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Organizada por:
Ann H. Mounteer
Luís Eduardo do Nascimento
VIÇOSA
2015
INDICE
Os diferentes métodos tradicionais de expressar concentração nas diversas análises de qualidade de água
se diferem da forma recomendada no Sistema Internacional (SI), e, portanto, merecem uma discussão
mais aprofundada. O texto a seguir é uma tradução livre de material encontrado no livro Water
Chemistry (Snoeyink e Jenkins, 1980).
1. Concentração em massa
segue que a concentração em mg kg-1 (ppm) = concentração em mg (l )-1. Quando = 1 kg/L, mg kg-1
= mg/L. Para a maioria das águas naturais e residuárias (exceto água do mar ou muito salobra),
assumimos que a densidade = 1 kg/L. O componente de massa pode ter várias formas, conforme
ilustrado no exemplo a seguir.
Exemplo: Uma solução de nitrato de amônio (NH 4NO3) foi analisada para determinar as concentrações
dos íons nitrato (NO3-) e amônio (NH4-). Foram encontrados 36 mg de NH4- e 124 mg de NO3- em 100
mL da amostra. Portanto, a solução contém:
2. Concentração molar
Exemplo: Determinar a molaridade de uma solução contendo 36 mg de NH4- e 124 mg de NO3- em 100
mL da amostra.
1
3. Equivalentes e concentração normal
A concentração em equivalentes por litro (N) ou normalidade (N) depende do tipo de reação da qual os
constituintes em solução participam. A vantagem do uso da normalidade é que quando duas substâncias
reagem, o número de equivalentes de cada espécie que reage é igual ao número de equivalentes do
produto. O número de equivalentes depende do peso equivalente da substância de interesse. Existem
casos em que uma única substância apresenta dois pesos equivalentes diferentes, porque participa de
dois tipos de reação diferentes. Uma solução 1 normal = 1 eq/L:
i. Peso equivalente baseado na valência dos íons, utilizado para reações de precipitação e dissolução:
peso equivalente = peso molar ,
|valência do íon|
sendo que uma unidade de carga por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
Exemplos:
a. Determinar a normalidade de uma solução de 80 mg/L CO32-, dado que CO32- participa da seguinte
reação de precipitação:
Ca2+ + CO32- CaCO3(s)
cada mol contém 2 cargas positivas (Ca 2+) e 2 cargas negativas (CO32-)
b. Determinar a normalidade de uma solução de 155 mg/L Ca3(PO4)2, dado que o Ca3(PO4)2 participa
da seguinte reação de dissolução:
Ca3(PO4)2(s) 3Ca2+ + 2PO43-
ii. Peso equivalente baseado no número de íons de hidrogênio ou hidróxido envolvidos numa reação
ácido-base
peso equivalente = peso molar,
n
onde n = número de H+ ou OH- que reage,
2
sendo que 1H+ ou 1 OH- por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
2ª reação: 1OH- é formado por cada mol de CO32- que reage, portanto:
iii. Peso equivalente baseado no número de elétrons (e-) transferido numa reação redox.
sendo que 1 e- transferido por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
Para determinar o peso equivalente dos reagentes, é necessário separar a reação em duas reações, uma
de oxidação e uma de redução:
3
4. Concentração equivalente de O2
Os resultados das análises de demanda bioquímica (DBO) e química (DQO) de oxigênio são expressos
como oxigênio, assumindo que cada mol de O2 pode aceitar 4 mols de elétrons (O2 + 4e- 2O2-). Por
exemplo, na determinação de DBO, se 0,25 x 10-3 mols O2 reagem com a matéria orgânica em 300 mL
de água, a concentração de matéria orgânica, expressa como DBO, é:
Na determinação de DQO, o agente oxidante é o dicromato (Cr 2O72-). Durante o teste, determina-se o
número de equivalentes por litro de Cr2O72- utilizado para oxidar a matéria orgânica. Pressupõe-se que
se O2 tivesse sido utilizado, o mesmo número de equivalentes de O 2 teriam reagido. Portanto,
O sistema de carbonato de cálcio (CaCO3) é amplamente empregado para expressar dureza (Ca e Mg) e
alcalinidade (HCO3-, CO32- e OH-). Neste sistema, a concentração de uma substância em mg/L como
equivalente de CaCO3 é calculada pela equação:
Por exemplo, para dureza o peso equivalente de CaCO3 é definido baseado na valência (reação de
dissolução):
CaCO3(s) Ca2+ + CO32-
e cada mol de CaCO3 produz 1 mol, ou 2 equivalentes, de Ca2+. Portanto, em relação a Ca2+:
Para a reação de alcalinidade total, o que importa é o CO32-, e o peso equivalente de CaCO3 é definido
baseado no número de íons de hidrogênio que reage (reação ácido-base):
Uma vez que 2H+ reagem com cada mol de CaCO3, para CO32-:
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II. ANÁLISES VOLUMÉTRICAS E COLORIMÉTRICAS
1. Análises Volumétricas
Rearranjando, tem-se:
mg/L de substância ativa na amostra = volume titulante (mL) x N (eq/L) x Peq (mg/eq),
volume da amostra (mL)
Exemplo: Numa análise de cloretos, gastaram-se 13 mL da solução titulante AgNO3 0,0141 N para a
titulação de 100 mL de uma amostra de água. Determinar a concentração de cloretos na amostra.
13 mL x 0,0141 eq/L x 35.400 mg Cl-/eq = 64,9 mg/L Cl-
100 mL
Exemplo: Preparou-se o titulante HCl 0,01N. Gastaram-se 19,3 mL de uma solução de Na2CO3 0,01N
para padronizar 20 mL dessa solução. Qual é a normalidade real da solução titulante?
