virus. Son microorganismos unicelulares
(formados por una sola célula) y se distinguen del resto de los seres vivos
porque sus células no tienen núcleo; son organismos procariotas. De hecho,
 esta diferencia es tan importante que las bacterias forman, por sí solas, uno de
los principales grupos de seres vivos; constituyen el reino procariotas.
Las bacterias pueden vivir en multitud de lugares, desde lo alto de las montañas
hasta las zonas más profundas de los océanos, y también dentro de plantas y
animales, ¡incluso dentro de tu cuerpo!
Hay numerosos tipos de bacterias. La mayoría son útiles y beneficiosas para
nosotros. Sin embargo, otras son perjudiciales y producen enfermedades en las
personas y en los animales. Las bacterias también pueden contaminar los
alimentos y originar intoxicaciones.

2.2. FUENTES NUTRITIVAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

2.2.1. FUENTES DE CARBONO
La glucosa puede apoyar el crecimiento fermentativo y respiratorio de
muchos microorganismos. Es importante proporcionar los sustratos de
crecimiento en las concentraciones adecuadas.
Se requiere dióxido de carbono para diversas reacciones biosintéticas.
2.2.2. FUENTES DE NITRÓGENO
El nitrógeno es un componente importante de las proteínas y de los
ácidos nucleicos y constituye casi el 10% del peso seco de la célula
bacteriana.
El nitrógeno puede suministrarse en diversas formas y los
microorganismos varían su capacidad para asimilarlo. El producto final
de todas las vías d asimilación del nitrógeno es la forma más reducida
del mismo el ión amonio NH4+
2.2.3. FUENTE DE MINERALES
Se requiere numerosos minerales para la función enzimático, los iones
Mg+ e iones, ferroso Fe+2, también se requiere calcio como
constituyente de las paredes celulares de las bacterias gram positivas,
aunque es necesario también en las bacterias gram negativas.
Al formular un medio de cultivo para la mayoría de microorganismos es
necesario brindarle fuentes de potasio, calcio, magnesio y hierro. S e
requiere también otros minerales como Mn, Mo, Co, Cu, y Zn., estos
se encuentran a menudo en el agua del grifo.
 2.2.4. FACTORES DE CRECIMIENTO
Se llama factor de crecimiento a un compuesto orgánico que debe tener
una célula para poder crecer como las vitaminas, aminoácidos, purinas
y pirimidinas.

2.3. TIPOS Y FUNCIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS

a) Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar
nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.

b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan

indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este
enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que
aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate.

c) Medios selectivos: son utilizados para favoreces el crecimiento de ciertas

bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos
medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población
polimicrobiana específica. Un ejemplo de estos medios es el Caldo Selenito.

d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo

impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina
inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más
restrictiva de los medios selectivos. Un ejemplo de este tipo de medios es el
Mac-Conkey.

e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características

bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de
este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar
sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre otros.

f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad

especifica que puede servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios deben poseer los elementos necesarios para
 asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya a
ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de
estos medios es el Agar Kligler y el Simmons.

g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células

a partir de un microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón
(BHI), es un ejemplo típico de estos medios.

2.4. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

2.4.1. POR SU CONSISTENCIA

Medios líquidos: Son los que se presentan en estado líquido y se

les llama caldo nutritivo, y se compone de extracto de carne,
peptona y agua. Se utilizan fundamentalmente para la obtención de
una suspensión bacteriana de una concentración.
Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos,
agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la
gelatina y el agar. Y tiene un fin como agar bacteriano, agar
comercial, agares purificados.
Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos,
agregando a un agente solidificante en una pequeña proporción. Y
se utilizan para la investigación de la movilidad de bacterias.

2.4.2. POR SU COMPOSICIÓN

Medios generales: Permiten el desarrollo de una gran variedad de

microorganismos.
Medios de enriquecimiento: Favorecen el crecimiento de un
determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir
totalmente el crecimiento del resto.
Medios selectivos: Permiten el crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los
demás.
 Medios diferenciales: Son aquellos en los que se pone de relieve
alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos
posee.

2.5. FORMULACIÓN DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVOS USUALES

2.5.1. MEDIOS NO SELECTIVOS

a) Caldo nutritivo. Es un medio empírico de uso general para el

cultivo de la mayoría de las bacterias (con la excepción de las
bacterias del ácido láctico y de algunos patógenos más exigentes).
Como ingredientes, tiene:

Peptona 10g
Extracto de carne 10g
Cloruro sódico 5g
Agua destilada 1000ml

b) Agar nutritivo. Este es un medio cuyo elemento básico es un

caldo nutritivo con agar, y de su uso general como se ha expuesto
anteriormente. Como ingredientes tiene:

Caldo nutritivo a pH=7.2 1000ml

Agar 15g
2.5.2. MEDIOS SELECTIVOS

a) Caldo Mac conkey: Medio selectivo y diferencial que se utiliza

para el enriquecimiento y detección de coliformes
(enterobacterias que fermentan la lactosa), en productos como la
leche y el agua. Como ingredientes tiene:

Peptona 20g
Sales biliares 5g
Cloruro sódico 5g
Lactosa 10g
 Purpura de bromocresol 1ml de solución
etanólica al 1%
Agua destilada 1000ml
b) Agar Mac Conkey. Este un medio de uso general para la
detección y aislamiento de bacterias de la familia de las
enterobacterias. Como ingredientes tiene:

Peptona 20g
Sales biliares 5g
Cloruro sódico 5g
Lactosa 10g
Solución rojo neutro 1ml de solución acuosa al
1%
Agar 20g
Agua destilada 1000ml

2.6. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran

comercializados; normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es
preciso rehidratar. En estos casos la preparación del medio de cultivo se
reduce sencillamente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en
agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en el
autoclave y enfriados a temperatura ambiente ó a 40-50ºC si se trata de
medios con agar. Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en
los recipientes adecuados (tubos, matraces, etc.).

Si es un medio sólido y se ha de distribuir en tubos o en matraces será

necesario fundir el agar en baño María u horno microondas, una vez fundido
y homogenizado, se distribuye en caliente a los tubos o matraces (no en
placas Petri) se tapa y se esteriliza en el autoclave. Una vez finalizada la
 esterilización los medios se dejaran enfriar a temperatura ambiente y en el
caso de medios sólidos contenidos en tubos deberán, en su caso, inclinarse
para que al solidificarse adopten la forma de agar inclinado o pico de
flauta(slant) si tal es su finalidad. 5 Las placas de Petri se preparan vertiendo
el medio fundido y estéril dentro de ellas y en un ambiente aséptico (por
ejemplo en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen) es conveniente
homogenizar el medio en el transcurso de la operación para evitar que el agar
sedimente en el fondo del recipiente y no se distribuya por igual en todas las
placas.

Ilustración 1. Preparación de medios de cultivo.

2.7. ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados
bajo las condiciones que señale el fabricante, generalmente se almacenan en
un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz
 solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra
fuente de calor o vapor.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe

almacenar entre 2 y 8º C, a menos que el medio requiera alguna condición
diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su
deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima
una envoltura de papel (Craft). (Dugas, 1999).

2.8. CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deben pasar por un riguroso control de calidad, para
esto debe colocar 1 o 2 placas conteniendo medios de cultivo estéril y dejar
en incubación por 24 a 48 horas, transcurrido este tiempo se debe evaluar si
hubo o no desarrollo de microorganismo, para así comprobar si las
condiciones de esterilización y preparación reúnen los parámetros y
condiciones de higiene y asepsia en su preparación.

3. MATERIALES Y METODOLOGÍA:

3.1. MATERIALES
a) EQUIPOS:

Balanza analítica
Autoclave
Mechero bunsen
Refrigeradora
Estufa graduada a 35 – 37 oC (control de calidad)

b) UTILITARIO DE LABORATORIO:

Diferentes medios de cultivo

Espátula
Placas petri estériles
Tubos de ensayo estériles
Probeta graduada
Gradillas metálicas
Papel craft
 Bombillas de jebe
Tapones de Algodón
Gasa
Espátulas
Agua destilada
Alcohol de 96o
Fósforo o encendedor
Plumón indeleble

3.2. METODOLOGÍA

3.2.1. PROCEDIMIENTO

a) Preparación del medio sólido en placas:

Pesar los medios de cultivo según las indicaciones del frasco

y según la cantidad de medio deseada, rehidratar en agua
destilada en un balón de vidrio.
Calentar el medio hasta disolver completamente el agar en
baño maría a 70 ºC.
Autoclavar el frasco a 15 libras de presión/15 minutos a 121
o
C.
Retirar del autoclave y dejar enfriar hasta 45 oC y distribuir el
medio en placas petri estériles, y tubos de ensayo, cerca al
mechero bunsen, flameando bien la boca del balón para evitar
la contaminación.
Dejar que el medio solidifique (por lo menos 30 minutos).
Rotular las placas y envolver cuidadosamente con papel craft
y en forma invertida acomodarlas en bolsas de plástico
limpias.
Colocar la fecha de preparación, nombre del medio de cultivo
y nombre del grupo y horario.
 b) Preparación de medio sólido en tubos de ensayo:

Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua

destilada en un matraz y fundir el medio en una olla a presión
hasta que el agar se haya disuelto por completo.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión/15 minutos a
121 oC. Retirar el balón del autoclave, dejar enfriar y
distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que
comience a solidificar.
Inclinar los tubos para obtener tubos con medio en pico de
flauta a una distancia de 1 a 2 cm de la boca del tubo. Rotular
los tubos con la fecha de preparación y nombre del medio de
cultivo.
Guardar en refrigeración hasta la fecha de su uso.

c) Preparación de medio líquido

Pesar y rehidratar el medio, distribuir el medio en tubos y

luego esterilizar en el autoclave a 15 libras de presión/15
minutos a 121 oC.
Retirar del autoclave y dejar enfriar.
Conservar en refrigeración a 4 oC. Rotular los tubos con la
fecha de preparación y nombre del medio de cultivo.

