Unidad III Cromatografia

Unidad III: Métodos Cromatográficos
3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.
En este apartado se considera la parte del desarrollo histórico y evolución de la

cromatografía; así como su clasificación sustentada en los fenómenos de separación
y en el estado físico de una fase móvil; además de dar a conocer la instrumentación
del cromátografo y algunos otros equipos de medición que se acoplan a estas
técnicas cromatográficas.
3.1 INTRODUCCIÓN
En la actualidad los métodos cromatográficos, constituyen una importante

herramienta analítica para la identificación de sustancias orgánicas e inorgánicas; es
difícil encontrar muestras químicamente puras naturales o sintéticas, sin embargo en
la industria se comercializan una gran cantidad de compuestos que deben de
satisfacer los límites permisibles en cuanto a su grado de pureza.
Una de las maneras para verificar que se cumplan estos estándares, es utilizar
alguna de las diferentes técnicas cromatográficas; en el mercado encontramos
equipos desde los más sencillos, que cuentan con uno o dos detectores para
cuantificar los analitos; hasta instrumentos de cromatografía mucho más sofisticados,
que se encuentran acoplados a otros aparatos de medición, tal es el caso del
espectrómetro de masas o infrarrojo.
Los fundamentos de la cromatografía siguen siendo los mismos que anteceden a su

descubrimiento; esto es, para que se pueda obtener un cromatograma, se necesitan
de dos fases, una fase móvil y una estacionaria.
Libro de Texto: Química Analítica II Página 209

La cromatografía se divide de acuerdo a su fase móvil en dos tipos: la cromatografía

de gases (CG) y la de líquidos (HPLC); ambas tienen importantes aplicaciones. Por
una parte su capacidad de poder separar todos los componentes de una mezcla,
con la finalidad de cuantificarlos, ya sea por medio de la integración de sus áreas en
un cromatograma o bien de manera cualitativa; e identificarlos siempre a través de
sus tiempos de retención, que sirven como una constante física dadas determinadas
condiciones de operación.
3.1.1 Concepto y desarrollo histórico de la cromatografía
La primera aplicación de una técnica cromatográfica fue desarrollada por el Ruso

Mijáil Tswett a principios del siglo pasado (siglo XX). Este investigador utilizó esta
técnica para separar diferentes pigmentos vegetales como las clorofilas y las
xantofilas en plantas.
En sus experimentos uso un tubo de vidrio empacado con carbonato de calcio en

polvo y mojado con un disolvente orgánico, por donde se hacía pasar la muestra, los
distintos pigmentos aparecieron como bandas coloreadas sobre la columna. Hoy en
día explica el nombre de este método (“cromo” que significa color).
Cuando se analizó está técnica se pudo explicar que la separación de los pigmentos
se basan en los diferentes grados de adsorción de estos sobre el carbonato (fase
estacionaria), lo que causa que las bandas se desplacen a distintas velocidades en
su recorrido; y cada banda corresponda a un pigmento diferente.

Existen varias definiciones de cromatografía, una de las más sencillas es considerar

a la cromatografía como un conjunto de técnicas analíticas utilizadas para separar
los componentes de una mezcla.
Una de las cosas en común que tienen dichas técnicas y por lo cual se separan las
sustancias es el estar en contacto con una fase móvil y otra fase estacionaria,
aprovechando la velocidad de desplazamiento de cada uno de los analitos presentes
en la muestra.
Generalizando; la cromatografía nos permite aislar, identificar y establecer, cuántos y

en qué cantidad hay de sustancias afines en una mezcla compleja, además no se
podrían separar los componentes de estas mezclas con cualquier otro método
químico de igual manera.
Una de las bases de la cromatografía se debe a su diferencia de adsorción en una

fase estacionaria de estas sustancias ya sea en estado líquido, sólido o gaseoso; por
lo que los componentes de una mezcla son desplazados a través de su fase
estacionaria a diferentes velocidades mediante el flujo de una fase móvil.
Las aplicaciones de la cromatografía se han desarrollado en forma creciente en los

últimos cuarenta años, esto es debido al desarrollo de varios tipos de técnicas
cromatográficas que implican una mejor separación de muestras con propiedades
características.

3.1.2. Conceptos de la fase estacionaria y fase móvil
La cromatografía es un proceso de partición o separación, en el cuál la muestra se

encuentra en equilibrio entre dos fases. Una fase móvil que sirve para conducir o
encaminar la muestra a lo largo de una columna (parte integral de un cromátografo),
para el caso en particular de la cromatografía de gases la fase móvil es un gas inerte
como el helio o el nitrógeno.
La fase estacionaria o fija, puede estar constituida por partículas muy finas que
recubren el empaque de la columna; este sólido presenta un área superficie/volumen
muy elevada.
3.1.3. Clasificación de los métodos cromatográficos.
Los métodos cromatográficos se clasifican dependiendo de su grado de resolución,

velocidad, sensibilidad y versatilidad.
 Resolución: nos sirve para muestras complejas; separando sustancias

estrechamente relacionadas, como es el caso de ciertos aminoácidos obtenidos a
través de la hidrólisis de una proteína, con una buena eficiencia por parte de la
columna en la separación de los picos de aminoácidos prolina, leucina,
isoleucina, valina, fenilalanina y metionina.
 Velocidad: el tiempo de obtención del cromatograma se efectúa en minutos y en

algunos casos en segundos, en el ejemplo anterior se tuvo un tiempo de
retención de menos de 2 minutos para cada aminoácido.

 Sensibilidad: generalmente se usan muestras líquidas con pequeños volúmenes

(µL) y dentro de estas mezclas pueden ser medidos sus componentes en
cantidades del orden de los nanogramos o menores.
 Versatilidad: Depende de las propiedades físico-químicas de cada muestra.
De acuerdo a lo anterior los métodos cromatográficos se agrupan en tres categorías,

los basados en: a). fenómenos de separación, b).en el estado físico de la fase móvil
y c). En medios físicos en donde las dos fases se ponen en contacto.
3.1.3.1. Métodos cromatográficos basados en el fenómeno de separación.
En este tipo de métodos se toma en cuenta la naturaleza de la fase estacionaria y

móvil para la asignación del nombre que recibe dicho método; por ejemplo, si la fase
móvil es un gas y la fase estacionaria es un líquido, su nombre es cromatografía gas
- líquido (CGL) ; si se tiene un tipo de fases en gas, sólido entonces será una
cromatografía gas –sólido (CGS), y en el caso de ser sus fases líquido-líquido
entonces se trata de una cromatografía de partición y así sucesivamente, como se
muestra en la tabla No. 3.1.

Tabla No.3.1 métodos cromatográficos basados en el fenómeno de separación

Nombre Tipo Tipo de fase Método de fijación en la fase estacionaria
de fase estacionaria
móvil
Gas-líquido gas líquido Es absorbida sobre un sólido poroso en la
superficie interna de un tubo capilar
Gas-sólido gas sólido Absorbida en un sólido poroso sostenido en
una columna tubular
Partición líquido líquido Absorbida en un sólido poroso sostenido en
una columna tubular
Absorción líquido sólido Absorbida en un sólido poroso sostenido en
una columna tubular
Papel líquido líquido Sostenida en los poros de un papel grueso.
Capa fina líquido Sólido Sólido finamente dividido sostenido sobre
un capa de vidrio
Gel líquido líquido Sostenido en los intersticios de un polímero
sólido.
Intercambio líquido sólido Es resina de intercambio iónico sostenida
iónico en una columna tubular.
En la figura No. 3.1, se muestra la separación de tres componentes de una mezcla

utilizando una cromatografía en capa fina; se tiene como fase estacionaria sílica - gel
y como fase móvil una mezcla de alcohol-acetona.
En ella se observa cómo se van desplazando de forma ascendente cada uno de los
componentes, representados por

El sentido del eluyente alcohol- acetona se indica por medio de una flecha, conforme
se desplaza va ocupando la superficie de la fase estacionaria representada por el
sombreado y se aprecia cómo se van separando estos tres componentes.
Figura 3.1 Cromatograma en placa fina utilizando sílica- gel.
3.1.3.2. Métodos cromatográficos basados en el estado físico de la fase móvil.
La cromatografía se puede clasificar de acuerdo a la fase móvil que se emplea; esta

puede ser un gas o bien un líquido. Cuando se trata del medio acarreador un gas
tenemos la cromatografía de gases, la cual se divide a su vez en cromatografía gas -
líquido (CGL) o cromatografía gas – sólido (CGS); el equipo que se utiliza es un
cromátografo de gases.