FC = 19,3 mL = 0,965
20 mL
normalidade = 0,01N x 0,965 = 0,00965N
2. Análises Colorimétricas
6
c=A
al
Análises colorimétricas podem ser realizadas utilizando diferentes equipamentos, incluindo os tubos de
comparação de cor (tubos Nessler), o colorímetro fotoelétrico e o espectrofotômetro. Os colorímetros
e espectrofotômetros precisam ser calibrados para cada tipo de análise efetuada. A calibração é feita
preparando uma série de padrões de concentrações conhecidas, seguindo o mesmo procedimento
empregado para a análise das amostras. A absorbância dos padrões, no comprimento de onda () de
máxima absorção, é lida, e o gráfico de absorbância versus concentração é elaborado (curva padrão). A
absorbância das amostras, lida no mesmo comprimento de onda, é convertida em concentração por
interpolação da curva.
Exemplo: Considerar os seguintes dados obtidos para a análise de DQO pelo método colorimétrico:
0,4
180 0,085 0,3
0,2
360 0,17
0,1
510 0,242 0
720 0,330 0 300 600 900
-1
DQO, mg l O2
900 0,399
Baseada na curva padrão, a DQO das amostras será calculada pela equação:
Abs600 nm 0,00671
DQO
0,000445
A DQO da amostra 1 = 607 mg/L O2
A DQO da amostra 2 não pode ser calculada, porque sua absorbância está fora da curva padrão. Nesse
caso seria necessário diluir a amostra e analisá-la de novo.
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III. MÉTODOS PADRONIZADOS
Métodos padronizados para determinação da maioria dos parâmetros de qualidade de águas naturais e
residuárias estão coletados no livro de referência Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater, editado, em conjunto, pela American Public Health Association (APHA), American Water
Works Association (AWWA) e Water Environment Federation (WEF). A padronização dos métodos de
análise é de fundamental importância uma vez que permite comparar dados obtidos em diferentes épocas
e locais. Os métodos descritos nesta apostila se baseiam no disposto na 22ª Edição do Standard Methods,
publicada em 2012. Para maiores detalhes dos métodos descritos, deve-se consultar esse compêndio.
Os métodos contemplados nesta apostila seguem.
IV. REFERÊNCIAS
RICE, E.W.; BAIRD, R. B.; EATON, A.D.; CLESCERI, L.S. (Eds.) Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater, 22 ed. Washington: APHA-AWWA-WEF, 2012.
SAWYER, C.N.; McCARTY, P.L.; PARKIN, F.F., Chemistry for Environmental Engineering and
Science, Boston: McGraw-Hill 2003.
SNOEYNIK, V.L.; JENKINS, D. Water Chemistry, New York: John Wiley & Sons, 1980.
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REQUISITOS PARA PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS
Tempo máximo de
Volume
1 2 armazenagem
Parâmetro Frasco mínimo de Forma de Preservação
recomendado /
amostra, mL
permitido
Alcalinidade P, V(B) 200 Refrigerar 24 h / 14 d
DBO P, V 1000 Refrigerar 6 h / 48 h
DQO P, G 100 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 7 d / 28 d
Cloretos P, V 50 Nenhuma 28 d
Clorofila P, V 500 30 d no escuro 30 d
Cor P, V 500 Refrigerar 48 h / 48 h
Condutividade P, V 500 Refrigerar 28 d / 28 d
Dureza, Ca, Mg P, V 100 HNO3 até pH < 2 6 meses / 6 meses
Fosfato dissolvido – filtrar
Fosfato V(A) 100 48 h
imediatamente; refrigerar
P(A), Metal dissolvido – filtrar
Metais (Fe) 500 6 meses / 6 meses
V(A) imediatamente; HNO3 até pH < 2
Nitrogênio
Kjeldahl Total P, V 500 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 7 d / 28 d
Nitrato + Nitrito P, V 200 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 48 h / 48 h
Oxigênio
V 300 Analisar imediatamente 8h/8h
dissolvido
pH P, V 50 Analisar imediatamente 2h
Sólidos P, V 200 Refrigerar 7d
Sólidos
1000
sedimentáveis
Turbidez P, V 100 Refrigerar 24 h / 48 h
1
Frasco: P – plástico (polietileno ou equivalente); V – vidro; P(A) ou V(A) – enxaguado com HNO3 50%; V(B)
– borossilicato
2
Refrigerar = estocar a 4ºC, no escuro
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I - SÓLIDOS
2- INTERFERÊNCIAS
Águas com concentrações elevadas de cálcio, magnésio, cloreto e/ou sulfato são higroscópicas e,
portanto, devem ser submetidas a secagem prolongada e pesagem rápida. Material flutuante ou
submerso não-homogêneo pode ser retirado da amostra antes da análise de sólidos, se desejado. Óleos
e graxas flutuantes devem ser dispersos em liquidificador antes da análise. Amostras contendo altas
concentrações de bicarbonato dissolvido podem necessitar de secagem a 180C, para garantir a
conversão completa de bicarbonato a carbonato. O peso total do resíduo seco deve ser menor que 200
mg, para evitar a formação de crostas que impedem a evaporação da água.
4- MATERIAL
Aparato de filtração a vácuo
Balança analítica
Banho-maria
Cadinhos de porcelana com capacidade de 100 mL
Cone Imhoff
Dessecador provido de dessecante com indicador de umidade
Estufas de secagem, uma a 103-105C e a outra a 180±2C
Filtros de fibra de vidro, sem resina ligante e com poro < 2μm (tipo Whatman 934AH, Gelman
A/E, Millipore AP40, ou equivalente)
Mufla a 550C
Provetas de 100 mL
Pipetas de 10 mL
5- METODOLOGIA
Secar filtros de fibra de vidro a por uma hora a 103-105C e calcinar cadinhos de porcelana a
550C por 20 min. Manter filtros e cadinhos em dessecador e pesá-los logo antes do uso. Pesar
imediatamente antes do uso.