3.2.2. MANEJO DEL AUTOCLAVE

Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave de acuerdo a las

siguientes instrucciones:

Revisar que el nivel de agua sea apropiado, en caso necesario

añadir agua destilada.
Conectar el autoclave y poner la perilla de control de
calentamiento alto.
Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave y
colocarlo dentro.
 Cerrar la tapa, ajustar las manijas de dos en dos en posición
opuesta. Esperar que salga el vapor de agua por el orificio de
purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.

Dejar que se caliente la autoclave hasta alcanzar 121ºC/15 lbs de

presión/15 minutos. Revisar constantemente la escala del
manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el
nivel de calentamiento moviendo la perilla de control.
Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos
Apagar el autoclave y dejar que baje la presión al valor de “0”.
Quitarle la válvula de seguridad y con la ayuda de un guante de
asbesto abrir cuidadosamente la tapa, evitando quemaduras por la
salida del vapor.

3.2.3. CONTROL DE ESTERILIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Colocar los tubos con agar inclinado y las placas petri con medio
de cultivo en forma invertida en una estufa de incubación ajustada
a 35ºC durante 24 – 48 horas.
Revisar los tubos y placas petri para detectar la presencia de
contaminantes por la Aparicio de turbidez, así como la presencia
de colonias en la superficie de los medios de cultivo.
Si no hay contaminación de los medios de cultivo, se abrirá las
placas petri de cada medio durante 5 minutos en el laboratorio o
zonas accesorias al mismo y se etiquetara como “al aire”.
Otra placa petri se abrirá durante 30 segundos cerca al mechero y
se etiquetara como “área aséptica”.
La tercera placa se conservara sin abrir y se etiqueta como
“control”.

4. RESULTADOS

Se aprendió a preparar un medio de cultivo para microorganismos. También las

técnicas necesarias para el manejo del mismo, de igual manera se practicó la
manera correcta de colocar la solución dentro de placas petri.
5. CONCLUSIONES
De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran
importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo, añadir la cantidad de
solución exacta y disolverla correctamente.

Preparar un medio de cultivo en el cual podamos cultivar nuestros

microorganismos, es de suma importancia saber sus propiedades y conocer el
procedimiento ya que mediante su uso podemos llegar a estudiar infinidad de
microorganismos que crezcan es estos medios y así poseer información de suma
importancia.

ANEXO (FALTA NOMBRE A LAS FIGURAS)

BIBLIOGRAFÍA

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/09/tipos-y-funciones-de-los-medios-
de.html

file:///C:/Users/raquel%20alarcon/Downloads/medios%20de%20cultivo.pdf

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-
de-medios-de-cultivo

Garrido, s. c. (2014). Ensayos Microbiologicos. Madrid (España): Síntesis, S.A.

 PRACTICA Nº 3 y N°4

SIEMBRA, AISLAMIENTO, CUANTIFICACION Y COLORACION GRAM DE

MICRORGANISMOS DE QUESO Y FRUTILLADA

INTRODUCCION

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino

integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos
y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas,
obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un
sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el
crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que
recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos puros a partir de una población
microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en
medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de
microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch
introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del
medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para
diferenciar distintas especies microbianas.

Por otro lado la tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el
laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente
familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina
del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana
(cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de gram . Esta
tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias).Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen
de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo
así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que
confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas depeptidoglicano así como algo de ácido
teicoico. Generalmente, 80% - 90% de la pared de la célula Gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa
mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo10% - 20% de
la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.
CAPITULO I. PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA

1.1 PROBLEMAS DE LA INVESTIGACIÓN

En todos los ecosistemas encontrados en el planeta tierra se hace evidente la

participación de seres inertes y vivos que dan existencia a los entornos, desde el
más grande mamífero hasta los parásitos, bacterias y hongos; cabe mencionar que
los hongos son organismos eucariotas que habitan en gran variedad de superficies,
en lechos y otras especies. Estos organismos cuyas formas vegetativas son
extremadamente diversas yendo desde las más simples formadas por una sola
célula (levaduras) o también caracterizados por presentar estructuras filamentosas
de mucho más tamaño y características morfológicas complejas diferenciadas
(Hongos). Desde el punto de vista de su supervivencia, los hongos son organismos
heterótrofos y obtienen los nutrientes por absorción de un sustrato determinado.
(Steinberg, 2007). Esta clase de organismos se reproducen sexual o asexualmente
por medio de esporas, la unidad estructural de los hongos es la hifa, cuya
características morfológicas se expresan en forma de segmento cilíndrico y
filamentoso de crecimiento apical, proliferando a través del sustrato. Con respecto
al protoplasma fúngico, este está rodeado de una pared celular externa la cual está
formada por quitina y glucanos. Como en otros organismos la principal función de
la pared fúngica es la de protección osmótica y física, presentando permeabilidad
selectiva y el espacio periplasmático tiene una función de reconocimiento célula-
célula que le otorga una característica entre las células del mimo hongo y los
demás seres que habitan en su entorno, principalmente simbiontes. (Steinberg,
2007).

1.2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION

1.2.1 OBJETIVO GENERAL

Sembrar y aislar bacterias, hongos y levaduras de alimentos en medios

de cultivo
1.2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar las características de las colonias bacterianas en los diferentes

medios de cultivo usados.
Evaluar las características de las colonias bacterianas en los diferentes
medios de cultivo usados.
Determinar las características de las bacterias y hongos al microscopio
óptico.
Cuantificar las colonias de bacterias y hongos en muestras de alimentos
(UFC/ g).

1.3 JUSTIFICACIÓN

La taxonomía bacteriana tiene como objetivo la construcción de sistemas que

permitan clasificar a las bacterias. Dentro de la clasificación taxonómica, las
categorías y definiciones más utilizadas son familia (un grupo de géneros
relacionados entre sí), género (un grupo de especies relacionadas entre sí), especie
(un grupo de cepas relacionadas entre sí), tipo (grupos de cepas interrelacionados
dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento
concreto de una especie en particular). Uno de los factores clave para identificar a
las bacterias como agentes patógenos depende de su aislamiento en cultivo puro.
Una colonia en cultivo puro está compuesta por un solo tipo de microorganismo y
procede de una sola célula original. Las pruebas de identificación se deben hacer
siempre con colonias únicas procedentes de cultivos puros. Criterios y ejemplos
metodológicos aplicados a la identificación bacteriana Criterio Metodología de
ejemplo Observación macroscópica Observación e inspección de colonias:
disposición, tamaños, textura, formas, pigmentos, etcétera Observación
microscópica Tinciones: formas, agrupación, esporas, cápsula, flagelos, etcétera
Metabolismo Baterías bioquímicas: uso de sustratos (oxidación/fermentación),
producción de metabolitos secundarios, etcétera Otras propiedades Resistencia a
antibióticos: antibiograma y antibiotipos, ribotipos, fagotipos, estudio de las
concentraciones mínimas inhibitorias, estudio de sinergias o antagonismos(Lopez
2006).
CAPITULO II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo para caracterizar su crecimiento,
hacer su identificación y determinar sus actividades metabólicas.

Los hongos que conforman a los mohos y levaduras requieren de medios de cultivo
específicos para su aislamiento en cultivo puro. Es importante aplicar técnicas de
siembra específicas para aislar, propagar e identificar a las bacterias y hongos, así como
tener en cuenta los medios de cultivo en los que se hará la siembra.

2.1 CULTIVOS EN PLACAS

Se utiliza cuando se necesita una gran superficie de medio (elevada reacción

superficie/volumen), generalmente para separar una mezcla de bacterias, es decir,
para el aislamiento y resiembra hasta llegar a cultivos puros, que son aquellos que
contienen un único tipo de microorganismos. Podemos distinguir dos tipos de
técnicas:

2.1.1 PLACA PREPARADA

2.1.1.1 Preparación de las placas

En condiciones asépticas, se depositan 10-15 ml de medio fundido estéril
en una placa de Petri también estéril, de manera que forme una delgada
capa que se deja solidificar. La parte exterior del tubo de ensayo o del
frasco que contiene el medio liquido debe secarse antes para proceder al
llenado de las placas, con el fin de evitar que caigan en su interior gotas
de agua.

2.1.1.2 Secado de las placas

Una vez llenas las placas y solidificado el medio, estas deben secarse ya
que la humedad que se forma sobre la superficie del medio podría
impedir la formación de colonias aisladas.

Secado rápido. Las placas se secan a 37°C en estufa durante 24-60

minutos. En primer lugar, se coloca la tapa de la placa invertida y
después se invierte la parte d la misma que contiene el medio,
colocándose de tal forma que una parte de la misma s apoye sobre
la tapa. Con este método de secado se evita la contaminación
producida por el polvo.

Secado convencional. También pueden secarse las placas cerradas

en estufa durante uno o más días hasta la total evaporación del agua
 condensada en las tapas, sin quitar estas y colocando como siempre
las placas en posición invertida. Por este procedimiento, también se
detecta al mismo tiempo si una placa ha resultado contaminada.

