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• Electroforesis
• Métodos de extracción de ADN
• Cuantificación de ADN
• PCR
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1. JUSTIFICACIÓN
Por encima de las consideraciones de tipo ético, que en muchos casos se quedan
en lo etéreo, es un hecho de facto que la biotecnología ya está aquí, que para bien
o para mal es la ciencia del futuro y que nos afectará a todos.
Para quienes nuestro diario vivir esta relacionado con los seres vivos, ya que
nuestro campo de trabajo esta entre animales y plantas, es un imperativo conocer
lo más a fondo posible, lo que esta en la vanguardia de las ciencias biológicas
aplicadas, que evidentemente es el desarrollo biotecnológico, pues como en
cualquier campo solo quien esta actualizado puede ser competitivo, esto es un
hecho innegable en la era del conocimiento.
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2. OBJETIVOS
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3. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN
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Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida
3.5 Aislamiento del ADN por la técnica de SALTING OUT: Este método
se utiliza cuando se quiere aislar ADN de buena calidad y en alta
concentración. El ADN obtenido es apto para estudios de PCR, RFLPs y
RAPDs. El ADN genómico total que se encuentra en los núcleos celulares
es liberado mediante rompimiento de la membrana celular, por la acción
conjunta de enzimas proteolíticas y un detergente iónico (SDS). Las
proteínas son removidas por medio de una alta concentración salina y el
ADN es recuperado por precipitación con alcohol. Las ventajas que
presenta éste método son la facilidad cuando se trabaja un alto número de
muestras y el evitar el uso de solventes orgánicos tóxicos.
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3.6 Electroforesis en gel de agarosa: La electroforesis en gel de agarosa
es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de
distintas procedencias. Los geles se comportan como un matiz molecular y
permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.
Moléculas de ADN de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en
una electroforesis en gel de agarosa. Además si en dicha electroforesis se
aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de ADN de tamaño
conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del ADN en estudio. A
los geles de agarosa se les añade bromuro de etidio, sustancia que se
intercala entre las bases del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con
luz ultravioleta.
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Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa
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3.7 Electroforesis capilar: La electroforesis capilar es una versión
instrumental de la electroforesis convencional. Es un método de separación
que se basa en la diferente velocidad de migración de las especies
cargadas y no cargadas en el seno de una disolución amortiguadora, a
través de la cual se aplica un campo eléctrico elevado y constante. Esta
técnica de separación, fue desarrollada, en primer lugar, por el químico
sueco Ame Tiselius, quien durante la década de los años treinta la aplicó al
estudio de las proteínas séricas. En 1948 fue galardonado con el premio
Nóbel por estos trabajos.
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Figura 5. Electroforesis en papel
3.10 Método descrito por Waleed Abu Al Soud, basado en dilución, lavado
con NaOH y una concentración de la muestra.
4. TIPOS DE ELECTROFORESIS
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Actualmente solo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se
desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa,
acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas
bandas, también llamadas zonas.
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Figura 6. Máquina para electroforesis con gel.
Electroforesis capilar
Electroforesis en papel
Electroforesis en gel de agarosa
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Electroforesis bidimensional
Isoelectroenfoque: La separación está basada en la diferencia entre puntos
isoeléctricos, su principal aplicación es la separación de proteínas.
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6. TIPOS Y PREPARACION DE GELES
Gel de poliacrilamida
Gel de poliacrilamida desnaturalizante
Gel de agarosa
Gel bidimensional
Gel de almidón
Figura 7.
Para 1 gel de agarosa al 2% en Buffer TBE 0.5 X con 2 peines de 24 pozos cada
uno
1. Pesar 6 gramos de agarosa y agregarla a un erlenmeyer que contenga 300
ml de buffer TBE 05X
2. Calentar al microondas el erlenmeyer tapado hasta disolver la agarosa.
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3. En caso de haber excesiva evaporación, completar el volumen con un poco
de agua destilada.
4. Dejar enfriar
5. Agregar de 10 a 15 l de bromuro de etidio 10mg/ml
6. Volcar sobre la base
7. Colocar los peines
8. Dejar enfriar
1. Lavar las placas de cristal a fondo con detergente casero, enjuagar con
agua destilada y secar con tejidos desechables.
2. Ensamblar las placas y los espaciadores. Los espaciadores pueden
adherirse al cristal con un adhesivo para prevenir que resbalen mientras se
vierte el gel. Se sellan los bordes de las placas, con una tira de cinta
adhesiva, teniendo una especial atención a las esquinas inferiores.