Para la fase líquida se emplea un cromátografo de líquidos conocido comercialmente

como HPLC (cromátografo líquido de alta resolución; por sus siglas en inglés) y está
cromatografía se divide en cuatro tipos diferentes: Líquido- líquido (CLL), Líquido
sólido (CLS), Intercambio iónico (CII) y de exclusión (CE).
Cromatografía
Cromatografía de gases Cromatografía de

Líquidos
Gas - Líquido Gas - Sólido Líquido - Líquido- Intercambio Exclusión

(CGL) (CGS) Líquido sólido iónico (CE)
(CLL) (CLS) (CII)
Fase enlazada Pares de

(CFE) iones
e móvil.

La figura No. 3.2 Nos da a conocer una guía para la selección del tipo de
cromatografía líquida en HPLC, considerando pesos moleculares de la muestra en
Daltons, solubilidad, ionización y pH.
Soluble en agua fase acuosa C. exclusión
PM>2000
insoluble en
fase no acuosa C. Exclusión
agua
C. Líquido-
Insoluble en homólogos
Muestra líquido C.
agua isómeros
líquido-sólido
fase inversa
soluble en agua C. líquido-líquido
fase móvil
/no-iónico C. exclusión
acuosa
PM<2000
C. intercambio
soluble en agua básico
iónico cationico y
Iónico ácido
anionico
soluble en agua
C. líquido-
Iónico y no fase inversa
líquido
Iónico
Figura 3.2 Guía para la selección del tipo de cromatografía en HPLC.
3.1.3.3 Métodos cromatográficos basados en los medios físicos en que las dos
fases se ponen en contacto.
Es un tipo de cromatografía presuntiva de separación, donde se cuenta con un tubo

de vidrio relativamente estrecho que funciona como columna y el cual se empaca
con alúmina o sílica gel.

Se le introduce tanto la fase móvil como la muestra, las cuales llevan su recorrido a
través de la fase estacionaria de manera descendente por acción de una presión
externa o bien por la fuerza e la gravedad.
Dentro de esta clasificación se considera la cromatografía de elución, adsorción

lineal e intercambio iónico. En el método de adsorción, la fase estacionaria es la
superficie de un sólido polar finamente dividido; en esta clase de empaque, el analito
compite con la fase móvil para ocupar los lugares en la superficie del mismo, la
retención por lo tanto es el resultado de las fuerzas de adsorción.
Al fenómeno por el cual es retenida una determinada sustancia, sobre la superficie

de un sólido se le denomina adsorción y a la sustancia adherida se le llama
adsorbente.
La cromatografía líquido- sólido por adsorción usa una fase estacionaria altamente
polar con un fase móvil menos polar; los dos adsorbentes más utilizados son sílica-
gel, con partículas de 10 µm (el 80% caen dentro de los 8-12 µm).
Otro empaque muy frecuente es la alúmina (Al2O3), ambos adsorbentes contienen

grupos hidroxilos superficiales, los cuales tienen interacciones con los solutos tipo
ácidos de Lewis.
La tabla No.3.2, presenta los nombres comerciales de algunos empaques

característicos para la cromatografía de adsorción, en función de los dos principales
adsorbentes que son la sílica y alúmina, además de considerar su diámetro en µm y
la forma de la partícula.

Tabla No. 3.2 Material de empaque disponible para cromatografía de adsorción
Tipo Nombre Diámetro en µm Forma

SILICA M- pirasil 10 Irregular
Lichrosorb-Si-60 5, 10, 20 Irregular
Partisil 5, 10, 20 Irregular
Micro pack Si 5, 10 Irregular
Sil-X-1 5, 13 Irregular
Paracil C 37, 75 Esférica
Vidac HS 5, 10, 15, 20 Esférica
Hipersil 5, 7 Esférica
Nucleasil 50 5, 10 Esférica
Zorbax Sil 6,8 Esférica
Spherisorb 5, 10 Esférica
ALÚMINA Licrosorb alox 5, 10 Irregular

Micro pack Al 5, 10 Irregular
Spherisorb AY 5, 10,20 Esférica

RESUMEN
1.1 Introducción a la cromatografía

1. los métodos cromatográficos, constituyen una importante herramienta analítica
para la identificación de sustancias orgánicas e inorgánicas; es difícil encontrar
muestras químicamente puras naturales o sintéticas.
2. La primera aplicación de una técnica cromatográfica fue desarrollada por el
Ruso Mijáil Tswett a principios del siglo pasado (siglo XX). Este investigador utilizó
esta técnica para separar diferentes pigmentos vegetales como las clorofilas y las
xantofilas en plantas.
3. La cromatografía es un proceso de partición o separación, en el cuál la
muestra se encuentra en equilibrio entre dos fases. Una fase móvil que sirve para
conducir o encaminar la muestra a lo largo de una columna y
la fase estacionaria o fija, constituida por partículas muy finas que recubren el
empaque de la columna.
4. Los métodos cromatográficos se clasifican dependiendo de su grado de
resolución, velocidad, sensibilidad y versatilidad en: métodos cromatográficos
basados en el fenómeno de separación; en los medios físicos en que las dos fases
se ponen en contacto y por último basados en el estado físico de la fase móvil.
5. Las aplicaciones de la cromatografía se han desarrollado en forma creciente
en los últimos cuarenta años, esto es debido al desarrollo de varios tipos de técnicas
cromatográficas que implican una mejor separación de muestras con propiedades
características.

Preguntas de revisión
1). La primera aplicación de una técnica cromatográfica fue desarrollada por:
2). Los métodos cromatográficos se clasifican dependiendo de su fase móvil en:
3). Al fenómeno por el cual es retenida una determinada sustancia, sobre la

superficie de un sólido se le denomina:
4). Esta fase puede estar constituida por partículas muy finas que recubren el
empaque de la columna.
5). Cromatografía líquido- líquido que utiliza una fase estacionaria polar y una fase
líquida polar.
6).Métodos que utilizan una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria sólida o
líquida
7) Cromatografía en la cual la fase estacionaria se compone de pequeñas partículas

tipo sílica gel adheridas a una placa de vidrio y la fase móvil es un solvente.
8). Mencione dos materiales de empaque disponible para cromatografía de

adsorción.

3.2 Cromatografía de gases
La cromatografía de gases, es un método de separación de los compuestos, basado

en sus distintas adsorciones sobre superficies adsorbentes sólidas o líquidas de
diversos tipos, es en general la mejor técnica de elección en el caso de
separaciones difíciles. En los métodos cromatográficos, las separaciones se
consiguen, casi siempre haciendo fluir la mezcla a través de una columna de
adsorbente. Los componentes emergen de la columna a tiempos diferentes, y
pueden ser recogidos como fracciones separadas (Stanley H. Pine, 1988).
Los modernos equipos de cromatografía permiten estandarizar y controlar cada

etapa del proceso de separación.
3.2.1. Instrumentación.
El equipo básico para la cromatografía gas líquido cuenta con las siguientes partes:
 Suministro de gas portador con un regulador de presión, manómetro y fluxómetro.

 Sistema de inyección
 Columna capilar o empacada.
 Detector
 Un sistema electrónico
 Microprocesador o registrador.
La figura No. 3.3, muestra como se encuentran distribuidos cada uno de los
componentes en un CG.

Figura 3.3 Partes principales de un Cromátografo de gases
Suministro de gas portador. La fase móvil en la CG es un gas, y los más comunes

son el helio, hidrógeno, nitrógeno y argón. La elección del gas acarreador depende
principalmente de las características del detector que se va a usar.
El gas portador, tiene como función transportar la muestra a través de la columna; las
principales características que debe tener son:
a) Ser puro para evitar introducir contaminantes

b) Inerte ya que no debe reaccionar con la muestra
c) Debe estar seco para evitar desbalanceo de los componentes de la muestra al
pasar a través de la columna.