2.1.1.3 Siembra de las placas

En términos microbiológicos se entiende por siembra el proceso
mediante el cual se lleva una porción de una población de
microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo
para su crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de
microorganismos en los medios de cultivo siempre se debe realizar en
zonas asépticas, cerca del mechero bunsen o en cámara de flujo laminar.

Los medios de cultivo que se van a utilizar dependen del tipo de muestra
y de los microorganismos presentes en ella, pero deben ser medios
sólidos en placa y tubos.

Siembra por puntura en tubo. Se siembra introduciendo el asa por

el centro del medio, dependiendo de la prueba que se realiza, se
puede introducir hasta tocar el fondo del tubo y retirar por el mismo
trazo cuando se realiza diferenciación bioquímica. Se siembra por
puntura en un medio hasta la profundidad de 1.5 cm. para la
determinación de movilidad y prueba de hidrólisis. Esta técnica se
realiza para realizar la diferenciación bioquímica y determinar la
motilidad.

Siembra por diseminación o siembra en superficie. Se hace la

extensión en la superficie, distribuyendo, empleando una espátula o
un asa de Driglaski, el inóculo por toda la superficie del medio de
cultivo contenido en la placa. Luego, sin volver a cargar la espátula
o asa, se repite el proceso tantas veces como sea necesario diluir la
concentración del inoculo hasta asegurar el aislamiento de las
colonias, preferiblemente una.

Siembra por estrías por agotamiento en superficie en placas

Petri

‐ Tomar una muestra con el asa de siembra previamente

flameada y fría, inocular la muestra haciendo 3 a 4 estrías
juntas de lado al lado sobre el primer cuadrante y cerrar la
placa.
 ‐ Flamear el asa de inoculación y hacer girar la placa petri y
abrir nuevamente la placa y tocando con el asa de siembra las
estrías originales hacer un segundo grupo de estrías en el
segundo cuadrante.
‐ Repetir el procedimiento por tercera vez en el tercer cuadrante.
‐ Cerrar la placa rotular la fecha y nombre del grupo de trabajo.
‐ Esta técnica se realiza con la finalidad de obtener colonias
separadas y hacer un estudio microscópico de las colonias y un
estudio de diferencial.

Siembra en masa o método de dilución

Utiliza todo el medio de cultivo, y no como en los dos apartados
anteriores que utilizaban exclusivamente la superficie. Podemos
bien depositar en un aplaca hacia una gota de material objeto de
nuestro estudio y verter sobre ella el medio de cultivo, teniendo la
precaución de que este fundido, pero a temperatura adecuada
(45°C) para homogenizar o bien preparar el medio de cultivo
fundido y atemperado en un tubo de ensayo, sembrar l material
objeto de estudio, homogenizar por rotación vertical y verter el
contenido en placa Petri. A esta técnica también se la denomina
siembra en masa, y le es aplicable una doble capa con otros 5 ml de
medio una vez solidificado el primero, si queremos trabajar en
condiciones de microaerofila.

2.1.2 CULTIVOS MEDIANTE DILUCIONES SERIADAS

El método de dilución, utilizando la siembra en masa o en superficie, o

utilizando el método de tubos de fermentación múltiple, también puede
hacerse cuantitativo.
Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de
esterilidad con objeto de sembrar cantidades conocidas de las mismas placas
de Petri (o en tubos de cultivo según algunas técnicas de recuento). Es obvio
que utilizando varias diluciones alguna de las mismas será tal que originará
en la placa colonias separadas y por tanto puras y, además, susceptibles de
ser contadas para la utilización en las técnicas de recuento. Por tanto,
conocidos el número de colonias, la cantidad sembrada y la dilución
correspondiente, esta técnica permite evaluar el número de gérmenes viables
de la muestra original. Existen varios métodos y se realizan con pipeta, pues
se necesita relaciones de volúmenes exactas.

2.1.2.1 Obtención de las diluciones seriadas

 Las diluciones decimales se preparan a partir de una disolución madre
(10-1, obtenida a partir de 10g o 10 ml de muestra en 90ml de diluyente),
tomando con una pipeta estéril 1 ml de la misma para llevarlo sobre un
tubo con 9 ml de diluyente, agitando y etiquetando, para repetir el
proceso (siempre con una pipeta estéril nueva) tantas veces como
diluciones necesarias. A cada denominador de la fracción considerada (o
inversa de la dilución) se le denomina factor de dilución y es
imprescindible para realizar el recuento.

2.1.2.2 Transferencia a las placas

Generalmente se transfiere 0.1 o 1 ml d cada tubo seriado a la placa (en

función de si realizamos una siembra en superficie o en masa) o a los
tubos de cultivo si así lo requiere la técnica de recuento. Si se desea
utilizar una sola pipeta, para la siembra de varias diluciones, se debe
comenzar por la del factor de dilución más alto (la más diluida), y seguir
por este orden. En caso contrario, habrá de emplearse una pipeta para
cada dilución. Todas las pipetas deberán depositarse en recipientes con
solución esterilizante después de su uso.

2.2 TECNICAS DE AISLAMIENTO

Permite la obtención de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo,
aguas, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana.

2.3 COLORACION GRAM

La coloración de Gram, permite visualizar a las bacterias y clasificarlas en dos
grupos (Gram positivas y Gram negativas), así como también agruparlas según su
morfología (cocos, bacilos, espirales, etc.).

Los principales procedimientos de coloración empleados en microbiología pueden

ser agrupados

en tres categorías:

2.3.1 COLORACIÓN SIMPLE

Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente tiñe a los
microorganismos.

Este tipo de tinción se denomina directa y está destinada a hacer más fácilmente
visibles las células al

microscopio. Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el

aspecto de las células,

que permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa, como ya desarrollamos

anteriormente. La
 tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.

2.3.2 COLORACIÓN DIFERENCIAL

Destinada a ayudar en la clasificación de las bacterias, es aquella que emplea
secuencialmente

dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en función de

diferencias en su

estructura y composición química. La tinción de Gram y la ácido-alcohol-

resistente, basadas en las

propiedades de la pared celular bacteriana, son las más utilizadas.

2.3.3 COLORACIONES ESPECIALIZADAS

Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar
presentes en los

microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea únicamente una parte

de la célula. Se utiliza

este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas,

endosporas, flagelos o

inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).

2.4 MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

Los microorganismos son seres vivos tan pequeños que es necesario hacer uso de
microoscopios para poder apreciarlos. Los microorganismos se encuentran en
todas partes: en las personas, alimentos, animales, suelo, agua, aire, plantas,
utensilios, equipos y ropa. Este hecho permite que los microorganismos sean
omnipresentes, es decir están en todo lugar.

2.5 FACTORES DE CONTAMINACION DE LOS ALIMENTOS

Todos los microorganismos requieren de ciertos condicionantes para crecer y
reproducirse. Comprender y conocer cuáles son resulta esencial para mantener la
calidad de los alimentos. Hay condiciones que están presentes en los alimentos de
forma natural (factores intrínsecos) y otros que dependen de las condiciones
ambientales (factores extrínsecos). En el primer caso, debe tenerse en cuenta que
la multiplicación de microorganismos está influenciada en gran medida por las
características inherentes de los alimentos. Así, estos se multiplican de manera
más rápida en alimentos nutricionalmente ricos en agua, con un pH neutro,
actividad de agua y ciertas estructuras biológicas. En cuanto a los factores
extrínsecos, influyen la temperatura y el tiempo.
 •Agua. Se trata de un requisito esencial para que crezcan los microorganismos.
Sin este componente, el crecimiento disminuye o se detiene, de ahí que una de las
formas usadas para alargar la vida de algunos alimentos sea la deshidratación.

•Oxígeno. Algunas bacterias necesitan oxígeno para crecer (aerobios), mientras

que otras solo pueden hacerlo en ausencia de oxígeno (anaerobios), como
Clostridium botulinum.

•Temperatura. Las bacterias son capaces de crecer en un intervalo amplio de

temperaturas y, por lo general, se clasifican de acuerdo con la temperatura a la que
crecen. La temperatura adecuada más peligrosa está entre los 5 ºC y los 65 ºC, ya
que es en la que se encuentran mejor para multiplicarse. Es importante recordar
que el calor elimina los microorganismos y que la congelación los detiene, es
decir, no se mueven ni se multiplican, pero no se destruyen. A temperaturas de
refrigeración, los patógenos se multiplican pero mucho más despacio que a
temperatura ambiente.

•Tiempo. Si las condiciones son buenas (agua, nutrientes y calor), cuanto más
tiempo pase, más se multiplicarán y más elevado será el riesgo para el
consumidor. Por este motivo es importante mantener los alimentos a una
temperatura adecuada y protegerlos de las distintas agresiones.

•Acidez. La acidez o alcalinidad de un alimento se mide por el pH, un factor

determinante para controlar el crecimiento bacteriano. Los valores de pH van
desde el 1 al 14 y se considera el 7 como valor neutro. Si el nivel es superior a 7,
se dice que el alimento es alcalino; en cambio, un valor inferior a 7 indica un
alimento ácido. Se estima que la mayoría de microorganismos patógenos crecen a
un pH más bien neutro, entre 5 y 8. En alimentos ácidos y, por tanto, con un pH
bajo como el limón y el vinagre, la acción conservadora es mayor.

•Nutrientes. La mayoría de los alimentos contienen suficientes nutrientes para que

las bacterias puedan crecer, sobre todo en los lácteos, huevos, carnes y aves de
corral y marisco. Las bacterias requieren elementos como carbono, nitrógeno,
hidrógeno y fósforo, entre otros.