3. Para un gel al 8% colocar los siguientes reactivos en un vaso de laboratorio
limpio: 8 ml 10x tampón de electroforesis TBE, 56 ml de agua destilada y
70µl TEMED
4. Añadir 530µl de una solución fresca, hecha con el 10% de persulfato
amónico a una solución al 8% de acrilamida en el vaso de laboratorio y
remover cuidadosamente para mezclar. Una vez que el persulfato amónico
se ha añadido, comienza la polimerización y el gel debe verterse
inmediatamente.
5. Absorber cuidadosamente la solución de acrilamida en una jeringa
desechable, intentando evitar la introducción de burbujas de aire.
6. Situar las placas de cristal ensambladas verticalmente en la bandeja y se
llenan cuidadosamente las placas de cristal con solución de acrilamida
desde una esquina. Ninguna burbuja de aire puede ser traída por
inclinación de las placas introducidas mientras se produce el vertido.
7. Insertar el peine apropiado, teniendo cuidado de no atrapar ninguna burbuja
de aire y se saca el gel para polimerizar durante 40 minutos con una
inclinación de cerca de 10º respecto a la horizontalidad. Cuidar el gel para
evitar fugas durante los primeros 25 minutos.
8. Pelar la cinta de sellado y enjuagar cualquier acrilamida de las superficies
externas de las placas con golpes de agua. Quitar cuidadosamente el
peine.
9. Situar el gel en el aparato de electroforesis y sellarlo firmemente en su
lugar, utilizando las 4 tuercas de sellado. Asegurarse de que la llave de
drenado de la cámara superior de tampón está cerrada y rellenar las
cámara superior e inferior con unos 400 ml de 1x TBE cada uno. Enjuagar
la acrilamida no polimerizada de los pozos con 1x TBE, usando una jeringa
y una aguja de calibre fino.
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10. Llevar a equilibrar todo el aparato de gel a 4ºC durante al
menos 4 horas antes de comenzar la electroforesis.
11. Muestras, preparaciones y electroforesis.
1. Se limpian bien las placas de vidrio con Etanol 95% y luego se impregnan
las caras interiores con una pequeña cantidad de SDS al 10% (se extiende
bien con un papel para que quede una delgada capa)
2. Se colocan los espaciadores de 0.8 mm entre ambos vidrios en dos de los
lados (las gomas deben estar bien juntas sobre la placa menor) y se sujeta
todo con pinzas.
3. Se mezclan 60 ml del stock de acrilamida anterior con 100µl de TEMED y
200µl de APS.
4. Se agita brevemente y se vuelca lentamente la mezcla entre los dos vidrios,
inclinando levemente los mismos.
5. Una vez lleno se vuelve a la posición horizontal y se coloca el peine
invertido. Se deja polimerizar.
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6.5 Preparación del gel de almidón
7. PCR
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La duración total es de alrededor de 2 horas, dependiendo de las condiciones
experimentales concretas.
Cada ciclo de una PCR consta de tres etapas:
1. Desnaturalización: Calentamiento para la separación de las dos hebras
del ADN, mediante una incubación breve (30 a 120 seg.) a una temperatura
entre 68 y 97ºC, que debe ser superior a la de fusión de la región de ADN
que se quiere amplificar.
2. Templado o hibridación: Disminución de temperatura (37 a 65ºC que se
mantienen entre 10 y 120 seg.) y que permite la reasociación de hebras
sencillas tras la desnaturalización térmica.
3. Elongación, extensión o replicación: Etapa de amplificación propiamente
dicha, en la que la ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores,
empleando como molde ambas hebras originales. La replicación transcurre
en dirección 5´ --- 3´ a partir del extremo 3´- OH de cada cebador, hasta
terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de
desnaturalización (siguiente ciclo).
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Figura 8. Etapas del proceso de la PCR
Además de las 3 etapas de cada ciclo, comúnmente se añade una etapa previa y
una final al conjunto de todos los ciclos. La previa a elevada temperatura (incluso
superior a la de las etapas de desnaturalización), sirve básicamente para inactivar
proteasas y nucleasas de la muestra, así como para asegurar la desnaturalización
completa del ADN de partida, especialmente si éste es de gran tamaño o posee
regiones muy compactadas. La etapa final, consiste en una prolongación de la
última elongación, para permitir que se completen todos los fragmentos.
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Figura 9. Ciclo 1 de la PCR
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Figura 10. Ciclo 2 de la PCR
Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de
interés.
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Figura 11. Ciclo 3 de la PCR
En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir sin regiones
flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía
presente y lo estará hasta el final de la reacción. Sin embrago después de unos
pocos ciclos, el fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente
como el patrón predominante.
Lo usual es que los ciclos se repitan de 25 a 45 veces. La normalización de las
condiciones de funcionamiento del termociclador es esencial para poder reproducir
los resultados.