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5.1. Sólidos totais (ST)
Transferir um volume conhecido da amostra bem homogeneizada para um cadinho calcinado e
previamente pesado. Escolher um volume de amostra que fornecerá de 10 a 200 mg de resíduo
seco. Evaporar a amostra em banho-maria. Se necessário, adicionar alíquotas sucessivas da
amostra ao mesmo cadinho após a evaporação. Levar o cadinho até a estufa a 103-105ºC e secar
até peso constante (diferença de peso entre pesagens sucessivas < 4 % ou 0,5 mg, o que for
menor). Réplicas devem apresentar valores que se diferem < 5 % de sua média.
Cálculo:
mg/L sólidos totais = (A – B) ,
volume amostra, L
Em análises expeditas, mas menos precisas, os sólidos dissolvidos podem ser determinados por
diferença entre os sólidos totais e em suspensão: mg/L SDT = ST – SST. Da mesma forma, em
amostras com poucos sólidos em suspensão, esses podem ser determinados paro diferença entre
sólidos totais e dissolvidos: mg/L SST = ST – SDT.
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II - TURBIDEZ
3- MATERIAL
Nefelômetro
Piseta com água destilada
Papel absorvente
4- REAGENTES
Padrão primário de turbidez
5- METODOLOGIA
5.1. Considerações gerais
Medir a turbidez imediatamente para evitar alteração de temperatura da amostra e floculação e
sedimentação de partículas.
Recomenda-se desgaseificar a amostra antes de se medir a turbidez. (A desgaseificação pode ser
efetuada pela aplicação de um vácuo parcial, de calor ou por ultra-sonografia).
Remover qualquer condensação nas paredes da cubeta antes de colocá-la no nefelômetro. Evitar
usar cubetas sujas ou arranhadas.
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III - COR
2-INTERFERÊNCIAS
Qualquer turbidez aumenta consideravelmente a cor verdadeira da amostra. A turbidez pode ser
eliminada pela centrifugação (30 min a 3000 rpm) ou filtração (membrana de 0,8 µm) da amostra. A
cor também aumenta com o pH, e o pH da amostra deve ser especificado. Para fins de pesquisa, deve-
se ajustar o pH das amostras para 7,6 antes de se prosseguir com as análises, ou analisar a cor numa
ampla faixa de valores de pH.
4- MATERIAL
Espectrofotômetro a 465 nm
Cubetas de vidro
Piseta com água destilada
Papel absorvente
6- METODOLOGIA
Medir o pH da amostra. Ajustar o pH a 7,6 pela adição de ácido sulfúrico (H2SO4) ou hidróxido de
sódio (NaOH), em concentração suficiente para evitar um aumento de mais de 3% no volume da
amostra.
Curva de calibração - Para a comparação espectrofotométrica, preparar uma série de pelo menos
cinco diluições em balões volumétricos, conforme segue (sugestão):
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mL solução padrão mL H2O
UH
estoque (500 UH) destilada
5 0,5 49,5
10 1,0 49,0
15 1,5 48,5
20 2,0 48,0
25 2,5 47,5
50 5,0 45,0
100 10,0 40,0
250 25,0 25,0
500 50,0 -
UH Precisão, unidades
1-50 1
51-100 5
101-250 10
251-500 20
15
IV - pH
2- INTERFÊNCIA
A temperatura afeta o pH de duas maneiras; o efeito mecânico resultante de alterações das propriedades
dos eletrodos e o efeito químico devido ao deslocamento do equilíbrio. Portanto, sempre reportar a
temperatura da amostra na hora de medir o pH. Muitos medidores de pH vêm equipados com um
compensador de temperatura para corrigir o pH para 25ºC.
4- MATERIAL
Medidor de pH equipado com eletrodos de vidro e de referência
Piseta com água destilada
Papel absorvente
Béqueres de 100 mL
5- REAGENTES
Soluções de tampões-padrão (pH 4, 7 e 10)
6- METODOLOGIA
Seguir o manual de instruções do medidor de pH e de armazenagem e preparo dos eletrodos.
O medidor de pH é calibrado utilizando as soluções de tampões-padrão, na faixa de pH desejada.
Geralmente existem dois controles: o do coeficiente linear e o do coeficiente angular do medidor.
O controle do coeficiente linear desloca a curva de resposta lateralmente para cruzar o ponto
isopotencial (0 mV), sem modificar a inclinação, e é ajustado com o tampão padrão pH 7,0. O
controle do coeficiente angular gira a curva emf/pH ao redor do ponto isopotencial e é ajustado
com tampão padrão ácido (ex. pH 4,0) ou alcalino (ex. pH 10,0). Após a calibração, o medidor
indicará a mudança correta de mV por unidades de pH na temperatura do ensaio.
Para calibrar o aparelho, enxaguar o eletrodo combinado com água destilada em excesso, secar com
papel absorvente e imergi-los na solução tampão padrão pH 7,0. Deixar equilibrar e ajustar o
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controle do coeficiente linear. Remover o eletrodo, enxaguá-lo com água destilada em excesso,
secar com papel absorvente e imergi-los na solução tampão pH 4,0 ou 10,0. Deixar equilibrar, e
ajustar o controle do coeficiente angular. Repetir o ajuste de controles até que a leitura do aparelho
acusa uma diferença menor que ± 0,1 unidade de pH do valor da solução tampão.
Leitura da amostra: Imergir o eletrodo limpo e seco na amostra e deixar equilibrar por
aproximadamente um minuto e depois ler o pH. Deve-se manter a amostra sob agitação suave para
garantir sua homogeneidade.
Reportar o valor de pH até uma casa decimal (0,1 unidade).
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V - ALCALINIDADE
A: OH- + H+ H2O
B: CO32- + H+ HCO3-
C: HCO3- + H+ H2CO3
ponto de
8,3 inflexão
pH
4,5
A B C
0
mL ácido
Figura 1 - Curva de titulação para uma mistura hidróxido-carbonato (Sawyer et al. 2003).