2.6 BUENAS PRÁCTICAS

Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos,
todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con
precaución por su potencial patogenicidad.

Debido a que las bacterias y otros microorganismos tienen un tamaño muy

pequeño, se requiere de tinciones biológicas para visualizarlos, demostrar detalles
de su estructura interna, o algunas funciones fisiológicas; además estos colorantes,
son utilizados como indicadores de pH en los medios de cultivos, y como
indicadores REDOX par demostrar la presencia o ausencia de condiciones de
Anaerobiosis. En su mayoría, los colorantes útiles son derivados del Alquitran. La
estructura fundamental alrededor de la cual están constituidos químicamente la
mayoría de los colorantes es el anillo Bencénico. La diferencia de los colorantes
se basa en el número y disposición de estos anillos y la sustitución de los átomos
de Hidrógeno por otras moléculas.

Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea

de microrganismos. En hábitats naturales raramente encontramos un solo tipo de
microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer algún
procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de
microorganismos presentes. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien
separadas (las colonias se forman a partir de una sola “unidad formadora de
colonias”) de las que se conseguirá un cultivo puro. Una vez obtenidos los
cultivos puros se podrán estudiar las características macroscópicas, microscópicas,
fisiológicas, etc. de un microorganismo en particular. Hay que tener en cuenta que
siempre el aislamiento se da en un medio sólido. El medio líquido sirve para
enriquecer, pero no para aislar. El aislamiento se puede lograr directamente a
partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción
adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra
en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se
lleva a cabo un procedimiento que involucra una primera etapa de aumento del
número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la
población (enriquecimiento). Luego se aísla por el método de estrías o por
dilución y se identifica.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

A) Métodos generales

1) Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y posterior

quemado y dilución)

2) Por mezcla.

B) Métodos especiales (calentamiento, agregado de álcali o ácido, por

temperatura de incubación, cambios en el pH y presencia de sales o colorantes).
Estos métodos sirven cuando se desea aislar un microorganismo que posea una
característica especial (resistente al calor, anaerobio, etc)
CAPITULO III. MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES

3.1.1 Materiales para la siembra

Muestras: 10g ceviche y 10 ml de frutillada

Placas con medios de cultivo; agar Baird Parker, agar MacConkey, agar
nutritivo y agar de Sabouraud (estériles)
Pipetas estériles (1 de 10ml y 10 de 1 ml)
2 frasco de vidrio de 100 ml contenido con 90 ml de diluyente (agua
destilada estéril)
Espátula estéril
Mechero Bunsen
Balanza
6 tubos de ensayo contenidos con 9 ml de diluyente
Asa de siembra (asa de Driglaski y asa de vidrio acodada)
Papel craft
Fósforo encendedor
Lápiz marcador de cera o diamante
Incubadora
Hilo de Pabilo

3.1.2 Materiales para la coloración gram

a.- Solución Cristal violeta

Disolver 2 gramos de cristal violeta en 20 ml de alcohol etílico al 90% y

filtrar en filtro corriente o algodón.
Disolver 0.2 g de oxalato de amonio en 20 ml agua destilada. Mezclar
estas soluciones en partes iguales.

b.- Solución de Lugol

Disolver 2 g de yoduro de potasio en 5 ml de agua destilada, adicionar 1 g

de cristales de yodo a la solución de yoduro de potasio y agitar hasta que
el yodo se disuelve, finalmente adicionar agua destilada hasta completar
300ml.
Solución safranina
 Disolver 2.5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico 95%, este seria la
solución stock de safranina. De esta solución se toma 10 ml para diluir en
90 ml de agua destilada.

c.- Alcohol acetona

Mezclar alcohol etílico 95% y acetona en partes iguales para determinar

bacterias gram negativas y gram positivas.

3.1 MÉTODOS

El aislamiento de los diversos microorganismos contenidos en la muestra

problema se llevó a cabo sobre la superficie de un medio de cultivo sólido
contenido en una placa de Petri, siguiendo la técnica de la siembra por estría en
superficie y agotamiento.

3.3 PROCEDIMIENTO

3.3.1 Procedimiento para el aislamiento de microorganismos de las muestras de queso y

frutillada.

a. Preparación de diluciones decimales

Se preparó la muestra a investigar disolviendo la muestra (10g de queso y

10 ml de frutillada por separado) en los frascos de vidrio y se
homogenizó agitando durante 5 minutos. Estas fueron las suspensiones
madre (suspensión madre A= muestra de queso disuelta en 90 ml del
diluyente y suspensión madre B= muestra de frutillada disuelta en 90 ml
del diluyente) y se rotularon como 10-1. Seguidamente se tomaron con
una pipeta estéril 1 ml de las suspensiones madre A y B, y se
transfirieron a los tubos de ensayo contenidos con 9ml de diluyente y se
homogenizaron. Se marcó la dilución como 10-2. Se transfirió con una
nueva pipeta estéril de las suspensiones 10-2 a 2 tubos que contengan 9ml
de diluyente y se homogenizó. Se rotuló como 10-3. Se volvió a transferir
con una nueva pipeta estéril de las suspensiones 10-3 a otros 2 tubos que
contenían 9ml de diluyente y se homogenizaron. Se marcó como 10-4.

Durante el procesamiento se utilizó el mechero Bunsen que, debido a que

fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz
de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo
de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen
considerablemente.
 b. Recuento en superficie

A partir de las diluciones decimales (-2), (-3) y (-4) y por duplicado, se

transfirió 0.1 ml de cada dilución a ca da placa ya marcada con la
dilución empleada mediante una pipeta estéril. Se diseminó el inóculo
por toda la superficie con un asa de Driglaski y asa de vidrio acodada.
Seguidamente, se dejaron en reposo las placas hasta la absorción del
inóculo. Luego se envolvieron de tres en tres con papel craft y hilo de
Pabilo y se incubaron a 25°C durante 72 horas. Transcurrido este tiempo
se contaron las colonias que crecieron sobre los medios de cultivo. Se
calculó el resultado, expresado en unidades formadoras de colonias
(UFC) mediante la fórmula:

N= 𝑉 𝑋 𝐷

: Promedio total de colonias

V: Volumen en ml.
D: Dilución
N: Población ( ufc/gr.)

IV.- RESULTADOS
1.-CUANTIFICACION Y DETERMIANCION DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Y GRAM NEGATIVAS.

Muestras AGAR Mac conkey AGAR Bair parker

Numeración Coloración gram Numeración Coloración gram

ufc/gr. ufc/gr.

Queso 4.98*10⁵ Bacilos gram 4*10⁴ cocos gram

Fresco negativo positivos

bacilos gram
positivos

2.-DIFERENCIAS ENTRE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS.

Diferencias entre bacterias Gram positivos y Gram negativos

Gram positivos Gram negativos

Las bacterias gramnegativas son todas

Se le denomina bacterias grampositivas, o
bacterias Gram-positivas, son aquellas que
se tiñen de azul oscuro o violeta por la
tinción de gram. Esta característica química
está íntimamente ligada a la estructura de la
envoltura celular, por lo que refleja un tipo
natural de organización bacteriana. Son
grupos principales de bacterias y cuando se
tratan como taxón se utiliza también el
nombre de Posibacteria y las que restan son
las bacterias gramnegativas.
aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de
violeta por la tinción de Gram, y lo hacen
de un color rosado tenue: Es por eso el
nombre gramnegativas o también Gram-
negativas. Esta característica está
íntimamente ligada a la estructura
didérmica dada por la envoltura celular, ya
que presenta doble membrana celular (una
es externa y la otra citoplasmática) lo que
refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales
supergrupos de bacterias y cuando se trata
como taxón se le puede llamar con el
nombre de Negibacteria o bien Didermata.
Las que restan son las bacterías
grampositivas.

V.- DISCUSIONES
1.- Explica ampliamente ¿Por qué las bacterias se tienen de violeta y color rojo?

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que

se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de
"Gram-positivas" o también "Gram positivas". Esta característica está
íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo
natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias,
y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria. Las
restantes son las bacterias Gram negativas.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana

citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de
peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de
 peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable
de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-negativas,
estas bacterias no presentan una segunda membrana lipídica externa.

Se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tiñen de

azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de ahí el nombre de "Gram-
negativas" o también "gramnegativos". Esta característica está íntimamente ligada
a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de
organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y cuando
se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Negibacteria.

TRABAJO ENCARGADO

1.- FUNDAMENTE LA COLORACIÓN GRAM.

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en
18841. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a
las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

2.- ¿POR QUÉ SE DENOMINA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM

NEGATIVAS?

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano,
además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el
ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como
mureína).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada, y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína,
fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su
rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporción que las gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración se debe a que la membrana

externa de las bacterias gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo
la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada
como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por
lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Por el contrario,
las bacterias gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor
proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino
que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el
complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.

3.- ¿POR QUÉ ES IMPORTANTE REALIZAR LA COLORACIÓN DE ESPORAS? QUE

ESPECIES BACTERIANAS FORMAN ENDOSPORAS.
Como un modelo simplificado para la diferenciación celular, los detalles de la endóspora se
han estudiado extensivamente, especialmente el bacilo subtilis. Estos estudios han
contribuido al estudio de los genes, transcripción y unidades del factor sigma de la
polimerasa del ARN.

De forma siniestra, las endósporas de Bacillus anthracis fueron utilizadas en los ataques con
ántrax del 2001. El polvo encontrado en las cartas estaba contaminado con endósporas del
ántrax. La ingestión, inhalación o contaminación de la piel con estas endósporas, etiquetados
incorrectamente como "esporas", produjeron gran cantidad de muertes(Gobernado 2003).