Rendimiento: Puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para el
siguiente, la acumulación de copias (tanto totales como dianas) es exponencial en
vez de lineal. Sin embargo, en la práctica el rendimiento de cada etapa no es
completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. A pesar de esto, siguen
siendo muy elevadas.
Duración: La duración de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el número
de ciclos deben optimizarse, dependiendo de la secuencia concreta que se quiera
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amplificar. En muchos casos, la elección de estas condiciones debe hacerse de
forma empírica.
Micropipetas
Termociclador
Unidades de electroforesis
Fuente de energía eléctrica
Equipo fotográfico
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7.6 Algunos usos de la PCR
PCR “larga”
Su objetivo es superar los límites de la PCR convencional para amplificar con
fidelidad regiones diana de gran tamaño (entre 5 y 40 Kb). El principal factor
limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en la polimerasa Taq,
por lo que añada una cantidad menor de otra enzima con capacidad de corrección
de pruebas para contrarrestar la carencia de esta actividad y al mismo tiempo,
seguir aprovechando la eficacia de elongación de la polimerasa principal.
PCR “anidada”
Técnica muy sensible de la PCR en la que el producto de una amplificación es
utilizado como molde, para realizar una segunda amplificación con cebadores que
se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy
específico.
PCR “inversa”
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Este tipo de PCR se emplea para clonar regiones desconocidas de un ADN,
situados en posición vecinal a secuencias diana conocidas. En lugar de amplificar
la región interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR convencional), se
amplifica la región externa que flanquea a los cebadores. Para ello es necesario
cortar el ADN a ambos lados de la región diana con una enzima de restricción, de
tal forma que los extremos cohesivos resultantes puedan hibridar entre si,
formando una molécula circular. Esta es cerrada por una ligasa y se realiza la
PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5´ de la secuencia conocida,
por lo que la elongación se extenderá alrededor del círculo. Se generan copias de
un ADN lineal delimitado, como el ADN normal, por la posición de ambos
cebadores.
PCR asimétrica
Se trata de generar copias de hebra sencilla de un ADN. Se añaden cantidades
muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de
PCR, uno de ellos se agota y disponibles ya suficientes copias del ADN diana,
sólo una de sus hebras sigue amplificándose gracias al cebador más abundante.
8. ADN RECOMBINANTE
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1. Recombinación homóloga o general
2. Recombinación específica de lugar o de sitio
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8.1 Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante
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su sabor y aspecto, animales transgénicos que engordan más rápido y producen
más carne. Actualmente se trabaja en vacunas, que a diferencia de las ya
existentes (con virus muertos o atenuados), pueden ingerirse en vez de
inyectarse. Serían baratas y se facilitaría su uso en países en vía de desarrollo.
Son las denominadas vacunas de subunidad. Consisten en una o más proteínas
de virus o de bacterias. La vacuna de la hepatitis B se basa en este modelo.
Medicina Forense: En los EE UU, las huellas moleculares del ADN se han
utilizado desde 1988 con fines jurídicos. La técnica se basa en el análisis de las
bandas producidas en un gel tras cortar el ADN de una muestra encontrada en el
lugar del crimen (cabello, semen, tejido cutáneo o sangre) con una enzima de
restricción. Se compara el patrón de bandas de esa muestra con el producido por
la víctima y los posibles sospechosos. Si hay coincidencia, el asesino ha sido
detectado. La probabilidad de que dos individuos escogidos al azar tengan el
mismo patrón de bandas para un corte enzimático dado es menor de 1/1011.
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producir etanol. Con esta misma metodología se esta consiguiendo Mayor
grado alcohólico. Se desea eliminar el problema de la quiebra proteica en
vinos blancos mediante el uso de proteasas específicas y levaduras
transgénicas que expresen los genes que las codifican, como también se
están identificando los promotores de genes de levaduras industriales, con
expresión diferencial a lo largo de la fermentación vínica.
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contra muchas enfermedades bovinas y porcinas. Las nuevas vacunas
recombinantes tienen mayor protección, son más estables y más fáciles de
producir.
9.1 Virus: Del latín “veneno”. Entidades orgánicas compuestas tan solo de
material genético, rodeado por una envuelta protectora, son agentes causantes de
enfermedades más pequeños que las bacterias, carecen de vida independiente,
pero se pueden replicar en el interior de las células vivas, perjudicando en muchos
casos a su huésped en este proceso.
Los cientos de virus conocidos, son causa de muchas enfermedades distintas en
los seres humanos, animales, bacterias y plantas.
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El único medio efectivo para prevenir las infecciones virales es la utilización de las
vacunas.