3- MATERIAL
Pipeta volumétrica de 100 mL
Erlenmeyer de 250 mL
Bureta de 25 mL ou 50 mL
Béquer de 50 mL
5- METODOLOGIA
Pipetar 100 mL da amostra, transferir para um erlenmeyer de 250 mL e adicionar 3 a 5 gotas de
fenolftaleína.
Caso a amostra apresente coloração rósea, a mesma deve ser titulada com H2SO4 0,02N até a
descoloração. Anotar o volume gasto de ácido como “F”.
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Adicionar a seguir 3 a 5 gotas de verde de bromocresol e seguir com a titulação até o ponto de
viragem da cor azul para uma cor esverdeada. Anotar o volume gasto como “B”. Deve-se analisar
uma prova em branco (usando água destilada e indicador), adicionando H2SO4 0,02N até o ponto
de viragem, para servir como controle.
Anotar o volume total de H2SO4 0,02N gasto nas duas titulações como “T”. Logo:
Cálculo:
Uma estimativa da proporção das diferentes formas de alcalinidade presentes numa amostra pode ser
obtida diretamente da determinação de alcalinidade, conforme descrita a seguir:
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VI - DUREZA, CÁLCIO E MAGNÉSIO
Para análises de rotina, utiliza-se o método volumétrico, no qual uma solução do ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) ou seu sal dissódico (Na 2EDTA) é utilizada como solução titulante.
O EDTA forma um complexo extremamente estável, quando adicionado a certos cátions, especialmente
o Ca2+ e Mg2+, conforme a reação:
O2N
O2N
O cálcio é então determinado pela titulação com EDTA, usando como indicador a murexida:
H O O H H O O H
N N N N
N O Ca2+ N O
+ Ca2+
N N N N
H O O- H O O-
NH4+ NH4+
Murexida Complexo [murexida-Ca2+]
púrpura rosa
A dureza magnésio é obtida pela diferença entre a dureza total e a dureza cálcio. Em virtude do alto pH
com que se trabalha, é recomendável que o tempo de titulação não ultrapasse cinco minutos, a fim de
diminuir o erro por perda de CaCO3 por precipitação.
2- INTERFERÊNCIA
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Alguns íons metálicos dificultam a observação do ponto de viragem da titulação. Essa interferência pode
ser minimizada acrescentando inibidores apropriados antes da titulação da amostra. Para a maioria das
águas de abastecimento o uso de inibidores é desnecessário.
4- MATERIAL
Béquer 50 mL
Pipetas 50 mL, 2 mL
Bureta 25 mL e suporte
Erlenmeyers 250 mL
Piseta de água destilada
6- METODOLOGIA
6.1. Dureza total
Pipete 50 mL da amostra e transfira para um erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 mL de solução
tampão NH4Cl/NH4OH e cerca de 0,05 g do indicador Erio.T.
Titule lentamente com a solução padronizada de EDTA 0,02N até que a cor vermelha desapareça
e surja uma cor azul persistente por 30 s.
Obs.: Deve-se ter o cuidado de adicionar as últimas gotas da solução titulante em intervalos de 3 a 5 s.
A titulação não deve demorar mais que 5 min, a partir do momento que se adiciona a solução tampão.
Cálculo:
Dureza total, mg/L CaCO3 = V titulante (mL) x 0,02N x FC x 50.000 mg/eq CaCO3
V amostra (mL)
6.2. Dureza Cálcio e Magnésio
Pipete 50 mL da amostra e transfira para um erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 mL de NaOH 1,0
M e cerca de 0,05g do indicador sólido murexida.
Titule lentamente com a solução padronizada de EDTA 0,02N até que a cor rosa desapareça e surja
a cor púrpura (violeta) persistente por 30 s.
Obs.: Em face do pH elevado usado neste método, é imperativo titular imediatamente após a adição
do hidróxido de sódio, para evitar precipitação de CaCO3.
Cálculos:
Dureza cálcio, mg/L CaCO3 = V EDTA (mL) x 0,02N x FC x 50.000 mg CaCO3/eq ,
V amostra (mL)
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VII - CONDUTIVIDADE
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO
A condutância (G) de uma solução, a recíproca de sua resistência (R), é medida entre dois eletrodos,
quimicamente inertes, e separados por uma distância fixa:
G = k (A/L),
2- MATERIAL
Célula de condutividade
Béqueres de 100 mL
Piseta com água destilada
Papel absorvente
4- METODOLOGIA
Seguir as instruções da célula de condutividade para a leitura da solução padrão. A célula de
condutividade deve ser lavada com água destilada e seca com papel macio e absorvente, sempre
que imerso em uma solução diferente.
A calibração deve ser realizada sempre ao se iniciar o trabalho.
Após a calibração, ler a condutividade das amostras, lavando a célula com água destilada após cada
amostra.
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VIII - CLORETOS
Não havendo mais cloreto, o AgNO3 passa a reagir com K2CrO4 (cor amarela) formando o precipitado
avermelhado cromato de prata (Ag2CrO4), indicando o ponto final da titulação:
Deve-se realizar uma prova em branco para corrigir possíveis erros na determinação do ponto de
viragem, devido à possível contaminação da água destilada usada para a lavagem das vidrarias e preparo
de reagentes.
2- INTERFERÊNCIA
As substâncias normalmente encontradas em águas potáveis não causam interferência. Brometo, iodeto
e cianeto são quantificados como cloreto. O nitrato de prata reage preferencialmente com os sulfetos
presentes na amostra, formando um precipitado preto (Ag 2S):
Utiliza-se o H2O2, que reage com os sulfetos em meio básico, para eliminar esta interferência:
Os produtos dessa reação se dissolvem no meio e estabilizam a reação. Posteriormente, faz-se necessária
a correção do pH do meio, que deve estar entre 6,5 e 10,5.