Los gases comerciales graduados deben tratarse si así lo ameritan, con una trampa
de tamiz molecular, que debe colocarse entre el cilindro y la columna empacada;
estos tamices son intercambiadores de iones de silicato de aluminio cuyo tamaño de
poro depende del tipo de catión presente.
Los preparados comerciales de estos materiales están disponibles en tamaño de

partícula de 40 - 60 mesh. Por ello, los tamices moleculares pueden separar las
moléculas pequeñas de las grandes como es el caso del gas utilizado y los
contaminantes como el aire, metano dióxido de carbono, etileno y etano.
Cualquiera de estos contaminantes, en un gas acarreador puede interferir en el

material de empaque, produciendo picos falsos.
Con la utilización de gases impuros, se corre el mismo problema, los elementos

contaminantes encontrados para el He son: el oxígeno, el nitrógeno o hidrocarburos.
Por otra parte, el controlador de flujo (fluxómetro) en el instrumento es importante

para obtener un buen cromatograma; ya que requiere una diferencia de 10 -15 psi
entre el cilindro del gas y la entrada al sistema de inyección. Se sugiere una presión
mínima de 40 psi en el manómetro del cilindro.
3.2.1.1 Sistema de inyección
El área de inyección está provista de un sistema de calefacción (termostato) que se

utiliza para calentar a una temperatura lo suficientemente alta para que la muestra
pase rápidamente a vapor. La temperatura que se debe seleccionar es de 25 a 50 o C

pero no mayor considerando el punto de ebullición más alto del componente de la

muestra.
En la CGL los líquidos se inyectan por medio de una jeringa graduada en µL y el

inyector cuenta en su parte superior con un tapón de hule de silicona (séptum o
septo) en su puerto de inyección que evita que la muestra una vez suministrada
pueda fugarse; hay muchas clases de séptum, la más común es la de sangrado
escaso, séptum con tapón de teflón o de multicapas (ver. Figura No. 3.4).
Figura 3.4 Sistema de inyección de un cromátografo de gases

En una gran parte los análisis se realizan con muestras líquidas, la mayoría de los
cromatografos cuentan con un puerto de inyección que consiste en un bloque de
metal que contiene calentadores y sensores de temperatura, con un porta séptum y
una conexión para la columna en la parte posterior.
El propósito principal del puerto de inyección es el convertir una muestra líquida a

vapor y lo realizan de una forma rápida para que la muestra no se extienda en el gas
acarreador antes que llegue a la columna.
La inyección de la muestra es rápida, para evitar ensanchamiento de bandas de

salida y va a depender en gran parte del analista; además algunos equipos cuentan
con inyectores automáticos ya sea para muestras sólidas, líquidas o gaseosas ya
que la muestra debe ser introducida limpiamente.
Dependiendo del tipo de muestra, la inyección puede ser:
Inyección en columna. Esto es: para muestras de origen biológico, es importante

utilizar un inyector que se conecte directamente a la columna, ya que la temperatura
del puerto de inyección puede descomponer la muestra si hace contacto con la
superficie del metal caliente.
Se llega a utilizar un inyector que se coloca sobre la columna, el cual se parece al

puerto de inyección pero es más corto en tamaño y no tiene cámara de vaporización,
por lo que la aguja llega directamente a la columna, usualmente está hecha de tubo
de vidrio.
Inyección para muestras de gas. Las jeringas para muestras de gas tienen un anillo
sellado alrededor de la punta del embolo para prevenir perdidas de la muestra, a
través del espacio que hay entre el embolo y el cilindro de la jeringa.

Cuando se introduce la aguja dentro del puerto de inyección el gas acarreador

penetra en la jeringa y diluye la muestra.
El mejor modo de inyectar muestras gaseosas es con una válvula de gas, los diseños
modernos incluyen una válvula rotatoria con un tubo calibrado que permite alojar un
volumen conocido de gas e introducir su contenido en el flujo acarreador de la fase
móvil.
Inyección para muestras sólidas. Ocasionalmente la muestra es un material sólido o

ceroso, sin embargo para estos casos se debe remplazar el séptum por un vidrio
sellado o un tubo del elemento Indio, el cual funde a 155ºC que contenga la muestra
sólida, y cuando este se llega a fundir se van los componentes de la mezcla volátiles
directo a la columna.
Inyección de muestras líquidas. Se utilizan jeringas de 10µL; las jeringas suelen ser
excelentes para inyecciones cualitativas y cuantitativas pero es difícil reproducir el
volumen de la inyección, debido a que la aguja se calienta y el volumen del líquido se
expande y volatiza; por lo que se recomienda insertar rápidamente la aguja en el
séptum hasta donde llegue y presionar el embolo inyectando el líquido y sacar
inmediatamente la aguja del puerto de inyección.
3.2.1.2 Columnas y fases estacionarias
La columna se considera como el corazón del cromátografo ya que en ella se

separan los componentes contenidos en la muestra; anteriormente la mayoría de los

análisis se efectuaban en columnas empacadas cuyo empaque (fase estacionaria)

era con tierra de diatomeras obtenida de restos fósiles o bien con ladrillo refractado;
más adelante se utilizaron los silicatos.
Estas columnas eran ya sea de vidrio, de acero inoxidable o cobre cuyo diámetro
normal iba de 0.15 a 0.6 cm y longitudes que varíaban de 1 a 14 m; las columnas
actuales son en su mayoría capilares o abiertas de diámetro muy reducido (4 x 10-3
cm) y longitudes de hasta 50 m.
Las columnas capilares son de dos tipos básicos: las de pared recubierta (WCOT) y
las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares
donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria.
Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente
como el empleado en las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha
adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la
mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean
mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor.
Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último
las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas
capilares abiertas de sílica fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de
sílice especialmente pura, sin apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a la
fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtención del tubo se
recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con
un diámetro de unos pocos centímetros. Estas columnas, con propiedades como
baja reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.
Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm (para
columnas normales) y 150-200 μm para columnas de alta resolución. Estas últimas

requieren menor cantidad de analito y un detector más sensible, al eluir menor

cantidad de gas.
Existen asimismo columnas macro-capilares con diámetros de hasta 530 μm, que
admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores
prestaciones.
Las columnas se colocan en un horno especial que mantiene una temperatura fija
por medio de un termóstato; la temperatura es un factor importante ya que de ella
depende el tipo de análisis y la separación entre los componentes de la mezcla.
Como regla general se puede decir que a temperaturas altas disminuye la solubilidad
de la muestra por la fase estacionaria, dando como resultado corto tiempo de
permanencia en ella, acortándose el tiempo de análisis pero sacrificando la eficiencia
de separación entre los componentes de la muestra (ver figura No. 3.5 ).
Figura 3.5 Selectividad y eficiencia de una columna

La figura No. 3.6, muestra dos cromatogramas de una mezcla de alcoholes uno de
ellos, se obtuvo a una temperatura programa de 100 a 175ºC y el otro llevado a cabo
a temperatura constante de 175ºC.
En ambos se aprecia una buena separación de cada uno de los picos del
cromatograma, la diferencia está en sus tiempos de retención (tiempo que tardan en
eluir cada uno de los componentes de la mezcla) para el primer caso el decanol fue
el que obtuvo mayor tiempo de retención con un tiempo de 20 min; en el segundo
cromatograma el tiempo de retención fue de tan solo 7.5 min.
Figura 3.6 Cromatograma de una mezcla de alcoholes con temperatura programada de

100 – 175ºC y operación isotérmica a 175ºC.
En una columna cromatográfica de gas líquido el tiempo de retención (tr) de un

soluto depende de su coeficiente de distribución.
𝐶𝑠
K=
𝐶𝑚

Donde:
C
s = concentración molar del analito.
Cm = concentración molar de la fase móvil.
El cual a su vez está relacionado con la naturaleza química de la fase estacionaria;

es por ello que, para ser útil en cromatografía gas líquido, estos coeficientes no
deben ser demasiado grandes ni extremadamente pequeños, dado que los primeros
darían tiempos de retención extremadamente largos y los últimos, tiempos tan cortos
que las separaciones son incompletas.
Para que el analito tenga un tiempo de retención razonable en la columna, debe

poseer cierto grado de compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria. Las fases
estacionarias contienen grupos funcionales tales como –CN, -CO y –OH que le dan
cierta polaridad o afinidad por las moléculas polares; al igual ciertas fases
estacionarias del tipo hidrocarburo y dialquilsiloxanos son no polares. Como analitos
polares se incluyen, ácidos, alcoholes y aminas; especies de polaridad intermedia
incluyen éteres, cetonas y aldehídos. Los hidrocarburos saturados son no polares.
La tabla No.3.3, relaciona en orden de polaridad creciente las fases estacionarias

más frecuentemente utilizadas en columnas de cromatografía gases - líquido, tanto
empacadas como capilares, así como su nombre comercial, su temperatura y
aplicaciones comunes ( Skoog-Leary; 1994).