VI.- NORMAS Y RECOMENDACIONES

6.1.- Sobre el vestido, aseo y efectos personales

- Al laboratorio se debe acudir con bata blanca.

- El trabajo en la proximidad de la llama del mechero obliga a

- Evitar las mangas amplias

- Llevar el pelo recogido

- Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y
jabón.
 - Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la
realización de la práctica deben estar debidamente guardados y apartados del lugar
de trabajo.

- No está permitido comer, beber, maquillarse y por supuesto fumar dentro del
laboratorio.

- Se evitará utilizar teléfonos móviles durante la realización de las prácticas.

6.2.- Sobre la mesa de trabajo

· El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más
habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

· El trabajo en Microbiología se realiza mayoritariamente en la atmósfera que rodea a

una llama de mechero bunsen . Es importante trabajar con concentración y llevar
cuidado para no provocar llamaradas ni sufrir quemaduras. Hay que apagar siempre el
mechero bunsen cuando se va a abandonar la mesa de trabajo.

· Al finalizar el trabajo del día, se debe recoger el material y limpiar la mesa sustituyendo
el papel de filtro si es necesario. El mantenimiento de la mesa de trabajo es
responsabilidad de los alumnos/as durante todo el periodo de prácticas.

6.3.- Sobre los residuos

Los residuos que se generan en el laboratorio pueden ser de diversos tipos. Cada cual
debe desecharse en el contenedor que le corresponde. Tendremos tres tipos
fundamentales de residuos:

· Residuos NO de riesgo, que van en las bolsas convencionales de basura.

· Residuos Biopeligrosos, que van en contenedores especiales marcados con el símbolo

de biopeligrosidad (ver figura 2). Nunca se debe tirar nada contaminado por el
fregadero o a la basura común.
· Residuos de cristal (portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur…) van
en contenedoes rígidos de sobremesa (figura 2).

· Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra o material que contenga
microorganismos (placas, portas, tubos, etc.) del laboratorio.

· No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre propipetas manuales o pipetas
automáticas.

· En caso de accidente (rotura de material, derramamiento de microorganismos,

quemadura, etc.) se comunicará inmediatamente al profesor. Existen duchas y lavaojos de
seguridad (figura 3), así como productos absorbentes especiales para los derrames
accidentales (Figura 4)

· El laboratorio debe disponer siempre de botiquín de primeros auxilios debidamente

equipado (Figura 5).
VII.- CONCLUSIONES

Como principal característica que pudimos apreciar mediante la coloración Gram es que
las bacterias Gram positivas se observan de color azul oscuro a morado, mientras que las
Gram negativas se observan de color rosa a rojo. Asimismo, López (2014) señala que los
principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de
las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La
pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram
positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan
con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de
peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas
explica y determina las características tintoriales.

Por otro lado las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan
en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de
un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran
variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes
agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de
Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico,
mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy
particulares en el rubro de la parasitología. Hay técnicas tintoriales específicas de gran
utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de
enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de
lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las
diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para
el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa.

Se puede concluir que la preparación en fresco no permite aumentar el contraste de la

preparación sin embargo la ventaja que tiene es que también es útil para observar la
movilidad de las bacterias.

Las preparaciones fijadas y teñidas en este caso tinción de Gram son las más utilizadas
en Microbiología por dos razones:

La tinción facilita la visualización de la bacteria

 Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.

En la práctica al realizar una preparación en fresco se tiene que tener cuidado debido a
que la bacteria sigue viva y en la tinción de Gram la bacteria está muerta
ANEXOS

1.- Plaqueado y preparacion de medios de cultivo

2.- Coloracion gram y cuantificacion de bacterias.

REFERECIAS BIBLIOGRAFICAS

1.- Gram, C. (1884). The differential staining of Schizomycetes in tissue sections and
in dried preparations. Fortschritte der Medizin, 2, 185-9.

2.- BASUALDO, J. A., MICROBIOLOGA, P. I., & ASUNCION-PARAGUAY, M.

S. P. Y. B. S. otros. Microbiología. Biomédica.

3.- Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.S errano y O.Velázquez.

2009.Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de
Química,UNAM. México

4.- Albornoz, H., Cuesta, A., Reyes Caorsi, W., Lombide, I., Vidal, L., & Dubner, S.
(2012). Recomendaciones para la prevención y manejo de las infecciones
relacionadas al implante de marcapasos y cardiodesfibriladores. Revista Uruguaya
de C1.- López-Hontangas, J. L., Castillo, F. J., & Salavert, M. (2006). Técnicas de
identificación.
5.- Steinberg, G. (2007). Plan de crecimiento: una historia de motores y el
Spitzenkörper. Célula eucariótica, 6: 351-362.ardiología, 27(2), 206-210.

6.- Contreras, L. Y. S., & Riaño, A. L. R. (2013). Aislamiento de microorganismos

para control biológico de Moniliophthora roreri. Acta agronómica, 62(4), 370-378.
PRÁCTICA Nº 5
 CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AMBIENTE DEL
LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA

INTRODUCCIÓN

La gran versatilidad metabólica de los microorganismos, como ya se comentado, hace

que los podamos encontrar prácticamente en cualquier entorno. Los alimentos son
fácilmente colonizados (o contaminados), ya sea de forma natural, en origen, o durante su
transporte, su procesado o su posterior manipulación. De especial relevancia además del
control de alimentos, incluido el agua (aunque carezca de principios nutricionales), es el
control del medio ambiente.

Dentro del análisis del medio ambiente, además del análisis del aire y del suelo, resulta
muy solicitado el análisis de superficies y de manipuladores de alimentos. Cuando se
trabaja en microbiología de los alimentos es importe determinar el grado de
contaminación ambiental, ya que las condiciones higiénicas del lugar de trabajo
(superficies, utensilios, etc.) y del propio manipulador va a depender en parte del número
y tipo de microorganismo presentes en el alimento. Es por ello que ….

1. OBJETIVOS:

1.1 OBJETIVO GENERAL:

Cuantificar la carga microbiana en el laboratorio de biología y

microbiología utilizando el método de análisis de microorganismos por
sedimentación

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Evaluar la diversidad microbiana del laboratorio de biología y
microbiología
Expresar los microorganismos presentes en el laboratorio de biología y
microbiología en unidades formadoras de colonias (UFC) expuestas al
ambiente por 20 minutos.

2. MARCO TEÓRICO

2.1 CONTROL DEL AIRE

El aire, además de partículas en suspensión, porta bacterias o sus esporas,

hongos, virus y otros microorganismos. Por ellos, puede ser causa tanto de
contaminación de los alimentos y las superficies, como de las infecciones en
los hombres (patologías respiratorias, etc.).

Un control periódico y repetitivo de las condiciones de higiene del aire

ambiental (como de las superficies), desde el punto de vista microbiológico se
impone hoy tanto en el ámbito de lugares públicos (hospitales, guarderías etc.)
como en la industria (alimentaria, cosmética y farmacéutica principalmente),
oficinas e imprescindiblemente en laboratorios.

2.2 MÉTODOS DE CONTROL DEL AIRE

2.2.1 ANÁLISIS POR SEDIMENTACIÓN

Es el método más sencillo para la determinación de microorganismos del

aire, pero adolece que sus resultados son meramente orientativos de las
cifras de microorganismos presentes en el aire, estos están sujetos a las
corrientes de aire, al tamaño de las partículas en suspensión aérea, etc.

El método recurre a destapar las placas de cultivo en el lugar cuyo nivel de

contaminación se desea examinar, durante intervalos de tiempo
preestablecidos, para posteriormente incubar las placas en las condiciones
de tiempo y temperaturas más adecuadas al microorganismo a estudiar.

Así, para aerobios mesófilos totales se emplean placas PCA y tiempos de

incubación de 48 horas a 37°C (o mejor aún 72 horas a 31°C). Para el
estudio de microorganismos específicos como mohos, Legionella, etc, se
pueden emplear medios de cultivo selectivos y tiempos adecuados.
 En ambientes sin corriente de aire se estima que el número de unidades
formadores de colonias por placa abierta durante 15 minutos equivale al
número de unidades formadoras de colonias que precipitan en 0.1 m2 por
minuto. (Métodos del control del aire. Análisis por sedimentación)

2.2.2 ANÁLISIS POR FILTRACIÓN

Para realizar el método, es necesario disponer de un sistema de

filtración por aspiración. Por tanto, se conecta a una bomba de vacío
durante un tiempo predeterminado. El aire pasa por uno o más tamices
de diámetro de poro variable donde los microorganismos quedan
atrapados en la superficie de un material poroso, fibra de vidrio,
alginato o filtros de membrana.
Los filtros recogen los microorganismos por sedimentación, impacto,
difusión o atracción electrostática, son de policarbonato, esteres de
celulosa o cloruro de polivinilo, con un diámetro de poro desde 0.01
um, según la naturaleza de los bioaerosoles.

Para realizar la filtración se han diseñado aparatos portátiles con una

bomba de vacío y un flujo de aire de1 a 50 litros por minuto. Los
filtros se pueden llevar, posteriormente, sobre las placar de agar con el
medio de cultivo deseado, o incluso utilizar las placas de filtración en
membrana para su posterior incubación en las condiciones óptimas de
crecimiento para cada microorganismo o incluso para su observación
por microscopia.
El sistema permite una mayor precisión de la carga microbiana del
aire, siempre que conozcamos el caudal de aire aspirado por nuestro
sistema y tiempo de aspiración. Entre los problemas que destacan,
encontramos la perdida de viabilidad de las células vegetativas debido
a la desecación durante el muestreo. (Métodos del control del aire.
Análisis por filtración).