Em meio ácido, o cromato de potássio reagirá com o H + presente na amostra e dará origem ao cromato
ácido que não atua como indicador:
CrO42- + H+ (HCrO4)-
Em meio básico a prata reagirá preferencialmente com o OH- presente na amostra e dará origem ao
hidróxido de prata de acordo com a reação:
Quando a amostra apresentar cor e turbidez que podem interferir de modo a não se conseguir detectar o
ponto de viragem, adiciona-se uma suspensão de Al(OH)3, que é posteriormente removido por de
filtração.
O ortofosfato em concentração maior que 25 mg/L precipita como fosfato de prata. Ferro em
concentração maior que 10 mg/L pode mascarar o ponto final da titulação.
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4- MATERIAL
Bastão de vidro
Béquer 250 mL
Bureta 25 mL
Erlenmeyer 250 mL
Funil
Papel de filtro
Pipeta volumétrica 100 mL
Piseta com água destilada
6- METODOLOGIA
Caso a amostra apresente cor e/ou turbidez, adicionar 3 mL da suspensão de hidróxido de alumínio
para cada 100 mL da amostra, agitar vigorosamente e filtrar.
Transferir 100 mL da amostra clarificada para um béquer de 250 mL.
Gotejar 3 a 4 gotas de fenolftaleína e adicionar NaOH 0,1N até ligeira coloração rósea. Adicionar
1 mL de H2O2 30% e agitar.
Ajustar o pH da amostra para uma faixa de 6,5 a 10,5 usando NaOH 0,1N ou H2SO4 0,1N (gotejar
NaOH 0,1N até ligeira coloração rósea e a seguir H2SO4 0,1N até o descoramento).
Adicionar 1 mL de cromato de potássio e titular com a solução de AgNO 3 0,0141N até que surja a
primeira cor avermelhada persistente.
Analisar uma prova em branco (100 mL de água destilada mais indicador).
Cálculo:
mg/L Cl- = (A – B) x 0,0141N x FC x 35.450 mg/eq Cl-,
mL amostra
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IX - FERRO TOTAL
N N
+ Fe+2
N N N Fe+2 N
1,10-fenantrolina
N N
Complexo vermelho-alaranjado
2- INTERFERÊNCIA
A adição de um excesso de fenantrolina elimina a interferência causada por agentes oxidantes fortes (ex.
cianeto, nitrito, cromo, zinco). Alguns metais (bismuto, cádmio, mercúrio, molibdênio e prata)
precipitam a fenantrolina, e devem ser eliminados pela extração da amostra. Se houver presença de uma
quantidade grande de matéria orgânica ou cor, a mesma deve ser removida pela evaporação e
mineralização da amostra, seguido de sua re-solubilização em solução ácida.
4- MATERIAL
Chapa aquecedora
Espectrofotômetro (510nm)-
Erlenmeyers de 250 mL
Pipeta volumétrica de 50 mL
Balões volumétricos de 50 mL (com tampas)
Funis de vidro (com suporte)
Pipetas graduadas de 5 mL e 10 mL
Obs.: Toda vidraria que entrar em contato direto com a amostra deverá ser lavada com HCl 1:1 e
enxaguada várias vezes com água destilada.
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5- REAGENTES (veja preparo no Apêndice)
Solução padrão de ferro, preparo diário (1 mg/L; 1,00 mL = 1,00 µg Fe)
Ácido clorídrico concentrado (HCl)
Solução de hidroxilamina, 10% (NH2OH.HCl)
Solução de 1,10-fenantrolina (C12H8N2.H2O)
Tampão acetato de amônio/ácido acético (NH4C2H3O2/CH3COOH)
6- METODOLOGIA
Curva padrão:
Preparar os padrões de ferro a partir da solução padrão (1 mg/L) conforme indicado a seguir:
mL solução padrão mL água
mg/LFe
(1 mg/L Fe) destilada
0,0 0,0 50
0,1 5,0 45
0,2 10,0 40
0,3 15,0 35
0,4 20,0 30
0,5 25,0 25
Transferir os padrões para erlenmeyers e seguir a mesma metodologia descrita para as amostras.
26
X - NITROGÊNIO KJELDAHL TOTAL
O borato de amônio é quantificado por titulação com ácido sulfúrico (H 2SO4) 0,02N quando a
concentração de nitrogênio presente na amostra excede 2 mg/L.
2- INTERFERÊNCIA
Glicina, uréia, ácido glutâmico, cianatos e acetamida hidrolisam muito lentamente em solução, mas uréia
e cianatos serão hidrolisados durante a destilação a pH 9,5. Compostos voláteis alcalinos, como
hidrazinas e aminas influenciarão os resultados titulométricos. Cloro residual pode reagir com amônia
e deve ser removido mediante tratamento com um agente redutor, como Na2S2O3.
27
4.2. REAGENTES (veja preparo no Apêndice)
Tampão borato (pH 9,5)
Solução de hidróxido de sódio/tiossulfato de sódio (NaOH/Na2S2O3)
Solução digestora (K2SO4, CuSO4 e H2SO4)
Ácido sulfúrico 0,04N
Solução de ácido bórico e indicador
Solução titulante de ácido sulfúrico 0,02N, padronizada
4.3. METODOLOGIA
Selecionar o volume da amostra com base na quantidade de NKT esperado, conforme segue:
Nitrogênio orgânico
Transferir uma alíquota da amostra (se necessário diluir para 300 mL e neutralizar o pH) para um
balão kjeldahl e adicionar 50 mL da solução digestora. Levar a mistura à ebulição até que o volume
seja reduzido a 25-50 mL. Fazer uma prova em branco com água destilada.
Após o resfriamento da amostra digerida (a ponto de se manusear), conectar o balão ao destilador.
Adicionar 50 mL de solução de NaOH/Na2S2O3 ao copo dosador e 50 mL da solução de ácido
bórico/indicador em um erlenmeyer de 250 mL conectando-o ao condensador. Abrir a torneira do
copo dosador e ligar o aquecimento (verificar sempre o volume de água da caldeira). Enxaguar o
copo dosador com uma pequena alíquota de água destilada e fechar a torneira.