Tabla No. 3.3 Fases estacionarias utilizadas en cromatografía gas – líquido.

Fase estacionaria Nombre Tempera- Aplicaciones
comercial tura Máx.
o
común C
Polidimetilsiloxano Ov-1,SE- 350 Hidrocarburos;
30 aromáticos; drogas,
esteroides
Poli(fenilmetildifenil)siloxano Ov-3,SE- 350 Esteres de ácidos grasos;
(10% fenil) 52 alcaloides; drogas;
halogenados
Poli(fenilmetil)siloxano Ov-17 250 Drogas; esteroides,
(50% fenil) pesticidas; glicoles
Poli Ov-210 200 Aromáticos clorados;
(trifluoropropildimetil)siloxano nitroaromáticos; bencenos
Polietilenglicol Carbo-wax 250 Ácidos libres; alcoholes;

20 M éteres; aceites esenciales
Poli(dicianoalildimetil)silo- Ov-275 240 Alcoholes; Ácidos grasos
xano poliinsaturados
En cualquier columna empacada las moléculas de soluto viajan a través de muchas

rutas. Estas rutas tienen diferentes longitudes y por lo tanto las moléculas de soluto
tienen diferentes tiempos de retención; dentro de estas están:
Difusión por remolinos, transferencia de masa tanto en la fase estacionaria como en

la fase móvil y en la fase móvil estancada (Ver figura No. 3.7).

Figura 3.7 Diferentes formas de difusión de la fase móvil a través de la columna
La velocidad con la que se desplaza el analito a través de la columna es importante

para mejorar la eficiencia de la columna por lo que se puede tomar en cuenta las
siguientes recomendaciones:
a). Tamaño de partícula: La eficiencia de la columna se mejora utilizando partículas

pequeñas de tamaño uniforme.
b). Velocidad de flujo: La columna debe ser operada a una velocidad óptima. Esta se
determina por una gráfica de altura equivalente de platos teóricos contra velocidad
de flujo.
c). Gas transportador: Comúnmente va a depender del detector utilizado; sin

embargo la mejor eficiencia se obtiene con un gas acarreador de peso molecular
alto.
d). Tipo de fase líquida: Deberá usarse una fase líquida de viscosidad baja, presión
baja y con una buena solubilidad para el soluto.
e). Cantidad de fase líquida; las cargas pequeñas de líquido (películas delgadas) de
1 a 10 % tienen la ventaja de análisis rápido y temperatura de operación baja.
f). Presión: La mayoría de los analistas trabajan a una presión de salida de una
atmósfera. Sin embargo se obtienen mejores resultados con una razón baja de
presión de entrada a presión de salida.
g). Temperatura: La resolución se mejora bajando la temperatura de la columna. El

inconveniente es que los tiempos de retención son mayores ya que
al reducir la temperatura también se reduce la descomposición de los compuestos
pero puede aumentar la adsorción.
h). Diámetro de la columna: Utilizando columnas capilares y columnas preparativas

se mejora la eficiencia al contar con diámetros más pequeños. Así para obtener la
más alta resolución se usan columnas de 1/8” y 1/6” y no de 1/4" que eran las más
comunes (Curso I. Tecnológico de Tijuana, 1992).
Eficiencia de la fase líquida. Cuando se llega a seleccionar apropiadamente una fase

estacionaria en estado líquido (cromatografía gas- líquido) se llegan a obtener
cromatogramas de alta resolución ya que los picos cromatográficos están
relacionados con la eficiencia de la fase líquida.

Hay cuatro fuerzas de interacción molecular que ayudan en la separación de los

componentes por cromatografía de gases:
Los puentes de hidrógeno; son fuerzas de atracción débiles que se dan entre
moléculas polares, en la cual el hidrógeno de una de ellas se une al elemento
electronegativo de la otra molécula, se le conoce también como fuerzas de
orientación.
Dipolo inducido son fuerzas de Van der Waals donde la interacción entre dos
moléculas no polares, tiene que ver con un dipolo permanente de una molécula y un
dipolo inducido de otra molécula derivado de la proximidad de ambas.
Fuerzas de dispersión: También conocidas como fuerzas de London, resultan de

variaciones sincronizadas en los dipolos instantáneos entre las dos especies que
interactúan. Se presentan en moléculas apolares.
Fuerzas de interacción específica: resultan de enlaces químicos y formación de

complejos entre el soluto y el disolvente.
3.2.1.3 Sistemas de detección
El sistema de detección en un cromátografo de gases es variado, depende de un

detector que se encarga de recibir la señal del analito una vez que éste emigra de la
columna; existen diversos detectores que son utilizados en función de la sensibilidad
que se desea obtener, del tipo de analito en estudio (detectores específicos o

selectivos) o detectores no destructivos que permiten preservar la muestra para que

sea reutilizada en otro equipo.
La mayoría de los detectores cuentan con una señal analógica que se amplifica y se
envía directamente a un registrador, o bien se convierte en una señal digital que se
manda a una microcomputadora. El equipo procesa los datos, los compara con los
que pueden estar almacenados en su memoria y presenta los resultados en un
cromatograma, ya sea; en la pantalla de la computadora o bien en un impreso.
 Detector de captura de electrones. Un cromátografo puede contar con más de un

detector, uno de los más elementales es el de captura de electrones.
El analito junto con el gas portador proveniente de la columna y se hacen pasar por
un par de electrodos, de los cuales uno de ellos contiene una fuente radiactiva
generalmente de tritio absorbido en titanio o en escandio y níquel 63 en lámina, o
como recubrimiento del interior de la cámara de cátodo .
Este electrodo emite electrones de alta energía (partículas beta), los cuales
bombardean al gas portador, lo que da como resultado la formación de un plasma
de iones positivos y electrones llamados térmicos. Los compuestos que absorben
dichos electrones en la corriente del gas portador, reaccionan para producir iones
negativos de mayor masa. Por lo que la disminución en la corriente del detector,
debido a la remoción de los electrones normales por la recombinación de electrones
térmicos e iones positivos constituye la base cuantitativa de la operación del
detector.
 Detector de conductividad térmica. Se basa en un decremento de la

temperatura por parte de un filamento de platino, oro o tungsteno el cual actúa

como un sensor calentado eléctricamente, esté es colocado en el flujo del gas

portador.
En el momento en que sale de la columna un compuesto con diferente

conductividad térmica que el gas portador, la temperatura del filamento varia y por
tanto también su resistencia eléctrica, lo que es registrada como un aumento o
disminución de la corriente. La pérdida de calor se da por conducción térmica hacia
las paredes del detector ocasionado por las moléculas del analito (ver figura No.
3.8).
Figura 3.8 Detector de conductividad térmica
El detector de conductividad térmica es poco sensible, no es selectivo y se emplea

tanto en muestras orgánicas como inorgánicas, una ventaja que representa es ser
no destructivo lo que permite utilizar los solutos tras la detección. Sin embargo
debido a la cantidad tan pequeña de muestra que utilizan las columnas capilares no
es conveniente su uso.

 Detector de ionización de llama. Es de los detectores más versátiles, su

principio se sustenta en el hecho de que al quemarse los compuestos orgánicos a
través de una flama de hidrógeno/aire, estos producen iones y electrones que
pueden conducir la electricidad a través de la llama.
En este detector se colocan dos placas paralelas a la llama y un cilindro por arriba de
la misma que constituyen los electrodos. Se le aplica un potencial eléctrico de 400 V.
con esto se reduce la resistencia de los electrodos y se produce una intensidad de
corriente ( I ), debida a los iones y electrones libres generados en la llama de
aproximadamente 10-12 A. Este flujo de corriente va a depender de la ionización de
las especies y su cantidad; cuando estos fluyan a una resistencia externa, R
(electrodo colector situado por encima de la llama) se va a generar una caída de
potencial (voltaje), el cual es amplificado y se envía a un dispositivo de salida que
puede ser un registrador o una microcomputadora.
V= IxR
Donde:
I = Intensidad de corriente suministrada por los iones

V = Potencial eléctrico aplicado en Volts
R = Resistencia eléctrica
Este detector tiene la ventaja de ser insensible a los gases no combustibles, como
CO, CO2, NOx, SO2, NH3 entre otros; por lo que se puede utilizar para la mayoría de
los compuestos orgánicos incluyendo los que están contaminados con agua o bien
presentan humedad.

