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FACULTAD DE QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
EVALUACIÓN DE PRODUCTO
ACTIVIDAD GENOTÓXICA EN EL MATERIAL PARTICULADO
FRACCIÓN RESPIRABLE PM2.5 EN MÉRIDA, YUCATÁN,
MÉXICO.
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN................................................................................................4
II. ANTECEDENTES...............................................................................................4
II.1 Índice de calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida.........................5
II.2 Origen y composición del material particulado..................................................5
II.3 Análisis del potencial citotóxico y genotóxico....................................................6
II.3.1 Método de extracción de PM2.5...................................................................6
II.3.2 Prueba de genotoxicidad............................................................................6
III.3.3 Cultivo celular............................................................................................7
III.3.4 Método de Ficoll-Paque............................................................................7
III.3.5 Pruebas de viabilidad celular....................................................................8
III.3.6 Azul de tripano..........................................................................................8
III.3.7 Prueba de bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico (MTT).
............................................................................................................................ 8
III. OBJETIVOS....................................................................................................9
III. 1 Generales.......................................................................................................9
III. 2 Específicos.....................................................................................................9
IV. HIPÓTESIS.....................................................................................................9
V. JUSTIFICACIÓN................................................................................................9
VI. DISEÑO EXPERIMENTAL............................................................................10
VI.1 Contexto........................................................................................................10
VI.2 Obtención del extracto de material orgánico extraíble (MOE) de PM2.5 a partir
del filtro de muestreo............................................................................................10
VI.3 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular......................................................11
VI.4 Cultivo celular y ensayos de citotoxicidad......................................................11
VI.5 Genotoxicidad...............................................................................................12
VII. METODOLOGÍA...........................................................................................12
VII.1 Extracción de partículas PM2.5 a partir del filtro del muestreo.......................12
VII.2 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular.....................................................12
VII.3 Cultivo celular y citotoxicidad.......................................................................13
VII.4 Genotoxicidad..............................................................................................13
VIII. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS...........................................................14
VIII.1 Viabilidad celular.........................................................................................14
VIII.2 Citotoxicidad................................................................................................14
VIII.3 Evaluación genotoxicidad del MOE por medio del ensayo cometa alcalino 14
VIII.4 Análisis estadístico......................................................................................15
IX. CRONOGRAMA............................................................................................16
X. REFERENCIAS................................................................................................17
I. INTRODUCCIÓN
La exposición a los contaminantes atmosféricos, como el material
particulado, se asocia con diferentes daños a la salud humana y la magnitud
de los efectos depende de las concentraciones que se encuentran en el aire,
de la dosis que se inhala, del tiempo y la frecuencia de exposición, así como
de las características de la población expuesta. Los hallazgos recientes de
estudios epidemiológicos realizados tanto en el contexto poblacional como
ocupacional, además de estudios toxicológicos y de exposición en seres
humanos, indican que las concentraciones que hoy se observan en
numerosas ciudades del país implican riesgos para la salud, debido a que se
encuentran por encima de los niveles establecidos por las normativas
nacional e internacional aplicables.
De acuerdo con la NOM-025-SSA1-2014 el Material Particulado (PM) es una
mezcla compleja de sustancias en estado líquido o sólido, que permanece
suspendida en la atmósfera por periodos variables de tiempo. Por su origen,
las partículas pueden definirse como primarias (aquellas producidas
directamente por alguna fuente contaminante) o secundarias (las que se
forman en la atmósfera, como resultado de la interacción química entre
gases y partículas primarias).1
En la actualidad, varios componentes del PM como los hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HAP), los metales y sales inorgánicas, son
considerados responsables de efectos adversos en la salud ya que son
carcinógenos y citotóxicos. A nivel mundial, se estima que el PM causa
aproximadamente el 3% de los problemas cardiopulmonares y el 5% de las
muertes por cáncer de pulmón (WHO, 2013).2
II. ANTECEDENTES
La calidad del aire es un factor de gran importancia para la salud humana y
de los ecosistemas por las emisiones de gases que pueden dispersarse. En
grandes ciudades de México, se realiza el monitoreo de contaminantes que
determinan la calidad del aire: Bióxido de Azufre (SO 2), Bióxido de Nitrógeno
(NO2), PM, Monóxido de Carbono (CO) y Ozono (O 3) en zonas
metropolitanas y corredores industriales.
