NMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ)

QFB. JESTEGER ELISEO HERNANDEZ VAZQUEZ

1. INMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ)

La Inmunohistoquimica (IHQ) tiene aproximadamente 55 años, pero actualmente

en muchos lugares todavía es considerada como una tecnología nueva. En los
últimos años 21 años su utilidad para el diagnóstico de procesos neoplásicos
se incrementó ya que por medio de esta técnica se puede determinar el sitio de
origen y la identidad del tumor en un 95% de los casos, el patólogo es el
responsable del diagnóstico final de estas neoplasias y dependiendo de este se
establecerá el tratamiento adecuado. A veces la historia clínica ayuda para tomar
decisión para determinar si una lesión es benigna o maligna. Para poder
diferencia una neoplasia de tipo epitelial, mesenquitematoso, o hematopoyético
el diagnostico debe de ser microscópico. En algunos casos es difícil ya que el
5% de las neoplasias son clasificada como neoplasias indiferenciadas, está
clasificación se basa en tinciones rutinarias como Hematoxilina y Eosina ( H &
E ); este porcentaje variara dependiendo de la calidad del laboratorio y de la
pericia del patólogo. En los años 70 y 80 el microscopio electrónico de trasmisión
fue la técnica de modas para clasificación de las neoplasias no diferenciadas,
pero el tiempo que toma y el alto costo impiden muchas veces su aplicación. A
partir de los 90 la IHQ ha sido la herramienta más útil para el diagnósticos
diferencial de neoplasias.
Los marcadores utilizados (epitopes presente/ausentes) en IHQ para el
diagnóstico de las diferencias neoplasias pueden ser agrupados de la siguiente
manera:
a) Marcadores de diferenciación
b) Hormonas.
c) Proteínas tejidos especifico
d) Oncogenes
e) Anti-oncogenes.
f) Marcadores de proliferación
g) Marcadores pronostico.

Estos marcadores utilizados como antígenos pueden ser visualizados por medios
de anticuerpos específicos, los cuales son generados de diferentes especies de
animales en forma de monoclonal o policlonal, estos anticuerpos una vez unidos a
su receptor en el tejido son identificados por medios colorimétricos y/o
enzimáticos; la reacción química generada puede ser citoplasmática, nuclear o en
la superficie de las células (membrana). De esta manera el diagnostico
histopatológico de las neoplasias se fundamenta en la IHQ al detectar y localizar
la presencia/ausencia de estos antígenos en biopsia de tejido fresco, congelado
y/o fijado en formaldehido, embebido en parafina, de esta forma la IHQ confirma la
historia clínica, de los estudios de rayos X y las preparaciones histológicas de
rutina como lo es la H & E.
En la actualidad para llevar a cabo la técnica de IHQ, existen métodos directos e
indirectos , los primeros se basan en el marcaje del anticuerpo primario con
fluoresceína o una enzima, mientras que los métodos indirectos se apoyan en un
segundo anticuerpo que reconozca al primario, este segundo anticuerpo debe de
ser generado en otra especie diferente de donde se generó el anticuerpo primario,
posteriormente es necesario la participación de una enzima ( peroxidas o
fosfatasa alcalina) la que en presencia del sustrato especifico permiten la
oxidación del cromógeno (colorante) que se pueden visualizar en el microscopio
de luz.
Estos métodos utilizan el sistema Biotina-Avidina, Biotina-Estreptavidina, sin
embargo, se han elaborado sistema libres de Biotina que son visualizados por
medio de una reacción colorimétrica empleándose los anticuerpos primarios y
DAB como cromógeno; en ambos casos los fundamenta de la IHQ son los
anticuerpos primarios;
Los dos objetivos fundamentales de la IHQ son
a) Detectar e identificar los epitopes en el tejido.
b) Hacer visible la reacción epitope/anticuerpo.

Actualmente existen diferentes métodos para la detección de los determinantes

antigénicos por la técnica de IHQ; lo más comunes son:
a) Directa
b) Indirecta Peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP).
c) Indirecta Avidina-Biotina (ABC)
d) Indirecta Estreptavidina- biotina.