No hay respuesta para grupos funcionales tales como alcoholes, carbonilo,

halógenos o aminas debido a su poca ionización, lo que lo hace ideal para
hidrocarburos; una desventaja es ser destructivo, pero presenta gran sensibilidad es
resistente y fácil de usar ( ver Figura 3.9).
Figura 3.9 Detector de ionización de llama
 Detector termoiónico (TID). Representa Un ejemplo clásico de un detector

selectivo para aquellos compuestos que contienen fósforo y nitrógeno por lo que se
usa de forma frecuente para el análisis de pesticidas.
Este detector es de gran sensibilidad y utiliza una flama de baja temperatura lo que
hace que no se produzca una ionización normal en compuestos que no contengan
fósforo o nitrógeno; cuenta para esto con una esfera de silicato de rubidio, la cual se

calienta eléctricamente formando un plasma al alcanzar una temperatura entre los

600 a 800 oC aplicando un voltaje de 180 V.
El plasma obtenido va a generar una gran cantidad de iones para estos dos
elementos y el comportamiento de los mismos se asemeja en gran parte al FID.
 Detector de emisión atómica (AED). Es de los detectores más recientes,

basado en incorporar al eluyente que sale de la columna a un plasma de He obtenido
por microondas; este plasma atomiza a los elementos de la muestra, alcanzando
niveles de energía superiores y logrando sus espectros respectivos de emisión.
Estos espectros son llevados a un espectrómetro que utiliza una serie de diodos que
son capaces de detectar longitudes de onda entre 170 a 780 nm; el detector es
capaz de medir la concentración de 15 elementos como se muestra en la figura No.
3.10); el carbono es identificable a diferentes λ.
Figura 3.10 Detector de emisión atómica

Un buen detector debe de reunir cierta característica (Skoog Leary ,1992 ) como son:
1. Adecuada sensibilidad de 10-8 a 10-15 g de analito/s.
2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de
magnitud.
3. Buena estabilidad y reproducibilidad
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura

ambiente hasta al menos 400 °C.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
6. Alta fiabilidad y fácil manejo.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta
selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.
8. No destructivo de la muestra.
Aún no existe en el mercado ningún detector que reúna todas estas características, y
al parecer difícil de diseñar algún día.
3.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa CG/EM
Una de las ventajas que se obtienen, al utilizar detectores no destructivos es poder

incorporar la muestra saliente de la columna del cromatógrafo de gases a otro
equipo, como el espectrómetro de masas.
La mayor parte de los espectrómetros de masas, utilizan como detector para CG, un
cuadrupolo compacto que resulta más económico y más fácil de mantener que los
espectrómetros de masas multifuncionales.

Otros detectores de masa que se han llegado a utilizar son los de transformadas de
Fourier, que se ha acoplado a columnas de gas- líquido y que se distinguen por su
alta sensibilidad y rapidez o bien el de trampa de iones que es más compacto y
barato que los instrumentos con cuadrupolo.
Los detectores pueden presentar sus datos de dos formas: La de tiempo real, donde
el cromatograma se presenta de forma gráfica en una pantalla digital de una
computadora, equipada con marcadores de masas y la otra es por medio de la
reconstrucción de los espectros tanto de masa como del cromatograma por una
computadora, que igualmente se puede presentar en pantalla e imprimir.
Uno de los problemas que presenta el sistema de acoplamiento EM/CG es la

eliminación del eluyente antes de la introducción de la muestra en el espectrómetro
de masas, ya que la muestra en el cromatógrafo esta diluida por el gas o líquido
portador en la columna.
Uno de los métodos de depuración de la muestra, consiste, en la aplicación de un

detector selectivo para controlar el efluente de la columna. El caudal de las columnas
capilares es por lo general bajo, como para que la muestra de salida entre a la
cámara de ionización del EM.
En el caso de las columnas de relleno se emplea un separador de chorro hecho de

vidrio (ver figura No. 3.11) , en el cual la salida del gas fluye a través de la boquilla,
lo que repercute que las moléculas del analito que son más pesadas que la del gas
acarreador, en más de un 50 % se desplacen en línea recta hacia el conductor
colector de salida y se dirijan a la fuente de iones del EM.

Figura 3.11 Separador de chorro hecho de vidrio.
La HPLC acoplada a la espectrometría de masas constituye una enorme ventaja

para el análisis de muestras orgánicas y bioquímicas muy complejas, estos equipos
están equipados con un sistema de búsqueda de biblioteca computarizada muy
eficaz; Las bibliotecas de espectros de masas más extensas (> 150,000 espectros)
se comercializan por la casa editorial John Wiley  Sons.
En ese caso concreto cuando un espectro de masas se acopla a un cromatógrafo

(Ver figura 3.12) para la identificación de una mezcla, el ordenador del instrumento
puede adaptarse para que lleve a cabo una búsqueda en biblioteca en todos o en
cualquier subgrupo, de los espectros de masas que se obtienen con una muestra en
particular.
El cromatógrafo de líquidos acoplado al espectrómetro de masas presenta las

siguientes características:

 Bomba cuaternaria de flujo variable y gran precisión, con un volumen muerto

inferior a 650 µl.
 Horno para la columna desde 25ºC hasta 60ºC en incrementos de 0,1ºC.
 Sistema de lavado dinámico de las juntas y émbolos.
 Inyector automático de hasta 120 viales.
 Software de control y tratamiento de datos Millennium 32.
 Detector de espectrometría de masas ZQ 4000
Figura 3.12 Equipo cromatográfico acoplado al espectrómetro de masas con

almacenamiento de espectros para el análisis de mezclas complejas.

RESUMEN
Cromatografía de gases.
1 La cromatografía de gases, es un método de separación de los compuestos,

basado en sus distintas adsorciones sobre superficies adsorbentes sólidas o líquidas
de diversos tipos, es en general la mejor técnica de elección en el caso de
separaciones difíciles.
2. El equipo básico para la cromatografía gas - líquido cuenta con las siguientes
partes: suministro de gas portador con un regulador de presión, manómetro y
fluxómetro; sistema de inyección, columna capilar o empacada, detector, un sistema
electrónico, microprocesador o registrador.
3. En la CGL los líquidos se inyectan por medio de una jeringa graduada en µL y
el inyector cuenta en su parte superior con un tapón de hule de silicona (séptum o
septo) en su puerto de inyección que evita que la muestra una vez suministrada
pueda fugarse.
4. La columna se considera como el corazón del cromátografo ya que en ella se
separan los componentes contenidos en la muestra. Las columnas actuales son en
su mayoría capilares o abiertas de diámetro muy reducido (4 x 10 -3 cm) y longitudes
de hasta 50 m.
5. La velocidad con la que se desplaza el analito a través de la columna es
importante para mejorar la eficiencia de la columna, por lo que se puede tomar en
cuenta las siguientes variables: Tamaño de partícula, velocidad de flujo, gas
transportador, presión, temperatura y diámetro de la columna.
6. El sistema de detección en un cromátografo de gases es variado, depende de
un detector que se encarga de recibir la señal del analito una vez que éste emigra de
la columna.

7. La mayoría de los detectores cuentan con una señal analógica estos son de
diferentes tipos: Detector de captura de electrones, detector de conductividad
térmica, de ionización de llama, termoiónico (TID), detector de emisión atómica
(AED) cada uno con propiedades independientes.
8. Una de las ventajas que se obtienen, al utilizar detectores no destructivos es
poder incorporar la muestra saliente de la columna del cromatógrafo de gases a otro
equipo, como el espectrómetro de masas.
9. La mayor parte de los espectrómetros de masas, utilizan como detector para
CG, un cuadrupolo compacto que resulta más económico y más fácil de mantener
que los espectrómetros de masas multifuncionales.
10. La HPLC acoplada a la espectrometría de masas constituye una enorme
ventaja para el análisis de muestras orgánicas y bioquímicas muy complejas, estos
equipos están equipados con un sistema de búsqueda de biblioteca computarizada
muy eficaz.