Destilar aproximadamente 250 mL e titular o conteúdo do erlenmeyer utilizando-se uma solução
de H2SO4 0,02N até que a solução verde do erlenmeyer tornar-se violeta.
Proceder com o cálculo de NKT da mesma forma que o de nitrogênio amoniacal. O nitrogênio
orgânico é determinado como a diferença entre o total e o amoniacal:
Norg = NKT – N-NH4+
28
XI - FÓSFORO TOTAL
A concentração mínima detectada pelo método colorimétrico utilizando cloreto estanoso é de 0,003 mg
P/L.
3- MATERIAL
Chapa aquecedora
Espectrofotômetro (690nm)
Pipetas volumétricas de 1 mL e 10 mL
Balões volumétricos de 100 mL (com tampa)
Erlenmeyers de 250 mL
Funis de vidro (com suportes)
Obs.: Toda vidraria que entrar em contato direto com a amostra deverá ser lavada com HCl 1:1 e
enxaguada várias vezes com água destilada. Não se deve usar detergente para a lavagem da
vidraria destinada a análise de fósforo.
5- METODOLOGIA
Procedimento com as amostras
Selecionar o volume de amostra em função da concentração de fósforo esperada, conforme segue:
29
Digestão ácida: Transferir uma alíquota da amostra para um erlenmeyer, adicionar 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado e 5 mL de ácido nítrico concentrado. Levar a ebulição em chapa de
aquecimento (em capela de exaustão) até o desprendimento de fumaças brancas (secura).
Após o resfriamento adicionar aproximadamente 20 mL de água destilada e uma gota de
fenolftaleína. Na seqüência, adicionar NaOH 6N, gota a gota, até o aparecimento de uma coloração
rósea. Descorar a solução com gotas de solução de ácido sulfúrico/nítrico. É importante que esta
viragem ocorra com a adição de uma única gota de ácido.
Usando funil, transferir quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 100 mL
adicionando água destilada até um volume de aproximadamente 80 mL. Adicionar em cada balão 4
mL de solução de molibdato de amônio e 0,5 mL de cloreto estanoso, agitando vigorosamente após
cada adição. Completar o volume do balão até a marca de aferição.
Fazer a leitura em espectrofotômetro a 690nm após 10 min (mas antes de 12 min), nos mesmos
intervalos de tempos para amostras e padrões. Calcular o fósforo na amostra por comparação com
a curva de calibração.
Curva de calibração
Preparar os padrões de fósforo utilizando-se da solução padrão (2,5mg/L P) conforme os valores
mostrados a seguir:
mL da solução mL H2O
mg/L P
padrão (2,5 mg/L) destilada
0,0(branco) 0,0 100
0,05 2,0 98,0
0,15 6,0 94,0
0,25 10,0 90,0
0,35 14,0 86,0
0,45 18,0 82,0
0,55 22,0 78,0
Transferir os padrões para erlenmeyers e seguir a mesma metodologia descrita para as amostras.
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XII - CLOROFILA a
3- MATERIAL
Espectrofotômetro (664, 665 e 750 nm)
Tubos de centrífuga com tampas rosqueáveis
Cubetas de vidro, largura 1 cm ou 5 cm (para amostras muito diluídas)
Banho-maria a 75ºC
Membranas de fibra de vidro com poro < 1,2 m
Aparato de filtração e bomba a vácuo
Proveta de 100 mL
Pipeta de 0,05 mL
5- METODOLOGIA
Extração da clorofila a
Realizar o procedimento em ambiente com luz indireta e de baixa intensidade, uma vez que a luz
induz a degradação rápida de clorofila a. Todos os recipientes de amostras devem ser opacos ou
envolvidos em papel de alumínio.
Após anotar o volume inicial da amostra, concentrar a fitoplâncton por filtração (filtro de fibra de
vidro, Millipore AP40 ou equivalente). Filtrar de modo contínuo e não permitir que o filtro seque
durante a filtração de uma amostra. Os filtros devem ser acondicionados individualmente em sacos
(dobrar filtros ao meio, com as células por dentro), ou placas de Petri, identificados e estocados a
-20ºC no escuro até extraí-las.
Transferir o filtro de fibra de vidro para um tubo de centrífuga envolvido em papel de alumínio e
contendo 10 mL de acetona 90%, previamente aquecido a 75ºC. Colocar o tubo com filtro em banho-
maria a 75ºC por 5 min; transferir para um banho de gelo e deixar por mais 5 min, par promover um
choque térmico que degradará a parede/membrana celular do fitoplâncton. Macerar o filtro com
bastão de vidro ou picar com tesoura lavada com acetona. Deixar em repouso a 4ºC por 6 a 24 para
completar a extração da clorofila. Agitar pelo menos duas vezes durante esse período.
Centrifugar em tubos fechados a 500g por 20 min para sedimentar o filtro. O extrato pode também
ser clarificado por filtração, forçando 1 a 2 mL de ar através do filtro após passagem do extrato
para minimizar a retenção do extrato no filtro.
31
Transferir 3 mL do extrato para uma cubeta de vidro e proceder com as leituras no
espectrofotômetro.
Leitura no espectrofotômetro
Ler a absorbância a 664 e 750 nm (A664, A750), zerando o espectrofotômetro com água destilada,
antes de realizar as leituras em cada comprimento de onda.
Adicionar 0,1 mL de HCl 0,1 mol/L ao extrato e agitar suavemente por 1 min. Ler a A665 e A750,
90s após a adição do HCl. (Lembrar de zerar o espectrofotômetro com água destilada). A
acidificação da amostra libera o íon de magnésio na clorofila a, que é transformada assim em
feoftina a.