Sin embargo, con los avances de la tecnología de la IHQ se han

desarrollado métodos más sensibles que permiten detectar determinantes
Antigénicos que hasta día no se podían identificar en los métodos
anteriormente mencionados. Los sistemas de detección más sensibles en la
IHQ son:
A. Sistemas de Amplificación de la Señal Catalizada (CSA)
B. Sistemas libre de biotina ( EPOS)

Al realizar las técnicas antes mencionadas es necesario obtener y preserva la

muestra en excelentes condiciones y uno de los pasos fundamentales en el
proceso de inmunotincion es la fijación de los tejidos. En el mercado podemos
encontrar diferentes sustancias para logar este propósito sin embargo no existe un
fijador perfecto. El formaldehido al 10% amortiguado es uno de los fijadores más
económicos que preservan la característica intrínseca y morfológica del tejido, la
muestra procesada de esta forma permite aplicar las herramientas de la biología
molecular para explicar las causas de la enfermedad que afecta al paciente, o
bien comprender las relaciones/comunicaciones intracelulares y extracelulares.
Es recomendable poner la muestra (biopsia) en el fijador inmediatamente
después de haberla obtenido, los cortes no deben de exceder de 5mm. de espesor
y volumen de fijador debe de ser 10 veces mayor al volumen de la muestra, así
mismo el tiempo óptico de fijación debe de ser mayor de 12 horas y menor de 24,
cuando los tiempos son mayores la la preservación y la morfología del tejido son
estropeados; la sobre fijación causa la formación de excesivos enlaces de
aldehídos que bloquean o enmascaran los epitopes y por lo tanto la calidad del
proceso de inmunotincion. El enmascaramiento también puede ocurrir por:

 Impurezas del formaldehido. El formaldehido comercial tiene pequeñas

cantidades de metanol y ácido fórmico, además de algunas otras.
 Impurezas que contribuyen con la degradación de los determinantes
antigénicos
 Naturaleza de la molécula. Los aminoácidos, azucares y la estructura
tridimensional de la proteína tienen una correlación directa con la afinidad
del anticuerpo primario por el epitope y esta afinidad es favorecida por la
cantidad, calidad y exposición de este.

Sin embargo este enmascarado puede ser modificado por la acción de enzimas
proteolíticas como tripsina, pepsina y proteínasa K así como por substancias
químicas como el citrato de sodio, y el EDTA principalmente, la solución de
desenmascaramiento debe de tener una temperatura cercana a ala de ebullición;
de los procedimientos de desenmascaramiento, el método que ofrece mayores
ventaja es la solución de citrato de sodio por las siguientes razones:
 Es útil en más de los anticuerpos primarios.
 Bajo costo.
 Estándares para trabajar con honor de microondas, baño María y Olla de
presión
 Condiciones mínimas de seguridades en el laboratorio y nulo riesgo a la
salud

El desenmascaramiento (atinge retrieval) tiene como finalidad aumentar

sensibilidad de la inmunotincion por medio de la digestión enzimática aplicando
calor a las secciones histológicas inmersas en un fluido utilizando el microonda, la
olla de presión o el balo de maría, el fluido puede ser varios buffers, soluciones de
metales pesados o simplemente agua desionizada; esta técnica permite la
identificación de epitopes o moléculas en muestras embebidas en parafina que
previamente no se podían detectar, el procedimiento básico consiste en exponer las
laminillas hidratadas a elevadas temperatura en un horno de microondas inmersas
en buffer de citrato de sodio, durante el proceso la solución alcanza temperaturas
mayores a la de ebullición, la cual se mantiene por varios minutos, al término de
este proceso las laminillas son enfriadas hasta la temperatura ambiente y
posteriormente continuar con la IHQ.