2.2.3 ANÁLISIS POR MUESTRO POR IMPACTO

Mediante un muestreador de aire, el aire ambiente a examinar es

aspirado a través de superficie perforada a una velocidad
preestablecida y durante una duración determinada, para ser guiado
sobre una placa de tipo RODAC que contiene el medio específico para
los microorganismos que propongamos investigar. Al final del
muestreo, la placa es quitada del sistema para su correcta incubación.
 Los microorganismos son así visualizados con el fin de ser contados.
Hay que insistir en que el flujo y el tiempo de muestreo sean
correctamente medidos para calcular el número de microorganismo
presentes por unidad de volumen de aire investigado.

Los valores obtenidos se llevan a unos índices de aceptabilidad

predeterminados, a partir de los cuales emitir un juicio sobre las
condiciones de higiene microbiológica del ambiente controlado.
(Métodos del control del aire. Análisis por muestreo por impacto.)

2.2.4 ANÁLISIS POR CHOQUE EN LÍQUIDOS

El fundamento es similar al impacto sobre medios sólidos y la fuerza

de inercia es esencial para separar los microorganismos contenidos en
el aire y que se depositen en el medio líquido.

El flujo de aire puede ser de 12.5 o 20 litros por minuto. Este método
también requiere una bomba de vacío. Estos dispositivos, también
llamados de “trampa líquida”, hacen pasar por el aire mediante un
aspirador; a través de líquidos (generalmente soluciones tampón
diluidas) que retienen los microorganismos.

Este líquido puede sembrarse en placa para determinar el número de

microorganismos, examinarse microscópicamente, o cualquier otro
método, sondas genéticas, reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
inmunoensayo y por citometría de flujo, etc. (Métodos del control del
aire. Análisis por choque en líquidos)

2.2.5 ANÁLISIS POR PRECIPITACIÓN ELECTROSTÁTICA

El precipitador más básico contiene una fila de alambres finos, seguido

por pialas de placa planas de metal especiadas aproximadamente un
centímetro. La corriente de aire pasa a través de los espacios entre los
alambres y después atraviesa el apilado de placas.

Una fuente de alto voltaje transfiere electrones de las placas hacia los
alambres, desarrollando así una carga negativa de varios miles de
voltios en los alambres, relativa a la carga positiva de las placas.
Mientras que la materia de partículas atraviesa la fuerte carga de
negativa de los alambres, la materia de partículas toma la carga
negativa y se ioniza. Las partículas ionizadas entonces pasan a través
de las placas cargadas positivamente, siendo atraídas por estas placas.
 Este sedimento puede ser recolectado para posteriormente ser
evaluado, como en las técnicas antes descritas, si bien se utiliza
normalmente como sistema purificador de aire. (Métodos del control
del aire. Análisis por precipitación electrostática)

2.3 MICROORGANISMOS ESTUDIADOS

De forma convencional, para obtener la indicación del estado general de las

superficies controladas, los microorganismos que se suelen utilizar son:

2.3.1 Bacterias aeróbicas mesófilas:

Para su cultivo se utilizan medios de cultivo que contienen
generalmente triptona, glucosa, extracto de levadura, agar y entre otros
componentes. Así, las placas Count-Tact, tienen la composición en g/L
de:

Triptona 15.0
Extracto de soja 5.0
Cloruro sódico 5.0
Lecitina 0.7
Polisorbato 80 5.0
Agar 20.5

También se puede utilizar Agar nutritivo, que es un medio de uso

general cuyo elemento básico es un caldo nutritivo solidificado con
agar.
Caldo nutritivo a pH=7.2 1.000mL
Agar 15g

2.3.2 Bacterias de origen fecal:

Generalmente se utilizan como indicadores los coliformes totales con

ayuda de medios usuales como el agar McConkey o el agar lactosa
desoxicolato, incubando a 37 °C durante 24-48 horas. La composición
del Agar McConkey en g/L es:

Digestión séptica del tejido animal 1.50

Caseína hidrolizada enzimática 1.50
Digestión pancreática de gelatina 17.00
Lactosa 10.00
Sales biliares 1.50
Cloruro de sodio 5.00
Cristal violeta 0.001
 Neutral rojo 0.03
Agar 15.00
2.3.3 Mohos:

Tanto para mohos como para levaduras se emplea como medio de

cultivo el agar dextrosa de Sabouraud (que incluye inhibidores del
crecimiento bacteriano) o rosa de bengala cloranfenicol para ser
incubado a 25-30°C durante 72- 120 horas. (Control de superficies, del
aire y del suelo. Microorganismos estudiados) Así, las placas con agar
Sabouraud, tienen la composición en g/L de:

Peptona de caseína 5.0

Peptona de carne 5.0
D(+)-glucosa 40.0
Agar-agar 15.0

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES

3.1.1 Para preparar los medios de cultivo:

Probetas graduadas de 200 ml

Agar Sabouraud
Caldo nutritivo
Agar-agar
Agua destilada
Balanza analítica
Autoclave
Algodón
Alcohol
Papel toalla
Plumón indeleble
Espátula
Mechero Bunsen
Frascos de vidrio de 250 ml

3.1.2 Para el aislamiento de bacterias y hongos:

Placas con agar Sabouraud y agar nutritivo

Papel Kraft
Incubadora
 3.1.3 Para el recuento:

Regla de 30cm
Lapicero
Lupa

3.2 MÉTODO

El método que se uso fue análisis por sedimentación por gravedad.

3.2.1 PROCEDIMIENTOS

3.2.1.1 Preparación de medios de cultivos:

Utilizando la balanza y la espátula se pesó en papel Kraft 13

gramos de agar de Sabouraud y se diluyó en un frasco de vidrio de
250ml, contenida con 200 ml de agua destilada. Para el agar
nutritivo se pesó 2.5 gramos de caldo nutritivo y 4 gramos de agar-
agar, se diluyó en 250 ml de agua destilada. Después se rotularon
con el plumón indeleble y se llevaron a la autoclave por 20 minutos
15 libras de presión a una temperatura de 120°C. Transcurrido este
tiempo; se sacaron los frascos y se colocaron en una mesa
desinfectada con alcohol para que se entibie, luego cerca al
mechero de bunsen (encendido) se distribuyó los medios en tres
placas Petri estériles (1 placa con agar Sabouraud y 2 placas de
agar nutritivo). Se dejaron a temperatura ambiente durante 30
minutos con la finalidad de que los medios se solidifiquen.
Finalmente se rotularon.

3.2.1.2 Aislamiento de bacterias y hongos:

Se eligió tres puntos en el laboratorio de microbiología, las aulas

1(mesa de prácticas) y 2 (encima de la incubadora). Seguidamente
se abrieron las placas durante 20 minutos, terminado este tiempo se
envolvieron con papel Kraft, se rotularon y llevaron a la incubadora
por 48 horas.

3.2.1.3 Recuento:

Se utilizó el método de cultivo por siembra en placa. Una vez

incubadas las placas, dividieron las placas de agar Sabouraud y
agar nutritivo en 4 cuadrantes. Posteriormente, se contaron en
 número de colonias formadas con la lupa, identificándolas como
hongos o bacterias.

4. RESULTADOS

Tabla 1. Microorganismos presentes en el aire del laboratorio de

microbiología

TOTAL
Medios de AULA 1 AULA 2 TOTAL
cultivo
Mohos Bacterias Mohos Bacterias
Agar Sabouraud 8 0 8 0 0 0
Agar nutritivo 1 25 26 3 6 9
34 9

La tabla nos muestra los resultados del recuento de microorganismos presentes en

el aire del laboratorio de microbiología por el método de sedimentación por
gravedad. En el aula 1 se utilizó placas con agar de Sabouraud y agar nutritivo.
Identificándose en el primero 8 colonias blancas y; en el agar nutritivo 23 colonias
blancas y 3 rosadas, siendo 25 colonias de bacterias. En el aula 2 se utilizó una
placa con agar nutritivo, se identificó 8 colonias blancas y 1 colonia rosada.

Placas contenidas con agar nutritivo y Sabouraud incubadas por 3 días

CONCLUSIONES

El aire no es estéril y los microorganismos en forma de aerosoles que alberga

pueden contaminar las superficies, equipos, herramientas y materiales del
laboratorio de microbiología por simple disposición de los mismos. Es por esto
que el control microbiológico del medio ambiente es imprescindible desde el
punto de vista higiénico y sanitario en los laboratorios y específicamente en el
laboratorio de microbiología ya que se trabaja con microorganismos. Por otro
lado; al realizar la práctica de control de calidad microbiológica del ambiente
nuestros resultados fueron aproximadamente 34 colonias en el aula 1 y 9 colonias
 en el aula 2, según lo observado hubo mayor número de colonias de hongos y esto
debido a la humedad del aire.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Control de superficies, del aire y del suelo. Microorganismos estudiados. (s.f.). En S. C.

Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 365).

D.B. Davis, N. D. (1997). Tratado de Microbiología (4ta ed.). Madrid: Masson.

Departamento de Biología, F. d. (s.f.). http://depa.fquim.unam.mx. Recuperado el 08 de

07 de 2018, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolos2014_1_24195.pdf

Ensayos, A. (2012). El Secreto de los Carbohidratos. En S. B. Healey, El Secreto de los

Carbohidratos (pág. 18:32). Planeta.

garrido, s. c. (2014). ensayos microbiologicos. madrid (España): sintesis, S.A.

