Biología Celular.

Sánchez Sánchez Magdalena

Grupo: 7
Microscopía

De luz fotónica (250nm)

• Estándar (campo claro)

Existen numerosos tipos de microscopios, adaptados para diferentes usos.

Algunos emplean una fuente energética diferente: microscopios de rayos X,
ultravioletas, infrarrojo, de rayos beta, de ultrasonidos, electrónicos, protónicos,
de neutrones, etc. Por su amplia aplicación y relativamente bajo costo, en
enseñanza e investigación se utiliza especialmente el microscopio óptico
compuesto de campo claro convencional, perteneciente al grupo de los
microscopios ópticos o fotónicos, que utilizan la fracción visible del espectro.

El microscopio óptico convencional es compuesto porque posee dos sistemas

principales de lentes convergentes (ocular y objetivo), en cambio los
microscopios simples o lupas, de menor aumento, presentan un solo sistema
de lentes biconvexas o plano-convexas montadas en una armadura metálica.
La mayoría de los modelos actuales son binoculares, aunque también los hay
monoculares. El microscopio compuesto convencional se denomina "de campo
claro" o "de campo brillante" porque todo el campo se ilumina con una lente
condensadora común, a diferencia de variedades que utilizan luz difractada, de
fondo obscuro. Las muestras que utiliza el microscopio compuesto
convencional deben ser traslúcidas y estar teñidas para entregar contraste.

• Fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una

herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite
alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo
una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los
especímenes y que generalmente pasa desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado

inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada
físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que
tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de
emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras
palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo
luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor
longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo). Es un
fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la
excitación.

Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación

para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la

propiedad de fluorescencia.
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro
de absorción y de emisión específico que depende de la composición y
estructura de la molécula fluorescente.

Longitud de onda de Longitud de onda

Fluorocromo
absorción (nm) de emisión (nm)
Cascade blue 374-403 422-430
Fluoresceína
494 520
(FITC)
Rodamina (TRITC) 540 570
Naranja de acridina 460-502 526-650
Yoduro de propidio 536 617

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de
absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).

También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos

de nicotina reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados,
clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe
ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente,

aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite.
Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que
pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El
marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza
mediante la técnica de inmunofluorescencia.

• Campo oscuro

Los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos

y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).

La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz

transmitida (trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el
primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo
de luz que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal
manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y
económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo
círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o
plástico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto
ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro
del circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de
10x cuya apertura numérica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con
una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo opaco debe oscilar entre
20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua se emplea
un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose
una interesante imagen con relieve.
El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador
característico que además mejora la resolución. Con este dispositivo se forma
un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la
muestra y sólo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras
penetran en la lente objetivo y la célula aparece como un objeto luminoso sobre
un fondo oscuro.

Figura 6-2.-Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e
iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central
dependerá del objetivo que se emplee. Con objetivos de mayor aumento y apertura numérica, se requiere un disco
negro de mayor diámetro. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the
microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination.

Figura 6-3.-Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es
de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados,
difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen.
Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center.
Figura 6-5.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de
iluminación. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin
interrupción. En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene
contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make'
contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination.

• Contaste de fases

Las investigaciones iniciales de Frits Zernike al inicio de la década de 1930

revelaron que en microscopía, al crear interferencias en la luz empleada para
iluminar el espécimen se creaban condiciones que producían un incremento del
contraste. Este descubrimiento le valió el premio Nobel en física en el año 1953
y revolucionó la investigación en biomedicina al permitir el estudio de células
vivas. Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera
notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes.

El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un

cono hueco de luz pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en forma de
anillo que disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo provoca un
retraso o desfase en la longitud de onda de la luz. Este método induce
variaciones sutiles en el índice de refracción (determinado por el espesor) de
los especímenes translúcidos permitiendo visualizar una riqueza de detalles
muy finos en la estructura, los cuales pasarían desapercibidos con una
iluminación de campo claro.

Los heterogéneos componentes celulares absorben la luz de diferente manera

y causan pequeñas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir,
las retrasan ligeramente al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso
varía según el tipo de estructura. En las células y tejidos no coloreados, el
escaso contraste se mejora y acentúa al transformar las diferencias de fase
(invisibles al ojo humano) en diferencias de intensidad luminosa las cuales sí
son detectables. Este tipo de microscopio también se denomina de Fases o
Diferencia de Fases.
Figura 6-9.-Esquema que representa parte del principio de la iluminación en contraste de fases. A representa una onda
luminosa. En A’ al atravesar el objeto transparente C, la onda se retrasa con respecto a la onda A (que no ha pasado
por el objeto). En consecuencia, la onda A’ está desfasada con respecto a la onda A. El ojo humano y las placas
fotográficas no son sensibles a estas diferencias de fase. La onda A’’ al pasar por un medio absorbente E reduce su
amplitud (la distancia entre la cresta y el valle de la onda) y al contrario de las diferencias de fase, las diferencias de
amplitud si son visibles. En R se combinan ondas de igual fase y amplitud las cuales se suman y producen aumento del
brillo de la imagen. En S las ondas combinadas están desfasadas y producen incremento del contraste de las sombras
y zonas oscuras de la imagen. Otras combinaciones producen el contraste de los tonos de gris. Tomado de Bennett A;
Jupnik H; Osterberg H; Richards O W. Phase Microscopy.