Cálculos
Fazer a correção da turbidez, subtraindo os valores de absorbância a 750 nm (A750) dos valores de
absorbância a 664 e 665 nm (A664, A665), para calcular clorofila a e feofitina a:
32
33
XIII - COLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES e Escherichia coli
N(CH 3 )2
+ produto vermelho
N
H CHO
indol p-dimetilaminobenzadeído
reagente de Kovacs
Para facilitar as análises foram desenvolvidos testes cromogênicos para a detecção de coliformes totais
e E. coli. Os testes cromogênicos se baseiam no uso de substratos para enzimas encontradas nos grupos
de interesse. Cada substrato é acoplado a um radical cromogênico ou fluorogênico. Assim, quando a
enzima bacteriana hidrolisa o substrato, um produto colorido ou fluorescente é liberado. Os produtos
coloridos são visíveis ao olho nu, enquanto os produtos fluorescentes só são detectados sob luz
ultravioleta (366 nm). Para os coliformes totais, utiliza-se o β-galactopiranosídeo, substrato da enzima
β-D-galactosidase. Radicais cromogênicos utilizados com o β-galactopiranosídeo incluem o
ortonitrofenil- (ONP) e o 5-bromo-4-cloro-3-indolil- (x-GAL). Para a detecção da E. coli, utiliza-se o
β-glicuronida, substrato da enzima β-D-glicuronidase, acoplado ao radical fluorogênico 4-
metilumbeliferil- (MUG):
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COOH
O OH
OH
HO
CH 3 OH
ácido glicurônico
-glicuronidase
COOH
O +
O O
O
OH CH 3
HO
OH
4-metilumbeliferil--D-glicuronida (MUG)
O
O
HO
4-metilumbeliferil
produto fluorescente
2- INTERFERÊNCIAS
Amostras contendo grande quantidade de material coloidal ou de sólidos em suspensão (ex. manganês,
flocos de alumina, argila ou algas) podem entupir os poros da membrana e dificultar ou impedir a
filtração. Amostras industriais podem conter metais pesados que absorvam na superfície da membrana
e interferem com o crescimento bacteriano. A técnica de membrana filtrante não deve ser utilizada para
tais amostras.
4- MATERIAL
Geral
Incubadoras ou banhos-maria a 35ºC e a 44,5ºC
Autoclave
Bico de Bunsen
Tubos de ensaio com tampas, para preparar diluições seriadas
Pipetas estéreis – 1, 10 mL
Placas de Petri estéreis
Método NMP
Tubos de cultivo com tampas, contendo tubos de Durham invertidos
Suporte para tubos de cultivo
Alça de repicagem
Método da Membrana Filtrante
Pinça metálica com pontas arredondadas, imersa em etanol 70%
Unidade de filtração com membrana estéril
Kitassato para acoplar à unidade de filtração
Bomba a vácuo e frasco armadilha com mangueiras adequadas
Membranas de filtração reticuladas, estéreis (poros 0,45m)
Filtros absorventes (se meio líquido for usado)
Provetas 50, 100 mL, tampadas com papel de alumínio
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5- REAGENTES (veja preparo no Apêndice)
Meios de cultivo
Tampão fosfato estoque
Solução de cloreto de magnésio (MgCl2
Água de diluição tamponada
6- METODOLOGIA
6.1. Técnica da membrana filtrante
Preparo de vidraria e unidade de filtração
Esterilizar a unidade de filtração, kitassato, provetas, pipetas, e placas de Petri
Montar a unidade de filtração evitando sua contaminação (i.e. deixar as partes abertas tampadas
com papel de alumínio até serem encaixadas no seu lugar).
Identificar as placas de Petri estéreis (amostra, volume filtrado).
O procedimento pode ser feito com meio líquido (caldo) ou sólido (agar). Para a quantificação de
coliformes totais, utilizar meio M-Endo. Para a quantificação de coliformes termotolerantes, utilizar
o meio M-FC.
Se utilizar o meio líquido, colocar filtros absorventes estéreis no fundo de cada placa de Petri e
pipetar dois mL do caldo no filtro de forma a saturá-lo, utilizando técnica asséptica. Se utilizar o
meio sólido, preparar o ágar, pela adição de 15 g de ágar por litro de caldo. Deixar resfriar e verter
o ágar nas placas de Petri, até uma profundidade de 2 a 3 mm e deixar solidificar.
Filtração e incubação
Por meio da pinça estéril (flambada), colocar uma membrana estéril no suporte com a retícula para
cima e conectar o funil à base da unidade de filtração.
Agitar a amostra e medir o volume desejado, que dependerá do tipo de amostra. O Quadro 1 lista
os volumes sugeridos para amostras de diferentes origens. Para volumes pequenas, preparar
diluições da amostra original em água de diluição tamponada, de modo a ter um volume mínimo de
10 mL para filtrar.
Ligar a bomba a vácuo e filtrar a amostra. Manter o vácuo ligado e enxaguar as laterais do funil um
mínimo de duas vezes com 20 a 30 mL de água de diluição estéril.
Desligar a bomba a e remover o funil da base. Assepticamente (com pinça flambada), retirar a
membrana da base e colocá-la no filtro absorvente, ou meio ágar, evitando a formação de bolhas
entre a membrana e o meio. Reassentar a membrana, deslizando a sobre a superfície se houver
presença de bolhas.
Incluir como controles negativos uma membrana sem amostra e um branco da água de diluição
(filtrar 100 mL da água).
Preparar duplicatas de cada diluição de cada amostra.
Inverter as placas e incubar a 35ºC por 24 h.
Repicar pelo menos 10 colônias vermelhas com metálico para tubos contendo caldo bile lactose
verde brilhante para coliformes totais, ou a 44,5ºC por 24h para coliformes termotolerantes.
36
Contagem e interpretação dos resultados
Após a incubação, contar as UFC nas membranas contendo de 20 a 80 colônias róseas a vermelhas
escuras e com brilho metálico (os coliformes), mas com menos que 200 colônias bacterianas totais.