L.M. Prescott, J. H. (2002). Microbiología (5ta ed.). Madrid: Mcgraw-Hill

Interamericana.

Métodos del control del aire. Análisis por choque en líquidos. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371). España.

Métodos del control del aire. Análisis por filtración. (s.f.). En S. C. Garrido, Ensayos
microbiológicos (págs. 466: 370-371).

Métodos del control del aire. Análisis por muestreo por impacto. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371).

Métodos del control del aire. Análisis por precipitación electrostática. (s.f.). En S. C.
Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 372).

Métodos del control del aire. Análisis por sedimentación. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (págs. 466:369-370).

Norvi, P. (s.f.). INFOTUR PERÚ. Recuperado el 08 de 07 de 2018, de

https://www.infoturperu.com.pe/index.php/noticias/gastronomia/item/149-
conozca-la-frutillada-una-bebida-tradicional-en-cusco

VALTEK, S. (s.f.). http://www.valtekdiagnostics.com. Recuperado el 08 de julio de 2018,

de http://www.valtekdiagnostics.com: http://andinamedica.com.pe/wp-
content/uploads/2016/08/Medio-LIA.pdf
 PRÁCTICA Nº 6

PRUEBAS PRESUNTIVAS Y CONFIRMATIVAS DE IDENTIFICACIÓN DE

BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS
 INTRODUCCIÓN

La identificación en “Microbiología General” consiste en la asignación de una bacteria o

microorganismo a un taxón según una clasificación establecida. Permite determinar la
especie, o incluso la cepa de una bacteria aislada previamente en una muestra. Para ello
se determinan las características fenotípicas y/o genotípicas del microorganismo y se
comparan éstas con las diferentes categorías de la clasificación considerada (L.M.
Prescott, 2002).

El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios

bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a
cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con
productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además contienen algún indicador
que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones.

Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por ejemplo:
carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su
identificación en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad química, las
bacterias se pueden clasificar como:

1. Zimógenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol,

ácido láctico o acético.

2. Aerógenas: las que producen gas como hidrógeno y dióxido de carbono como
resultado de su actividad metabólica.

3. Anaerógenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad

metabólica.

4. Cromógenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles.

5. Fotógenas: las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia

(algunas bacterias marinas).

Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos: Caldos de carbohidratos con
indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos carbohidratos, muchas bacterias
producirán ácido, y con un medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar éste a 6.8 por
el ácido que produce un cambio de color gracias a la incorporación de un indicador de pH
como es el rojo de fenol (D.B. Davis, 1997).
I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN

El problema de dicho informe nace por la necesidad que tenemos los

alumnos del curso de “Microbiología General” de aprender la utilización
de medios de cultivos para observar las reacciones metabólicas
relacionadas con la fisiología bacteriana, de muestras alimentarias.

1.2. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.2.1. OBJETIVOS GENERALES

Observar las reacciones bioquímicas (metabolismo) relacionadas

con la fisiología bacteriana.
Aprender la utilización de medios de cultivo TSI, LIA y agar
citrato para la identificación de enterobacterias.

1.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Evaluar la fermentación de azúcares (glucosa, lactosa y sacarosa) y

formación de gas, sulfuro de hidrógeno en el medio de cultivo
Triple Sugar Iron (TSI).
Evaluar la degradación de aminoácidos (triptófano y lisina) en el
medio Lisina y Hierro (LIA).
Evaluar la degradación de citrato en el medio citrato de Simmons.

1.3. JUSTIFICACIÓN

La lucha contra los microorganismos patógenos, causantes de

enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) requiere de
procedimientos adecuados de inspección sanitaria, lo que ha llevado al
desarrollo de métodos cada vez más rápidos y efectivos para la detección e
identificación de bacterias nocivas en las áreas en las que la seguridad
biológica.
II. MARCO TEÓRICO

2.1. METABOLISMO MICROBIANO

Los microorganismos en general, como todo ser vivo, pueden modificar

su entorno y utilizar los nutrientes en solución como fuente de energía
para su crecimiento y reproducción. Todas las actividades celulares son
mediadas por enzimas y los microorganismos producen todo tipo de
enzimas cuyas actividades se correlacionan.

Los microorganismos utilizan mucho carbohidratos como su principal

fuente de energía estos incluyen polisacáridos, disacáridos y
monosacáridos. Entre los productos comunes de hidrólisis de los
carbohidratos de carbono están los ácidos orgánicos (por ejemplo ácido
acético y ácido láctico) y gases tales como dióxido de carbono e
hidrogeno. De este modo la capacidad o incapacidad de un
microorganismo de romper un azúcar simple, combinación de azúcares, o
varios otros carbohidratos en el medio proveen información para la
clasificación de especies bacterianas. La fácil detección de ácido y gas
producido por especies de bacterias es de importancia en la práctica.

Muchas bacterias pueden degradar una variedad de proteínas y usar el

péptido resultante y aminoácidos para energía y para sintetizar sus
propias proteínas. La actividad proteolítica varía de especie a especie,
estas características pueden ser usadas para caracterizar una especie.

Los lípidos son descompuestos comúnmente por los microorganismos

en triglicéridos y fosfolípidos. Los triglicéridos son ésteres de glicerol y
ácidos grasos.

La descomposición de los triglicéridos por microorganismos causan

rancidez en alimentos que contienen gran cantidad de grasas (los ácidos
grasos formados causan el sabor y aroma rancio).

Otros microorganismos tienen la capacidad de utilizar la urea como

fuente de nitrógeno.

Entre los Gram negativos, el género Proteus sp., puede ser distinguido
de otros por su gran capacidad para producir grandes cantidades de
enzima ureasa.
2.2. DESCRIPCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS USADO PARA
LAS PRUEBAS
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el “Medio de Cultivo” y el crecimiento de
los microorganismos es el “Cultivo”.

2.2.1 MEDIO AGAR TRIPLE SUGAR IRON (TSI)

Esta prueba se recomienda para la identificación de patógenos

entéricos Gram negativos. Se emplea para detectar la
fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de
ácido y gas, y también para detectar producción de ácido
sulfhídrico (VALTEK, s.f.).

Composición

2.2.2 MEDIO AGAR CITRATO DE SIMMONS

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias en

base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono
y energía, el fosfato monoamónico como fuente de nitrógeno.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias

poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo tricarboxílico.
El desdoblamiento del citrato genera progresivamente,
oxalacetato y piruvato; este último, en presencia de un medio
alcalino, da origen a ácidos orgánicos que al ser utilizados como
fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de
la producción de citrato permeasa (VALTEK, s.f.).
2.2.3 MEDIO AGAR LISINA Y HIERRO (LIA)

El Medio de Lisina y hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo

ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram
negativos entéricos, especialmente miembros del género
Salmonella con capacidad de fermentación de lactosa, sobre la
base de la producción de H2S y la actividad de la enzima Lisina
decarboxilasa. También es posible observar cambios debidos a la
actividad de la enzima lisina deaminasa, característica del género
Proteus y Providencia. Las peptonas y el extracto de levadura
aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la dextrosa
constituye una fuente de energía. El citrato de amonio férrico y el
tiosulfato de sodio actúan como marcadores de la producción de
H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro
negro en el tubo. El agar actúa como agente gelificante Los
cambios en el pH se verifican gracias al contenido de púrpura de
bromocresol: la producción de ácido se ve como cambio del color
a amarillo con valores de pH inferiores a 5.2, en tanto que la
alcalinización como cambio del indicador hacia el púrpura con
valores de pH sobre 6.8. La actividad de la lisina decarboxilasa se
observa como un viraje hacia el color púrpura en todo el medio de
cultivo, o bien como medio de cultivo sin cambio (neutro) en la
columna de agar, en tanto que la ausencia de la enzima produce
un viraje hacia el color amarillo en la columna y neutro en la zona
inclinada (VALTEK, s.f.).
2.3. MUESTRA ANALIZADA (FRUTILLADA)

La llamada Frutillada es una bebida ancestral elaborada desde tiempos pre

incaicos, su uso fue predominantemente ceremonial y en festividades de las
diferentes culturas peruanas.

2.3.1. COMPOSICIÓN/ INGREDIENTES

3 kg de chicha de maíz.
2 kg frutillas.,
3 Litros de agua,
700 gramos de azúcar,
8 onzas aguardiente de caña,
½ kilo de harina de trigo,
1 atado hierbaluisa,
clavos de olor,
palitos de canela.

2.3.2. MICROORGANISMOS PRESENTES

En pueblos consumidores de maíz, como en México y Perú, hay un

problema con la disponibilidad de la niacina. Las dietas de maíz son
pobres en niacina lo cual conduce a enfermedades como el pelagra, pero
las levaduras en el maíz fermentado producen grandes cantidades de
niacina. Fermentar el maíz corrige esta deficiencia. La niacina por otro
lado es un antidepresivo, antidiabético, y tiene un positivo efecto de bajar
el colesterol. Deficiencias de niacina también están asociadas con la
esquizofrenia, la diarrea y la migraña. Con la ayuda de la clorofila y la
luz solar, las plantas crean glucosa a partir de dióxido de carbono y agua.
Los Saccharomycesson levaduras que siguen un orden inverso de las
plantas, degradan azúcares y lo convierten en dióxido de carbono y
alcohol. La cerveza se elabora de Saccharomyces cerevisiae, entre la lista
de otras levaduras silvestres para elaborar cerveza tenemos:
Brettanomyces lambicus y Bretanomyces bruxelensis.