Es importante mencionar, que algunas de las consecuencias a la salud que
trae consigo la contaminación atmosférica se pueden presentar a corto o
largo plazo. Los principales efectos son: el riesgo de padecer enfermedades
respiratorias agudas, como neumonía, y crónicas, como el cáncer de pulmón
y las enfermedades cardiovasculares. 3
II.1 Índice de calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida
En la ciudad de Mérida fue realizado un estudio en el año 2013 que consistió
en monitoreos constantes sobre la calidad del aire de la zona centro y sur
poniente de ésta ciudad, a través del uso de indicadores obtenidos de datos
monitoreados para los contaminantes criterio, con base al INECC-
SEMARNAT, 2013: SO2, NO2, Material Particulado de 2.5 μg/m 3 (PM2.5) y 10
μg/m3 (PM10), CO y O3, leyendo e interpretando los resultados dentro de los
rangos del Índice Metropolitano de la Calidad del Aire (IMECA) para
determinar la calidad del aire y los efectos a la salud humana de los
habitantes de la ciudad de Mérida.
La interpretación de los resultados IMECA obtenidos de la caseta de
SEDUMA durante 2013, presentan una calidad del aire buena, a excepción
del mes de abril, donde las partículas determinaron que la calidad del aire fue
regular debido a una presencia ligeramente elevada de PM 2.5. De forma
general, en lo que respecta a la caseta ubicada en periférico se presenta una
buena calidad del aire, la caseta ubicada en Hunxectamán, presentó una
calidad regular en el mes de octubre a través del parámetro CO, una calidad
muy mala en el mes de junio en cuanto al SO 2 y una extremadamente mala
calidad del aire en el mes de julio al mismo contaminante, y a lo que los
siguientes meses respecta se mantuvo con una buena calidad, en la caseta
ubicada en Tixcacal, que en todo el año la calidad del aire fue buena. 3
III. OBJETIVOS
III. 1 Generales
Determinar el potencial citotóxico y genotóxico del material particulado menor
a 2.5 µg/m3 (PM2.5) de naturaleza orgánica en CMSP en la ciudad de Mérida,
Yucatán, México.
III. 2 Específicos
1) Extraer el PM2.5 de naturaleza orgánica contenido en los filtros de la
estación de monitoreo de la Secretaría de Desarrollo Urbano y Medio
Ambiente del Gobierno del Estado de Yucatán (SEDUMA).
2) Extraer, aislar y cultivar las CMSP humanas de un de un individuo sano.
3) Evaluar los efectos citotóxico y genotóxico del PM 2.5 en la línea celular de
las CMSP.
IV. HIPÓTESIS
El PM2.5 posee actividad citotóxica y genotóxica en las células mononucleares
de sangre periférica a la concentración a la que se muestrearon en la ciudad
de Mérida, Yucatán, México.
V. JUSTIFICACIÓN
Actualmente, la contaminación atmosférica es uno de los principales
problemas que enfrenta el hombre; un quinto de la población latinoamericana
está expuesta a este tipo de contaminación. La falta de planeación urbana, el
crecimiento demográfico y el aumento de automóviles, son algunas de las
causas del aumento de los contaminantes atmosféricos que afecta a más de
80 millones de personas y es responsable de más de 2 millones de
casos/año de enfermedades respiratorias en niños latinoamericanos. 2
La calidad del aire es un factor de gran importancia para la salud humana y
de los ecosistemas por las emisiones de gases que pueden dispersarse. Los
resultados IMECA obtenidos de la caseta de SEDUMA durante 2013,
presentan una buena calidad del aire, a excepción del mes de abril, donde
las partículas determinaron que la calidad del aire fue regular debido a una
presencia ligeramente elevada de partículas PM 2.5.3
Existe información en donde se evidencia que inclusive a concentraciones
inferiores al nivel máximo permisible de PM 10 se observa una genotoxicidad
significativa, y dado que las PM 2.5, son partículas más finas y poseen una
mayor facilidad de entrar a los alvéolos pulmonares (mayor factor de riesgo
en la salud), resulta importante evaluarlas en la ciudad de Mérida. 13
La exposición prolongada a altas concentraciones de PM aumenta el riesgo
de cáncer de pulmón, enfermedades respiratorias y arteriosclerosis, mientras
que la exposición a corto plazo puede agudizar enfermedades respiratorias
como bronquitis, asma, y el ritmo cardíaco. Se ha demostrado que las
partículas más pequeñas son más tóxicas debido a su más alto contenido de
materia orgánica y mayor capacidad de generar radicales libres.