PREGUNTAS DE REVISIÓN
1). Detector cromatográficos que emplea radiación UV intensa para ionizar especies
de analito. Las corrientes generadas se amplifican y registran siendo proporcionales
a la concentración del analito.
2). Detector que se basa en la captura de iones producidos durante la pirolisis de
analitos orgánicos a la flama.
3). Es de los detectores más recientes, basado en incorporar al eluyente que sale de
la columna a un plasma de He obtenido por microondas.
4). Un buen detector debe de reunir cierta característica como cuales:
5). Fuerzas de atracción débiles que resultan de variaciones sincronizadas en los
dipolos instantáneos entre las dos especies que interactúan. Se presentan en
moléculas apolares.
6). Cuáles son las diferentes formas de difusión de la fase móvil a través de la
columna.
7). Tipo de columnas que se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como
columnas capilares abiertas de sílica fundida FSOT.
8). La mayor parte de los espectrómetros de masas, utilizan que tipo de detector
para acoplarse a un CG.
9). Los detectores en un sistema acoplado CG- EM pueden presentar sus datos de
dos formas cuáles son:
10). Uno de los problemas que presenta el sistema de acoplamiento EM/CG es

3.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución.
La cromatografía líquida de alta eficacia o de alta resolución (HPLC) es una técnica

utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos
de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica utilizando como fase móvil un solvente.
Este tipo de cromatografía en columna se utiliza con más frecuencia en bioquímica y

química analítica. También se le llegó a denominar como cromatografía líquida de
alta presión, aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso.
3.3.1 Instrumentación.
Un cromátografo HPLC, resulta ser más sofisticado que el que se utiliza en la CG; la
razón de esto es debido a que el tamaño de partícula de la columna por donde debe
pasar el eluyente es muy pequeño entre 3 y 10 µm; esto hace que la presión con que
debe salir la fase móvil sea muy elevada por lo que se requiere de un sistema de
bombeo adecuado.

Figura 3.13 Equipo de cromatográfia HPLC
Los componentes básicos para HPLC, se muestra en las figura No. 3.14 y se
describen a continuación:
 Recipientes para la fase móvil. Algunos equipos de HPLC cuentan con uno o
varios recipientes de vidrio o de acero inoxidable con capacidad de 500 mL, para
contener al disolvente de la fase móvil y su reserva.
Entre otros; estos cuentan con dispositivos que permiten introducir los disolventes
desde dos o más recipientes de la cámara de mezcla a una velocidad que varía
continuamente y la relación de volumen se puede modificar lineal o
exponencialmente con el tiempo.

Cuando la separación se lleva a cabo utilizando un solo disolvente de composición

constante se denomina elución isocrática. En el caso de utilizar dos o más
disolventes la elución es por gradiente y con frecuencia se mejora la separación.
Figura 3.14 Esquema de un aparato de HPLC (Cortesía de Perkin – Elmer para el grupo
Mc Graw Hill)
3.3.2 Sistema de bombeo.
Se llegan a utilizar tres tipos diferentes de bombas: las reciprocas que son
empleadas en un 90 % de los sistemas de HPLC y cuya característica es el contar
con una pequeña cámara donde el disolvente es expulsado por el movimiento de un
vaivén de un pistón, accionado por un motor (ver Figura 3.15).

Figura 3.15 Esquema de una bomba recíproca de HPLC
Bombas de desplazamiento. Que consisten por lo general en una cámara grande

semejando una jeringa, equipadas con un émbolo que se activa por un mecanismo
de tornillo y accionado por un motor de pasos (Ver fig No )
Bombas neumáticas en la cual la fase móvil se encuentra en un contenedor plegable

colocado en un recipiente que puede presurizarse mediante gas comprimido.
En la figura No. 3.16, se muestra el modelo L-2130 HTA (High throughput analysis)
de una bomba reciproca de la compañía Elite LaCrom.
400 bar (- 5 ml/min)

Figura 3.16 Modelo de una bomba reciproca L-2130 HTA
Los requisitos para un sistema de bombeo HPLC son estrictos, ya que se necesitan
presiones por encima de los 6000 psi (lbs./in2), un sistema de amortiguación, para
que esté libre de pulsaciones; un intervalo de 0.1 a 10 mL/ min de caudal y material
que resista la corrosión, incluyendo juntas de acero inoxidable o teflón.
 Sistema de inyección de la muestra. Se utilizan válvulas o lazos (bucles) de

muestreo para inyectar una pequeña cantidad de la muestra alrededor de 5 a 500 µL
(sin despresurizar el sistema) en el flujo de la fase móvil, justo en la cabeza de la
columna de separación.
Con bucles como los de la figura 3.17, se puede introducir la muestra a presiones
de hasta 7000 psi con una precisión relativa de unas décimas por ciento,

Figura 3.17 Un bucle de muestreo para HPLC (Cortesía de Beckman Instruments para
el grupo Mc Graw Hill)
También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes

de 0.5 a 5 µL.
3.3.3 Columnas para cromatografía de líquidos.
La columna más utilizada es de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro empacada

con partículas de 5 µm. Estas columnas tienen calculados de 40 000 a 60000
platos/metro, son de acero inoxidable con un diámetro interno uniforme de 4 a 10 mm
y una longitud de 10 a 30 cm.
También existen otro tipo de columnas que son utilizadas para dar una mejor
eficiencia como son: las columnas de compresión radial, en el que se logra una
cromatografía rápida pero a costa de la detectabilidad; columna de calibre estrecho,

en donde el analista puede optar por diferentes fases móviles que contengan
disolventes no convencionales o de alta pureza, que normalmente no se
considerarían debido a su costo.
Hay también columnas cortas y rápidas, en donde una columna corta tiene una
longitud de tres a seis cm y un diámetro de 3 mm, esto permite ahorrar costos de
disolvente, aumentar la producción de muestras y proporcionar una mayor
sensibilidad de las columnas de longitud convencional.
Cuando se necesita un número de platos teóricos superior a los 30 000, y por lo tanto
son necesarias las columnas largas se pueden unir varias columnas cortas para
construir una columna larga sin pérdida de la cuenta de los platos teóricos.
En la figura No. 3.18, se comparan dos cromatogramas; en uno de ellos se utilizó

una columna de 2 mm por 30 cm y en la otra de 4 mm por 30 cm; ambas empacadas
con la misma fase estacionaria. Picos: (1) acido ascórbico, (2) niacina , (3) piridoxina,
(4) riboflavina, (5) tiamina.

Figura 3.18 Cromatogramas utilizando una columna de 2mm x30 cm y otra de 4 mm x

30 cm
La velocidad lineal es la misma para ambas columnas (18 min) ; sin embargo en el
cromatograma (a) existe una mejor resolución de los picos por parte de la columna
que en el cromatograma (b).
A continuación se da a conocer a los principales fabricantes de columnas de HPLC y

accesorios.
 Agilent Technologies *Beckman Coulter, Inc.

 Dionex Corporation
 Gilson, Inc.
 Hitachi
 Isolation Technologies
 Micro-Tech Scientific Phenomenex

 Proxeon Biosystems A S/
 Shimadzu Scientific Instrumentos
 Sielc
 Supelco
 Thermo Electron Corporation
 Tosoh Corporation
 Varian, Inc.
 Waters Corporation
La resolución de dos picos adyacentes teóricamente depende del número de platos

teóricos (N) que contenga la columna y de la longitud de la misma.
En las mediciones cuantitativas de la eficiencia de la columna se utilizan dos

términos: Altura del plato teórico (H) y número de platos teóricos.
La eficiencia de la columna aumenta en la medida que es mayor el número de platos

teóricos y la altura H es menor. Para calcular el número de platos teóricos de una
columna analítica asociado con un pico dado se utiliza la siguiente expresión:
𝑡𝑅 2
N = 16( )
𝑡𝑤
Si la longitud de la columna es L, la altura equivalente de un plato teórico (H) se

calcula como:
𝐿
H=
𝑁

El valor de H es una función de la velocidad de flujo del gas (F), que se describe por
la ecuación:

H=ɵ+ + F
𝐹
Donde ɵ, ,  son constantes para una columna y sustancia dada. Por lo general, L
se da en cm y F en cm3/min.
La figura No. 3.19, muestra un cromatograma ideal para la separación de dos

sustancias A y B . En este caso tM es el tiempo que requiere una sustancia no
adsorbente para salir de la columna, por lo que es la primera en eluir.
El símbolo (tR)A es el tiempo de retención para la sustancia A y (tR)B es el tiempo de

retención para la sustancia B como se aprecia en la figura de abajo.
Figura 3.19 Cromatograma ideal utilizando una columna empacada.