Sin embargo lo que determina la calidad de la IHQ es la especificidad y la

sensibilidad del anticuerpo primario. La especificad se refiere a la reacción cruzada
del anticuerpo con diferentes especies, es decir, el anticuerpo detecta el mismo
epitope en ratón/humano, rata/conejo, conejo/ratón, conejo/humano etc. O bien el
anticuerpo puede reconocer una molécula es que no necesariamente sea un
epitope, pero esta molécula es expresada por una gran variedad de célula de
diferentes tejidos , dicho de otra manera los anticuerpos tienen una especificidad
bioquímica y una especificidad anatómica, un ejemplo de ello es con la proteína
S.100, una sustancia expresada por una gran variedad de células de diferentes
linaje; sin embargo, solo una es útil para el diagnóstico, también la especificidad
está determinada por la forma de preparación, del anticuerpo es decir un anticuerpo
útil en Western bloot e inmunoprecipitacion en muchas ocasiones no funciona para
IHQ en muestras fijadas en formaldehido/embebida en parafina, ya que el epitope
que se conserva en los procesos no es estructuralmente el mismo y por lo tanto el
anticuerpo generado para uno u otro es diferentes, lo mismo ocurren en el caso de
los anticuerpo generados para IHQ en tejido fresco, congelado y citologías.

.
La sensibilidad de las técnicas de IHQ depende d varios factores, algunos del más
importante son;
a) Concentración del anticuerpo primario
b) Tiempo de incubación con el anticuerpo primario
c) Temperatura de incubación del anticuerpo primario
d) Vida media del anticuerpo primario
e) Calidad de los determinantes antigénicos y del tejido
f) Concentración de determinantes antigénicos por la célula
g) Sensibilidad de los sistemas de detección
h) Proceso de desenmascaramiento de los determinantes antigénicos
i) Grosor del corte histológico
 j) Operador personal con experiencia en el ramo de inmunohistoquimica , ya
que esta técnica es totalmente operador-dependiente.

La especificidad y sensibilidad de la IHQ, así como de cualquier método son

confirmadas con la ayuda de controles positivos y negativos. El utilizar la IHQ
como una herramienta en el diagnostico histopatológico hace necesario arma
diferentes paneles (juegos) de anticuerpos para poder realizar el diagnóstico
diferencial, algunos de estos paneles son los siguientes:
 Epiteliales
 Neural/neuroendocrino
 Linfoides
 Mieloides
 Mesenquitematosos
 Agentes infecciosos
 Marcadores de proliferación
 Marcadores pronostico

1.1. FUNDAMENTO
La IHQ tiene como fundamento el uso de reactivos basado en anticuerpos para
localizar epítopes específicos en secciones de tejido. Estos epítopes específicos
presentes o ausentes en el tejido son indicadores de una patología que, a su vez,
puede predecir el futuro del paciente o de la neoplasia. Los marcadores (epítopes
presentes/ausentes) son usados como antígenos y pueden ser visualizados por
medio de anticuerpos específicos, los cuales son generados de diferentes especies
de animales en forma monoclonal o policlonal, estos anticuerpos una vez unidos a
su receptor en el tejido son identificados por medios colorimétricos; la reacción
química generada puede ser citoplásmica, nuclear, en la membrana de la célula o
una combinación de éstas. De esta manera el diagnóstico histopatológico de las
neoplasias se fundamenta al detectar y localizar la presencia/ausencia de estos
antígenos en las biopsias de tejidos.

1.2. PROPÓSITO
Establecer con precisión las instrucciones para realizar la técnica de
inmunohistoquímica en el orden y con los reactivos apropiados.
1.3. ALCANCE
Para este procedimiento el personal deberá contar con conocimientos y experiencia
en histología, química, biología, inmunología, genética, patología, así como del
manejo de residuos CRETIB (Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Tóxico, Inflamable,
Biológico-Infeccioso) generados en un laboratorio de patología.

1.4. OBJETIVOS
Realizar la técnica de IHQ para contribuir a la detección in situ de las proteínas y
ayudar al diagnóstico diferencial de los tumores en los bloques de parafina y
material citológico de los pacientes.
Evitar errores técnicos en la realización de la técnica de inmunohistoquímica.
Determinar las instrucciones de la técnica para el personal del laboratorio de
inmunohistoquímica.