Los mecanismos biológicos de estas asociaciones son desconocidos, sin
embargo estudios toxicológicos in vitro han demostrado que el PM induce
varios tipos de efectos citotóxico, mutagénico, daño en el DNA y estimulación
de la producción de citoquinas pro-inflamatorias, entre otros. 2
VI.5 Genotoxicidad
Para evaluar la genotoxicidad de las PM2.5 se usará el ensayo cometa
alcalino, método empleado por Mendoza et. al.13 el cual aprovecha las
células tratadas con el MOE extraído a partir del filtro. Se mezclará una
alícuota de tales células con agarosa de bajo punto de fusión. Esta mezcla
se sembrará en una lámina de Gelbond y se someterá a solidificación,
posterior a esto se realizará una lisis celular por 24 horas, añadiendo un
buffer de lisis que contiene Tritón X-100, DMSO, NaCl, EDTA que permitirán
la desestabilización de las membranas y la inactivación de enzimas líticas del
DNA y RNA, de modo que el daño visto, corresponda a las MOE del PM 2.5.
Terminado el periodo de lisis, las láminas se dejarán reposar en el buffer de
electroforesis (Na2EDTA y NaOH, pH 13.5) para permitir la correspondiente
desnaturalización o efecto en el DNA; se realizará una corrida electroforética
a 25mV y 300mA de resistencia a 4°C, por 30 minutos. Se hará un lavado de
las láminas con solución neutralizante de pH 7.5, y se usará bromuro de
etidio 2 μL/mL como colorante de la lámina. La lectura de los núcleos se
realizará en un microscopio de fluorescencia y se analizarán 100 células con
el software “Casp”, para cada tratamiento (concentraciones).
VII. METODOLOGÍA
VII.1 Extracción de partículas PM2.5 a partir del filtro del muestreo
Extraer el material orgánico por ultrasonicación usando DCM en una
proporción de 1 mL de disolvente por 1 mg TPS recogido. Sonicar un cuarto
de cada filtro durante 10 minutos por triplicado, posteriormente depurar con
filtros Fluoropore-Millipore. Los extractos se mezclaron para componer
grupos de cada temporada de la siguiente manera: Invierno (diciembre,
enero y febrero); primavera (marzo, abril y mayo); verano (junio, julio y
agosto) y otoño (septiembre, octubre y noviembre). Reducir el volumen de
extracto con un evaporador rotatorio al vacío y secar usando una corriente
suave de nitrógeno. Determinar la concentración de MOE y almacenar el
residuo a -20 °C en 10 mL de DCM.
VII.2 Aislamiento de CMSP y viabilidad celular
Extraer sangre mediante venopunción en dos tubos con anticoagulante
EDTA, inmediatamente después aislar las CMSP mediante gradiente de
densidad con Ficoll-Paque, adicionar 5 mL de sangre y 5 mL de solución
Ficoll-Paque (proporción 1:1); centrifugar a 1800 rpm por 30 minutos a
temperatura ambiente; posteriormente, recuperar la interfase que contiene
las CMPS para realizar dos lavados con 5 mL de PBS a 1000 rpm durante 7
min, luego de esto resuspender las células en 1 mL de medio Dulbecco
Modified Eagles minimal essential Medium (DMEM) complementado con
suero fetal bovino al 10%.
Diluir en proporción 1:1 la suspensión celular y el azul tripano al 0.04%,
posteriormente colocar la dilución en una cámara de Neubauer y realizar el
conteo de células viables y a partir de esto calcular el número de células
viables por mililitro y el porcentaje de viabilidad.
VIII.2 Citotoxicidad
Tabla 2. Porcentaje de citotoxicidad
X́ A ° del X́ A ° del % de % de
tratamiento control proliferación citotoxicidad
Dónde:
Dónde:
MESES
ACTIVIDADES 2018 2019
AGO SEP OCT NOV DIC ENE
Extraer las PM2.5 de naturaleza
orgánica contenido en los filtros
de la estación de monitoreo de la
SEDUMA, Yucatán.
Extraer, aislar y cultivar las
CMSP humanas de un de un
individuo sano.
Determinar la citotoxicidad de
las PM2.5 de naturaleza orgánica
en la línea celular de CMSP.
Demostrar la genotoxicidad de
las PM2.5 en la línea celular
CMSP.
Integración y análisis de
resultados.
X. REFERENCIAS
1) Norma Oficial Mexicana NOM-025-SSA1-2014, salud ambiental. Valores
límite permisibles para la concentración de partículas suspendidas PM 10 y
PM2.5 en el aire ambiente y criterios para su evaluación.
2) Betancur Sánchez, A. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad del
material químico en filtros PM2.5 de las estaciones de monitoreo de la red
de calidad del aire del Valle de Aburrá; Proyecto del Departamento de
Geociencias y Medio Ambiente: Colombia, Medellín, 2016.
3) Salazar Ku, Y. M.; Arias Estrella, E.; Alatriste Guarneros, M. F. Índice de
calidad del aire de la zona metropolitana de Mérida; Proyecto de Servicios
de Ingeniería y Consultoría Ambiental, S.C.P.: Hidalgo, 2015.
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