En el caso de fermentos nativos, que toman levaduras del medio

ambiente tenemos las siguientes cepas: (Ensayos, 2012)

- Pseudomonas
- Lactobacilus
- Leuconostoc
- Schizosaccharomyces
- Endomycopsis
 - Hansenula
- Saccharomyces

III. MATERIALES Y METODOLOGÍA

3.1. MATERIALES

a. Agares

Agar Tres azúcares hierro (TSI).

Agar citrato de Simmons.
Agar lisina y hierro (LIA).

b. Muestra

Colonias bacterianas aisladas de alimentos (frutillada).

c. Instrumentos

Aguja de siembra.
Mechero bunsen.

d. Materiales de ayuda

Gradillas.
Fósforo.
Pipetas.
Autoclave y otros.

3.2. METODOLOGÍA

3.2.1. PROCEDIMIENTO

a. Degradación de carbohidratos (fermentación de lactosa, glucosa

y dextrosa)
La fermentación de lactosa, glucosa y dextrosa se realiza la siembra
en el medio TSI:

En el cual la siembra se realiza por picadura profunda y una

estría en la superficie (Ilustración N°3).
Inocular con una aguja de kolle la colonia bacteriana aislada a
partir de alimentos, sobre la superficie inclinada del triple azúcar
hierro.
 Incubar a 37°C por 24 horas.
La prueba es positiva cuando el medio vira del color y se
observa cambio de las características del medio de cultivo.

Ilustración 2: Siembra de medios con agar por estría simple. (a) En tubos
inclinados y por picadura (b) en tubos solidificados en forma recta.

b. Asimilación del citrato: agar citrato de Simmons

La habilidad de usar el citrato como única fuente de carbono y

energía distingue a ciertos bacilos gram negativos. El agar citrato de
Simmons contiene citrato como única fuente de carbono y energía. El
crecimiento en este medio indica una reacción positiva para la
utilización de citrato.

En ciertos microorganismos, queda una reacción positiva,

incrementan el pH del agar virando el indicador azul de bromo-timol
en el medio de verde a azul.

Procedimiento:

Inocular con una aguja de kolle la colonia bacteriana a evaluar,

haciendo siembra en profundidad de 1 cm dentro del medio de
cultivo del agar citrato de Simmons.
La prueba es positiva cuando el medio vira del color verde al
azul
Incubar a 37°C por 24 horas.

c. Degradación de aminoácidos: descarboxilación de la lisina

La descarboxilación de un amino acido consiste en la pérdida de su

grupo carboxílico para producir una amina y CO2.

La descarboxilación bacteriana puede ser demostrada por la

degradación del amino ácido, usualmente un procedimiento
 complejo o la formación de amina y CO2; también puede ser
demostrada midiendo la elevación del pH.

La descarboxilación de los aminoácidos aminados da como producto

la formación de diaminas como putresina y cadaverina (con
liberación de CO2) alcalinizando el medio de un modo acentuado.

Procedimiento:

Inocular con una aguja de kolle la colonia bacteriana a evaluar,

sembrando en profundidad hasta el fondo del medio de cultivo
lisina hierro agar.
Incubar de 37°C por 18 a 24 horas.

d. Degradación del triptófano: prueba del indol (reactivo de

kovacs)

El indol es un compuesto que contiene nitrógeno que puede ser

formado de la degradación del aminoácido triptofano por ciertas
bacterias. La prueba de indol es importante porque solo ciertas
bacterias forman indol y pueden ser fácilmente detectados. De este
modo la degradación del triptófano es otra reacción de
diferenciación. Las bacterias que poseen triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, acido
pirúvico y amoniaco.

Procedimiento:

Añadir 2 gotas de reactivo de kovacs sobre la colonia bacteriana

del medio de cultivo lisina hierro agar.
IV. RESULTADOS

a. Degradación de carbohidratos (Ilustración 4)

Parte inferior amarillo: fermentación de la glucosa.

Parte superior: fermentación de la lactosa.
Indicador del medio: rojo de fenol.
Ruptura del medio: producción de gas.
Ennegrecimiento del medio: H2S (pigmento negro presencia de sulfuro
de hidrógeno).

Ilustración 3: Interpretación gráfica de la degradación de carbohidratos.

b. Asimilación del citrato

La prueba positiva está representada por la producción de color azul

oscuro en el término de 24 a 48, que indica que el microorganismo en
prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con
formación de productos alcalinos (Ilustración 5).

Ilustración 4: Viración del color en la prueba de

asimilación de citrato.

c. Descarboxilación de la lisina (Ilustración 6):

A las 24 horas de incubación examinar el medio de cultivo; si se da el

cambio de color del medio al color amarillo por fermentación de la
 glucosa, produciendo ácido. Posteriormente al ocurrir la
descarboxilación del aminoácido el medio se torna alcalino y el
indicador vira al rojo.

Ilustración 5: Descarboxilación de la lisina.

d. Prueba del indol

La formación de un anillo color rojo fucsia (Ilustración 7) en la

interfase del reactivo y el cual indica la presencia del indol.

Ilustración 6: Resultados de la prueba Indol.

 DISCUSIONES

Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la

presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica
completa en uno o más microorganismos. Una de las técnicas rápidas más usadas para la
identificación de bacterias son las galerías API de bioMerieuxMR, las cuales permiten
identificar levaduras, bacterias entéricas, no entéricas, especies de Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Campylobacter, y otras más. En el
laboratorio se emplean frecuentemente las galerías API 20E, que es un sistema
estandarizado que permite la identificación de bacterias de la familia Enterobateriaceae y
otros bacilos Gram negativos, no exigentes (Departamento de Biología, s.f.).
 TRABAJOS CITADOS

Control de superficies, del aire y del suelo. Microorganismos estudiados. (s.f.). En S. C.

Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 365).

D.B. Davis, N. D. (1997). Tratado de Microbiología (4ta ed.). Madrid: Masson.

Departamento de Biología, F. d. (s.f.). http://depa.fquim.unam.mx. Recuperado el 08 de

07 de 2018, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolos2014_1_24195.pdf

Ensayos, A. (2012). El Secreto de los Carbohidratos. En S. B. Healey, El Secreto de los

Carbohidratos (pág. 18:32). Planeta.

garrido, s. c. (2014). ensayos microbiologicos. madrid (España): sintesis, S.A.

L.M. Prescott, J. H. (2002). Microbiología (5ta ed.). Madrid: Mcgraw-Hill

Interamericana.

Métodos del control del aire. Análisis por choque en líquidos. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371). España.

Métodos del control del aire. Análisis por filtración. (s.f.). En S. C. Garrido, Ensayos
microbiológicos (págs. 466: 370-371).

Métodos del control del aire. Análisis por muestreo por impacto. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371).

Métodos del control del aire. Análisis por precipitación electrostática. (s.f.). En S. C.
Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 372).

Métodos del control del aire. Análisis por sedimentación. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (págs. 466:369-370).

Norvi, P. (s.f.). INFOTUR PERÚ. Recuperado el 08 de 07 de 2018, de

https://www.infoturperu.com.pe/index.php/noticias/gastronomia/item/149-
conozca-la-frutillada-una-bebida-tradicional-en-cusco

VALTEK, S. (s.f.). http://www.valtekdiagnostics.com. Recuperado el 08 de julio de 2018,

de http://www.valtekdiagnostics.com: http://andinamedica.com.pe/wp-
content/uploads/2016/08/Medio-LIA.pdf
 BIBLIOGRAFÍA

Control de superficies, del aire y del suelo. Microorganismos estudiados. (s.f.). En S. C.

Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 365).

D.B. Davis, N. D. (1997). Tratado de Microbiología (4ta ed.). Madrid: Masson.

Departamento de Biología, F. d. (s.f.). http://depa.fquim.unam.mx. Recuperado el 08 de

07 de 2018, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Protocolos2014_1_24195.pdf

Ensayos, A. (2012). El Secreto de los Carbohidratos. En S. B. Healey, El Secreto de los

Carbohidratos (pág. 18:32). Planeta.

garrido, s. c. (2014). ensayos microbiologicos. madrid (España): sintesis, S.A.

L.M. Prescott, J. H. (2002). Microbiología (5ta ed.). Madrid: Mcgraw-Hill

Interamericana.

Métodos del control del aire. Análisis por choque en líquidos. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371). España.

Métodos del control del aire. Análisis por filtración. (s.f.). En S. C. Garrido, Ensayos
microbiológicos (págs. 466: 370-371).

Métodos del control del aire. Análisis por muestreo por impacto. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (pág. 466: 371).

Métodos del control del aire. Análisis por precipitación electrostática. (s.f.). En S. C.
Garrido, Ensayos microbiológicos (pág. 466: 372).

Métodos del control del aire. Análisis por sedimentación. (s.f.). En S. C. Garrido,
Ensayos microbiológicos (págs. 466:369-370).

Norvi, P. (s.f.). INFOTUR PERÚ. Recuperado el 08 de 07 de 2018, de

https://www.infoturperu.com.pe/index.php/noticias/gastronomia/item/149-
conozca-la-frutillada-una-bebida-tradicional-en-cusco

VALTEK, S. (s.f.). http://www.valtekdiagnostics.com. Recuperado el 08 de julio de 2018,

de http://www.valtekdiagnostics.com: http://andinamedica.com.pe/wp-
content/uploads/2016/08/Medio-LIA.pdf
¡He cambiado la letra a times new roman porque arial es muy grande y ya vamos 50
hojas!!!