Mientras que (tW)A y (tW)B , se consideran las amplitudes de los picos en sus bases
dadas en unidades de segundo (seg.) cuando los picos son hasta cierto punto
triangulares.
Por otro lado, el área de un pico es proporcional al número de moléculas del analito y
por lo tanto al número de moles de la mayoría de las sustancias eluidas.
Donde ɵ, ,  son constantes para una columna y sustancia dada. Por lo general, L
se da en cm y F en cm3/min.
La resolución de los picos adyacentes (R) se puede calcular considerando los t r de

cada sustancia y sus amplitudes; de acuerdo a la siguiente expresión:
(𝑡𝑅 )𝐵 − (𝑡𝑅 )𝐴
R=
((𝑡𝑤 )𝐴 +(𝑡𝑤 )𝐵 )/2
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝐵−𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝐴

R=
𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜𝑠
Si el valor de R≈ 1.0 existe una separación razonable entre los dos picos, puesto que
solo existe un 2 % de contaminación cruzada de los picos.
Cuando se supone que son de forma gausiana. Si R≥ 1.5 hay menos de 1% de

contaminación cruzada entre los picos y deben estar completamente separados.

Otro factor importante es la temperatura en grados Kelvin ya que los tiempos de

retención para una sustancia depende de ella; como se aprecia en el siguiente
cromatograma ( ver figura No. 3.20).
Figura 3.20 Representación de tres cromatogramas a diferentes temperaturas
3.3.4. Detectores
Los detectores en HPLC son muy selectivos y su eficiencia va a depender de la

composición de la fase líquida , de la señal transmitida y de la cantidad física medida.
Los detectores utilizados son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una
propiedad física de la fase móvil, tal como índice de refracción, constante dieléctrica,
o la densidad y aquellos que dependen de alguna propiedad del analito. Ejemplo:

Absorbancia UV, fluorescencia o intensidad de difusión que no son propias de la fase

móvil.
Los detectores más utilizados son los UV, los hay de dos tipos: los detectores UV
con filtros, que funcionan como un fotómetro clásico de filtro que utiliza mercurio
como fuente de radiación y que permite analizar solo compuestos que absorben, en
bandas estrechas en esta región 250 365 nm. El cambio de color del filtro se
controla por un ordenador.
Y los detectores UV con monocromadores, la mayoría de ellos cuenta con un

espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Se puede obtener un pico a
determinada λ o elegir distintas longitudes de onda para cada pico.
Otro tipo de detector análogo, es el de infrarrojo existen dos diseños; el primero de

ellos con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro
semicirculares. El intervalo de trabajo es de 4000 a 690 cm -1.
El segundo, se basa en la transformada de Fourier, los cuales se utilizan de forma
similar a los instrumentos de serie de diodos para las medidas de absorbacia UV.
Detector de fluorescencia. Este detector es específico para especies fluorescentes

tales como: muestras medicas, productos naturales, del petróleo y cualquier otras
sustancias que presenten este tipo de emisión o bien que pueden ser tratadas con
algún compuesto fluorescente que reaccione con el analito dando esta característica.
Estos detectores presentan alta sensibilidad, lo que los hace importantes, son
fotoeléctricos que utilizan como fuente de excitación el mercurio y filtros para aislar la
radiación fluorescente.

Detector de índice de refracción. Estos tienen la ventaja de responder a casi todos

los solutos, sin embargo son sensibles a los cambios de temperatura por lo que se
tiene que trabajar a temperatura constante.
Su operación se basa en el paso del eluyente (contiene el analito) a través de un

compartimiento, y el disolvente en su camino hacia la columna pasa por medio de
otro; los dos compartimientos están separados por una placa de vidrio montada a un
ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce
una desviación del haz incidente proveniente de un espejo de iluminación.
El desplazamiento del haz respecto a la superficie fotosensible del detector provoca

una variación en la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,
proporciona el cromatograma.
Detector de dispersión de luz (ELSD). EL efluente de la columna se nebuliza

mediante un flujo de nitrógeno o aire, y las gotitas se llevan a través de un tubo de
conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase
móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. Estas pasan a través de un haz
de láser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada. Su
límite de detección alcanza valores de 5 ng/µL.
Detectores electroquímicos. Estos se basan en métodos electroanáliticos que

incluyen: la amperometría, la coulombimetría, la voltamperometría y la
conductimetría.
Para este tipo de detectores se deben de tener en cuenta las siguientes

precauciones: Checar que tanto la bomba, el detector y el registrador estén
conectados a tierra, usar bombas reciprocas de doble pistón, mantener en todo

momento el flujo de la fase móvil en el detector, operar a un voltaje adecuado entre

otros.
3.3.5 Fase Normal y Fase Inversa
Cromatografía de fase Normal

La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química y se caracteriza por
separar los compuestos en base a su polaridad.
Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se ha
utilizando cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se
asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a
medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto
polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo
de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto

de interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros
estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de
disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los
compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el
tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso en los años setenta con el desarrollo del HPLC de fase
inversa o Inversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos
de retención puesto que los disolventes ácidos cambiaban el estado de hidratación
de la silica o alúmina de la cromatografía.

Cromatografía de fase inversa
La HPLC de fase inversa (IP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase
móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este
tipo de cromatografía es la sílica tratada con R - Me 2SiCl, dónde la R es una
cadena alquílica. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza
apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente (ver
figura No. 3.21).
Figura 3.21 Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de las columnas de

siloxano en fase inversa empaquetada con partículas de 5 µm. Fase móvil: 50/50
metanol/agua.

El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y

disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos.
La cromatografía de fase inversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina

HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase inversa se basa
en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de
repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente
apolar, y una fase estacionaria apolar.
La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la

disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.
Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía interna y de

la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto disolvente polar.
El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil.
Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la
columna y eluye.
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la

retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofóbidad de la molécula. Aun así,
las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del
compuesto y la fase estacionaria.
El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser
inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados
suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total
se ve reducida.

3.3.6 Derivatización
En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de una muestra en

otros compuestos antes, o a veces después de proceder a la separación
cromatográfica. Este procedimiento puede ser útil para:
 Reducir la polaridad de las especies y de este modo utilizar columnas de
reparto y no de intercambio iónico.
 Para aumentar la respuesta del detector para todos los componentes de la
muestra
 Para aumentar selectivamente la respuesta del detector para determinados
componentes de la muestra.
La figura No. 3.22, muestra el uso de derivados para reducir la polaridad y aumentar
la sensibilidad. La muestra está constituida por treinta aminoácidos de interés
fisiológico. Hasta ahora esta separación se realizaba con una cromatografía de
intercambio iónico y con detección fotométrica basada en una reacción postcolumna
de los aminoácidos utilizando un reactivo colorimétrico como la ninhidrina.

Figura 3.22 Cromatograma de los derivados con ortoftalaldehido de 30 aminoácidos.

(Derechos de reproducción desde 1983 de International Scientific Communications, Inc. Para el grupo Mc Graw Hill).
El cromatograma que se muestra se ha obtenido automatizando la obtención de un

derivado con ortoftalaldehido en una precolumna. Los isoindoles sustituidos que se
forman en la reacción exhiben una fluorescencia intensa a los 425 nm, lo que permite
la detección al nivel de unos pocos picomoles ( 10-12 moles).
Por otra parte, la poca polaridad de los derivados hace posible la separación con
rellenos de C18 en fase inversa. Las ventajas de este procedimiento son la rápidez y
el menos consumo de muestra (Skoog- Leary, 1994).