Para convertir un microscopio convencional en uno de contraste de fases se

sustituye el condensador y el objetivo por los de contraste de fases, los cuales
contienen un filtro en anillo y una placa de fases respectivamente. Los objetivos
de contraste de fases se identifican por sus letras verdes y la indicación del
tamaño del anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3 o PhC, PhL, PhP).

El método de Zernike consiste en acelerar las ondas en ¼ de longitud de onda

y como resultado la interferencia produce una imagen con detalles oscuros
sobre un fondo claro, denominándose contraste de fase oscuro o positivo. Otro
método consiste en el efecto contrario, es decir, retrasar o disminuir la
velocidad de la luz en ¼ de longitud de onda y la interferencia produce una
imagen con detalles brillantes en un fondo oscuro y se denomina contraste de
fase brillante o negativo.

Figura 6-11.- Diagrama para el microscopio de contraste de fases. K: filtro anular, L: vista transversal del filtro anular,
M: condensador, O-O’: objetivo, P – P’: ocular, Q: diafragma del ocular. La placa de fases está colocada entre las
lentes del objetivo y funciona como otro filtro que crea la difracción de la luz. a y b: configuración de los filtros para
producir el contraste negativo o positivo respectivamente. Modificado de Richards O W. (1954). Phase Microscopy
1950-1954.

• Confocal

En la microscopía fotónica clásica el tejido debe cortarse finamente para ser

examinado y mientras más delgado sea, más nítida será la imagen; pero con
este método se pierde la información tridimensional durante el corte. Si una
muestra gruesa es observada al microscopio fotónico, la imagen que se enfoca
se ve contaminada por la superposición de los elementos del tejido que están
fuera de foco, tanto por encima como por debajo del plano enfocado; la imagen
enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no
enfocadas.

Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es

un instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos
más o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir
de cortes seriados. Fue inventado en el año 1955 por el científico
estadounidense Marvin Minsky al estudiar neuronas. Su mecanismo, basado
en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención de imágenes de la
arquitectura tridimensional de células y tejidos.

Los detalles de la óptica del microscopio confocal son complejos y

complementado por métodos electrónicos y de computación, este instrumento
permite enfocar únicamente un plano determinado del espécimen, eliminando
la luz (fluorescencia) procedente de las regiones que no están en el plano de
enfoque.

Este microscopio tiene mucho éxito en el mundo científico gracias a la alta

calidad de las imágenes que proporciona a partir de especímenes preparados
con las técnicas de laboratorio habituales para la microscopía de fluorescencia
y por supuesto, al creciente número de aplicaciones.

Electrónica (0.05nm)

• Transmisión

Fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado, en 1931. Utiliza un

haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000 X. Para ello emplea las propiedades ondulatorias de los
electrones porque genera imágenes de los objetos que no pueden verse a
simple vista o con el microscopio de luz. Según las leyes de la óptica, es
imposible formar una imagen de un objeto de dimensiones inferiores a la mitad
de la longitud de onda de la luz empleada para observarlo. Dado que el
intervalo de longitudes de onda de la luz visible comienza alrededor de 400
nanómetros (0’0000004 metros), no es posible ver algo que mida menos de
0’0000002 metros.

En principio, con los rayos X se pueden ver objetos en la escala atómica y

molecular porque sus longitudes de onda están entre 0,01 y 10 nm. Sin
embargo, no es posible enfocar los rayos X, y las imágenes que se obtienen
son difusas. El microscopio electrónico, al trabajar con partículas cargadas, los
electrones, se enfocan aplicando un campo eléctrico o un campo magnético, de
la misma forma en que se enfoca una imagen en la pantalla de televisión.
Según la mecánica cuántica, la longitud de onda de un electrón está en
proporción inversa con su velocidad, por lo que si los electrones se aceleran a
grandes velocidades, se obtienen longitudes de onda tan cortas como 0,004
nm.
 • Barrido

Se desarrolló en 1942, con una resolución entre 3 y 20 nm, dependiendo del

microscopio. Aunque permite una menor capacidad de aumento que el
microscopio electrónico de transmisión, este permite apreciar con mayor
facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados
metálicamente antes de su observación. Por esta razón solamente pueden ser
observados organismos muertos, y no se puede ir más allá de la textura
externa que se quiera ver. Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer
imágenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz. Posteriormente son
coloreadas las imágenes digitales para proporcionar más realismo.

Bibliografía.

http://microbiologiaunq.files.wordpress.com/2008/04/seminario-nc2b02-microscopia.pdf
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo5_7.htm
http://www.imbiomed.com.mx/1/1/articulos.php?
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http://www.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/mftecnicas.htm
http://www.cienciapopular.com/n/Ciencia/Microscopia_Electronica/Microscopia_Electro
nica.php
http://www.monografias.com/trabajos5/microsc/microsc.shtml