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Cuadro 1. Virus animales. Fuente: Biología de Villee, 1996
Edward Jenner fue el pionero del uso de las vacunas, practicó la medicina en la
campiña inglesa en una época en que la viruela era una de las enfermedades más
frecuentes y temidas. Con los años, notó que las mujeres que atendían a las
vacas no sufrían los síntomas de la enfermedad. Jenner concluyo que de alguna
manera, las lecheras eran “inmunes” a la viruela por que se infectaban a una
edad temprana con “vacuna”, una enfermedad innocua que contraían las vacas.
La vacuna produce vesículas que se parecen a las vesículas llenas de pus de la
viruela, pero las vesículas de la vacuna, eran localizadas y desaparecían sin
causar nada más que una cicatriz en el sitio de la infección.
En 1796, Jenner realizó uno de los experimentos médicos más famosos de todos
los tiempos. Primero, infectó a un niño de 8 años de edad con vacuna y le dio
tiempo para recuperarse. Seis semanas más tarde, Jenner infectó de manera
intencional al niño con viruela, mediante la inyección de pus proveniente de una
lesión variolosa justo bajo la piel del niño. El niño no mostró signos de la mortal
enfermedad. En unos cuantos años, miles de personas se habían vuelto inmunes
a la viruela, mediante la infección intencional con vacuna. Este procedimiento se
llamó VACUNACIÓN, por el término latín VACCA.
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conserven su inmunogenicidad. Pasteur descubrió que algunas bacterias cuando
son cultivadas en el laboratorio o cuando se inoculan en un huésped no natural,
pierden su virulencia pero conservan su inmunigenicidad, lo mismo ocurre con
algunos virus.
Estos patógenos atenuados son excelentes para ser usados como vacunas, ya
que conservan cierta capacidad de infección y activan los sistemas de alarma
inmunológica induciendo una fuerte respuesta con memoria inmunológica.
Una alternativa al uso de microorganismos viables es utilizar virus o bacterias
inactivados o “muertos” por ejemplo por tratamiento térmico o químico en el
laboratorio. Estas vacunas son muy estables y en ellas el riesgo de
contaminaciones es prácticamente nulo, a pesar de eso estas vacunas también
tienen sus limitaciones ya que son caras, se necesitan inocular grandes
cantidades del microorganismo, lo que a veces resulta en reacciones adversas
serias y por lo general no son capaces de inducir la respuesta inmunológica
adecuada o duradera.
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bacterias) alterados genéticamente o incluso las vacunas basadas en
inmunización con ADN “desnudo”, que se inyecta para que el huésped produzca
proteínas de microorganismo “in vivo” que serán después reconocidas por su
propio sistema inmune.
9.4 Cultivo de virus
Dado que los virus sólo pueden multiplicarse cuando han infectado células vivas,
no pueden cultivarse en medios inanimados. Uno de los primeros métodos para
cultivar virus animales, todavía muy útil consiste en inyectarlos en embriones de
pollo en desarrollo. Se elimina un pequeño fragmento de cascarón una o dos
semanas después de la fecundación del huevo y el material que contiene el virus
se inyecta a través de la abertura. El virus se inyecta en el embrión mismo o en
una de las membranas que lo rodean: por ejemplo el saco vitelino, que contiene
alimento para el embrión, o el saco amniótico, que es el saco lleno de líquido en
que se desarrolla el embrión.
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El cultivo de virus en embriones de pollo en desarrollo, se ha utilizado con objeto
de producir virus para diversas vacunas, como las usadas contra la viruela,
influenza y fiebre amarilla.
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9.6 Utilización de virus en la terapia antitumoral
También se puede intentar dotar a estos virus terapéuticos con genes que
permitan aumentar la sensibilidad de las células tumorales infectadas a la
quimioterapia. Estas técnicas necesitan ser perfeccionadas para evitar reacciones
indeseables, en la actualidad se viven realizando diferentes ensayos clínicos con
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adenovirus y otros virus humanos, esperándose que la viroterapia antitumoral
pueda ser una realidad terapéutica para la medicina del futuro.
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10. CONCLUSIONES
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El ADN recombinante es la tecnología que ofrece expectativas para la
obtención de plantas con las características deseadas.
Los virus representan un reto importante para la ciencia médica en su
combate contra las enfermedades infecciosas.
Las vacunas recombinantes, ofrecen diversas ventajas respecto de las
convencionales en cuanto a seguridad, especificidad y estabilidad.
Las vacunas recombinantes acompañadas de las pruebas de diagnóstico
adecuadas, permiten distinguir entre animales vacunados e infectados por
causas naturales.
La utilización de vacunas y los fármacos antivirales, son las herramientas
disponibles en la terapia antivírica.
Los virus animales son responsables de numerosas enfermedades, por lo
que el conocimiento de los mecanismos de infección y estrategias de
multiplicación, son de gran interés en medicina.
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11. RECOMENDACIONES
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