RESUMEN
Cromatografía de líquidos de alta resolución.
1. La cromatografía líquida de alta eficacia o de alta resolución (HPLC) es una

técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la
columna cromatográfica utilizando como fase móvil un solvente.
2. Sistema de inyección de la muestra. Se utilizan válvulas o lazos (bucles) de

muestreo para inyectar una pequeña cantidad de la muestra alrededor de 5 a 500 µL
(sin despresurizar el sistema) en el flujo de la fase móvil, justo en la cabeza de la
columna de separación.
3. La columna más utilizada es de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro

empacada con partículas de 5 µm. Estas columnas tienen calculados de 40 000 a
60000 platos/metro, son de acero inoxidable con un diámetro interno uniforme de 4 a
10 mm y una longitud de 10 a 30 cm.
4. La eficiencia de la columna aumenta en la medida que es mayor el número de

platos teóricos y la altura H es menor. Para calcular el número de platos teóricos de
una columna analítica asociado con un pico dado se utiliza la siguiente expresión:
𝑡 2
N = 16(𝑡 𝑅 ) .
𝑤
5. La resolución de los picos adyacentes (R) se puede calcular considerando los t r de

cada sustancia y sus amplitudes; de acuerdo a la siguiente expresión:
(𝑡𝑅 )𝐵 − (𝑡𝑅 )𝐴
R= ((𝑡
𝑤 )𝐴 +(𝑡𝑤 )𝐵 )/2

6. Los detectores en HPLC son muy selectivos y su eficiencia va a depender de la

composición de la fase líquida , de la señal transmitida y de la cantidad física medida.
7. Los detectores utilizados son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una
propiedad física de la fase móvil, tal como índice de refracción, constante dieléctrica,
o la densidad y aquellos que dependen de alguna propiedad del analito. Ejemplo:
Absorbancia UV, fluorescencia o intensidad de difusión que no son propias de la fase
móvil.
8. La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer
tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química y se caracteriza por
separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase
estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se ha utilizando cuando el compuesto de
interés es bastante polar.
9. La HPLC de fase inversa (IP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase
móvil de polaridad moderada. La cromatografía de fase inversa se basa en el
principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión
entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una
fase estacionaria apolar.
10. En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de una muestra
en otros compuestos antes, o a veces después de proceder a la separación
cromatográfica esto se realiza a través de técnicas de derivatización.

EJERCICIOS PROPUESTOS.
1. Por cromatográfia HPLC se separaron dos componentes de una mezcla de

cetonas (Cloroacetona y dicloroacetona), usando una columna de 25 cm x 4 mm de
, que tiene calculados 45,000 platos teóricos y una velocidad de flujo 15 mL/min; a
los 20 s, emerge un pico de aire no adsorbente, el pico A emerge a los 3 min y el
pico B a los 3.8 min. Calcular:
a) T𝑤𝑎 y T𝑤𝑏 para cada uno de los picos.
b) La altura de los platos teóricos
c) La resolución de la columna
d) Mencionar si la separación fue eficiente.
2. Un cromatógrafo logro separar una mezcla de alcoholes alifáticos con peso

molecular bajo, en total resultaron seis compuestos hidroxilados; utilizando una
columna capilar WCOT de 30 cm x 3.5 mm y a una temperatura isocrítica de 65 oC;
se obtuvieron los siguientes datos:
Pico A B C D E F
tR, (seg) 140 167 740 1019 1212 1765
Área, cm2 16 19.2 12.3 132 72 15
Tomando en consideración la información de la tabla anterior calcular:
a). Las amplitudes de las bases T𝑤𝑎 y T𝑤𝑏 para cada pico.
b) La resolución de la columna considerando los picos adyacentes B y C

c). La concentración de cada una de los compuestos, sabiendo que posterior al

análisis se inyectaron 5µL de muestra que contenían 500 mg de cada uno de los
alcoholes separados. Con los siguientes datos:
Pico A B C D E
Área, cm2 18.4 24 19.68 97.2 19.5
gpo. Testigo
d). Cuál de los compuestos resultó más concentrado.

Preguntas de revisión
1). La resolución de los picos cromatográficos está relacionada con:
2). Cuando la separación cromatográfica se lleva a cabo utilizando un solo

disolvente de composición constante se denomina elución:
3). Para el sistema de bombeo en HPLC se llegan a utilizar tres tipos diferentes de
bombas cuales son:
4). El sistema de inyección de la muestra en un equipo HPLC utiliza:
5). Mencione a tres principales fabricantes de columnas capilares que le resulten

conocidos.
6) Métodos cromatográficos que se basan en el principio de las interacciones

hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente
relativamente polar.
7). Cromatografía que consiste en utilizar una fase inmóvil apolar y una fase móvil de
polaridad moderada.

Unidad III Cromatografia

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Unidad III Cromatografia

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Unidad III: Métodos Cromatográficos

En este apartado se considera la parte del desarrollo histórico y evolución de la

En la actualidad los métodos cromatográficos, constituyen una importante

Los fundamentos de la cromatografía siguen siendo los mismos que anteceden a su

Libro de Texto: Química Analítica II Página 209

La cromatografía se divide de acuerdo a su fase móvil en dos tipos: la cromatografía

3.1.1 Concepto y desarrollo histórico de la cromatografía

La primera aplicación de una técnica cromatográfica fue desarrollada por el Ruso

En sus experimentos uso un tubo de vidrio empacado con carbonato de calcio en

Libro de Texto: Química Analítica II Página 210

Existen varias definiciones de cromatografía, una de las más sencillas es considerar

Generalizando; la cromatografía nos permite aislar, identificar y establecer, cuántos y

Una de las bases de la cromatografía se debe a su diferencia de adsorción en una

Las aplicaciones de la cromatografía se han desarrollado en forma creciente en los

Libro de Texto: Química Analítica II Página 211

3.1.2. Conceptos de la fase estacionaria y fase móvil

La cromatografía es un proceso de partición o separación, en el cuál la muestra se

3.1.3. Clasificación de los métodos cromatográficos.

Los métodos cromatográficos se clasifican dependiendo de su grado de resolución,

 Resolución: nos sirve para muestras complejas; separando sustancias

 Velocidad: el tiempo de obtención del cromatograma se efectúa en minutos y en

Libro de Texto: Química Analítica II Página 212

 Sensibilidad: generalmente se usan muestras líquidas con pequeños volúmenes

 Versatilidad: Depende de las propiedades físico-químicas de cada muestra.

De acuerdo a lo anterior los métodos cromatográficos se agrupan en tres categorías,

3.1.3.1. Métodos cromatográficos basados en el fenómeno de separación.

En este tipo de métodos se toma en cuenta la naturaleza de la fase estacionaria y

Libro de Texto: Química Analítica II Página 213

Tabla No.3.1 métodos cromatográficos basados en el fenómeno de separación

En la figura No. 3.1, se muestra la separación de tres componentes de una mezcla

Libro de Texto: Química Analítica II Página 214

Figura 3.1 Cromatograma en placa fina utilizando sílica- gel.

3.1.3.2. Métodos cromatográficos basados en el estado físico de la fase móvil.

La cromatografía se puede clasificar de acuerdo a la fase móvil que se emplea; esta

Libro de Texto: Química Analítica II Página 215

Para la fase líquida se emplea un cromátografo de líquidos conocido comercialmente

Cromatografía de gases Cromatografía de

Gas - Líquido Gas - Sólido Líquido - Líquido- Intercambio Exclusión

Fase enlazada Pares de

Libro de Texto: Química Analítica II Página 216

Soluble en agua fase acuosa C. exclusión

Figura 3.2 Guía para la selección del tipo de cromatografía en HPLC.

Es un tipo de cromatografía presuntiva de separación, donde se cuenta con un tubo

Libro de Texto: Química Analítica II Página 217

Dentro de esta clasificación se considera la cromatografía de elución, adsorción

Al fenómeno por el cual es retenida una determinada sustancia, sobre la superficie

Otro empaque muy frecuente es la alúmina (Al2O3), ambos adsorbentes contienen

La tabla No.3.2, presenta los nombres comerciales de algunos empaques

Libro de Texto: Química Analítica II Página 218

Tabla No. 3.2 Material de empaque disponible para cromatografía de adsorción

Tipo Nombre Diámetro en µm Forma

ALÚMINA Licrosorb alox 5, 10 Irregular

Libro de Texto: Química Analítica II Página 219

1.1 Introducción a la cromatografía

Libro de Texto: Química Analítica II Página 220

1). La primera aplicación de una técnica cromatográfica fue desarrollada por:

2). Los métodos cromatográficos se clasifican dependiendo de su fase móvil en:

3). Al fenómeno por el cual es retenida una determinada sustancia, sobre la

7) Cromatografía en la cual la fase estacionaria se compone de pequeñas partículas

8). Mencione dos materiales de empaque disponible para cromatografía de

Libro de Texto: Química Analítica II Página 221

3.2 Cromatografía de gases

La cromatografía de gases, es un método de separación de los compuestos, basado

Los modernos equipos de cromatografía permiten estandarizar y controlar cada