1.5. MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS NECESARIOS:

Micrótomo Vaso de precipitados de 1000 ml

Baño de flotación Reloj de tres tiempos
PT-link (DAKO®) Gradillas de plástico
Autostainer (DAKO®) Piseta de 500 ml
Horno de convección Portaobjetos cargados Super Frost
Plus (Thermo Scientific®) o laminas
Balanza analítica
silanizadas ( preparadas
Agitador magnético manualmente )

pHímetro Canastilla de acero inoxidable para 30

portaobjetos
Refrigerador
Canastilla de plástico para 24 láminas
Pipetas de volúmenes variables 1-
10l, 1-100l y 1-1000l Cubreobjetos

Puntas blancas (para Vol 1-10 l) Etiquetas

Puntas amarillas (para Vol 1-100 l) Xileno

Puntas azules (para Vol 1-1000 l) Alcohol absoluto

Alcohol 96°C costo es económico puesto un kit
alcanza para cientos de reacciones de
Agua desionizada/destilada
IHQ
Na2HPO4
NaH2PO4
NaCl
Tween 20
Citrato de Sodio
EDTA
Bicarbonato de sodio
Anticuerpos titulados y calibrados(
VARIAN DE PRECIO DE ACUERDO
A LA MARCA Y TIPO DE CLONA )

Búfer de citrato con pH calibrado

Búfer de EDTA con pH calibrado
Proteinasa K
Bloqueador de peroxidasa
Bloqueador de proteínas
Reactivo de unión (Link)
Polímero (HRP)
Diaminobencidina (DAB) o magenta
Búfer para DAB
Hematoxilina de Harris
Bicarbonato de sodio al 0.1%
Resina

NOTA: existen kit de empresas

especializadas que engloban gran
parte de los materiales a utilizar, el
1.6. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:
Búfer de lavado PBS. (Phosphate Buffered Saline/Búfer fosfatado salino).
Na2HPO4………..10.9 g
NaH2PO4………..3.2 g
NaCl……………...90 g
Agua destilada…..1000 ml
Mezclar bien y ajustar el pH a 7.4. Luego agregar 5 ml de Tween 20.
Esta solución es estable a temperatura ambiente. La solución debe diluirse
1:10 con agua destilada antes de usar y ajustar el pH si es necesario.
Búfer de citratos. (10mM Citrato de sodio, 0.05% Tween 20, pH 6.0).
Citrato de sodio……..2.94 g
Agua destilada………1000 ml
Mezclar para disolver. Ajustar el pH a 6.0 con NaOH al 10%. Luego agregar
0.5 ml de Tween 20 y mezclar bien. Esta solución es estable a temperatura
ambiente por tres meses o a 4oC para mayores periodos de tiempo.
Búfer de EDTA. (Solución 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0)
EDTA………….…0.37 g
Agua destilada….1000 ml
Mezclar para disolver. El pH usualmente es 9.0. Agregar 0.5 ml de Tween 20
y mezclar bien. La solución es estable a temperatura ambiente por tres
meses, para periodos de tiempo mayor conservar a una temperatura de 4oC.
Bicarbonato de Sodio al 0.1%. pH 8.0
Bicarbonato de Sodio……..1 g
Agua destilada……………..1000 ml
Mezclar bien y ajustar el pH a 8.0. La solución es estable por tres meses a
temperatura ambiente.
Solución Diaminobencidina (DAB).
Por cada mililitro de búfer para DAB agregar una gota de DAB. Mezclar bien.
La solución es estable por 24 horas a temperatura de 4oC. Preparar de
acuerdo a la cantidad de laminillas que se tenga tomando en consideración
que se usa 100l por cada laminilla.

1.7. RESULTADOS:
Los resultados varían y dependen del anticuerpo que esté en estudio. Puede tener
tinción nuclear, citoplásmica, membrana de la célula o una combinación de éstas.
Es necesario una lista de protocolo de cada anticuerpo, controles y localización
celular.

NOTA. - De acuerdo a la dilución de cada anticuerpo se utiliza el anticuerpo

concentrado y el diluyente tomando en consideración que se usa de 80-100l por
cada laminilla; por ejemplo, si el anticuerpo tiene una dilución de 1:50 y requerimos
preparar 100l, usaremos 2l por cada 98l de diluyente de anticuerpo, su el
anticuerpo tiene una dilución de 1:10 y prepararemos 200l usaremos 20l por cada
180l de diluyente. Hay que considerar que en algunas ocasiones el anticuerpo
puede o no requerir una mayor concentración cuando el anticuerpo se ha degradado
o diluir más para evitar tinción de fondo, de la misma forma puede requerir mayor o
menor cantidad de tiempo de incubación del anticuerpo primario dependiendo de la
degradación de los reactivos usados.