Reportar como:
37
Teste confirmativo
Agitar, cuidadosamente, cada tubo positivo do teste presuntivo. Com uma alça de repicagem estéril,
transferir um pouco da cultura de cada tubo para tubos contendo caldo Esse meio contém agentes
seletivos e inibidores que suprimem o crescimento de todas as bactérias não coliformes. Transferir
também um pouco da cultura de cada tubo positivo para tubos contendo água triptonada. Esse meio
contém triptofano e o indicador de Kovacs, para acusar a formação de indol.
Após 24 ou 48 h, examinar os tubos para a produção de gás (caldos bile lactose verde brilhante e
EC) e indol (água triptonada).
Em geral, a análise termina após o teste confirmativo, mas deve-se confirmar aproximadamente 5%
dos testes confirmativos para coliformes totais pelo teste completo.
Teste completo
Assepticamente, inocular placas contendo ágar Eosina Metileno Azul (EMB) com as culturas nos
tubos positivos do teste confirmativo, fazendo estrias com a alça de repicagem. Incubar a 35C por
24 h.
Colônias de coliformes são róseas a vermelhas escuras e apresentam um brilho metálico verde
superficial. De cada placa repicar dez colônias típicas e transferir para tubos inclinados contendo
ágar nutriente.
Examinar microscopicamente lâminas após coloração de Gram de culturas dos tubos de ágar
nutriente após 24 h de crescimento. O resultado positivo para o teste completo para coliformes totais
é a presença de bastonetes Gram-negativos.
A Figura 2 apresenta um fluxograma completo da técnica NMP para coliformes totais e termotolerantes.
Teste Cromogênico
Substratos cromogênicos podem ser utilizados para a determinação de coliformes totais e E. coli
pelas duas técnicas descritas, membrana filtrante e número mais provável (NMP). Alguns meios
cromogênicos comerciais estão disponíveis em diferentes formatos. Em alguns, uma quantidade
adequada de meio vem dentro do recipiente (frasco, tubo ou bolsa) estéril, a qual se adiciona o
volume indicado da amostra. Em outros, prepara-se o meio cromogênico e distribui-o nos frascos
ou tubos contendo o volume adequado da amostra. Siga as instruções do fabricante para preparar as
diluições da amostra a serem utilizadas.
A presença de coliformes totais é determinada pela atividade da enzima B-galactosidase, sendo
evidenciada pela cor amarela (ex. COLILERT da IDEXX), quando o substrato é o ONPG, e azul
esverdeada (ex. Fluorocult-LMX da Merck) quando o substrato é o x-GAL.
A presença de E. coli é determinada pela atividade da enzima B-glicuronidase, sendo evidenciada
pela fluorescência azul do meio ou das colônias, quando o frasco, tubo ou placa é exposto à luz
ultravioleta (366 nm).
38
Quadro 2 - Quantificação estatística de coliformes: número mais provável por 100 mL
0-:1-:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP
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Amostra
Transferir alçada de culturas para Transferir alçada de culturas para Transferir para caldo triptonado.
tubos contendo caldo bile lactose tubos contendo caldo EC. Incubar 242h a 44,50,2ºC
verde brilhante. Incubar 48 3h, Incubar 24 h, 44,5oC
350,5oC
Verificar presença de
bastonetes Gram-negativos
no microscópio
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XIV - CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS
1- PRINCIPIO DO MÉTODO
Colônias originam a partir de células individuais, filamentos, ou aglomerados de células, sendo todos
esses contemplados pelo termo unidade formadora de colônias (UFC). Duas técnicas de enumeração das
UFC existem: a técnica de mistura (“pour plate”) e a de espalhamento (“spread plate”) em placa. Na
técnica de mistura, uma alíquota da amostra ou sua diluição é transferida para uma placa de Petri estéril,
o meio ágar fundido (44 a 46ºC) é adicionado, resfriado e solidificado. Na técnica por espalhamento,
0,1 a 0,5 mL da amostra ou sua diluição é transferida para a superfície de uma placa contendo o meio
ágar solidificado. O inóculo é espalhado uniformemente sobre a superfície por meio de uma alça de
vidro estéril. Nos dois casos, a placa é então incubada sob condições controladas e as UFCs contadas.
A técnica de mistura é mais simples e permite incluir alíquotas maiores de amostra na placa, mas as
bactérias são submetidas a um choque térmico que pode afetar seu crescimento. A técnica de
espalhamento não causa choque térmico e, uma vez que as colônias crescem na superfície, permite sua
transferência de maneira simples e rápida, mas a alíquota da amostra plaqueada é limitada a um volume
de 0,1 a 0,5 mL.
3- MATERIAL
Autoclave
Incubadora que mantém a temperatura estável, a 35ºC
Placas de Petri estéreis
Pipetas estéreis, tipo bacteriológico ou de Mohr
Tubos de cultivo, 20 mL, estéreis
Bico de gás
Banho-maria a 44-46ºC para manter ágar fundido (técnica de mistura)
Alça de Drigalsky (técnica de espalhamento)
5- METODOLOGIA
O preparo das diluições e placas deve ser realizado utilizando técnica asséptica, dentro da capela
laminar, ou perto do bico de Bunsen aceso.
41
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Amostra
original
Tubos contendo 9
mL de água de
diluição tamponada
Contagem de UFC/mL
Contar colônias apenas nas placas que apresentam de 30 a 300 UFC. Calcular UFC/mL da amostra
pela equação:
Se nenhuma placa apresentar colônias, calcular as UFC/mL como menor que a menor diluição
plaqueada, e reportar como UFC/mL estimada. Por exemplo, se a menor diluição plaqueada for
de 10-2, e esta não apresentar colônias, o valor estimado é <100 UFC/mL.
42
XV - DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO (DBO) e OXIGÊNIO DISSOVIDO (OD)
1- PRINCÍPIO DOS MÉTODOS (OD pelo Método Winkler modificado pela azida)
A análise de DBO consiste em incubar as amostras em frascos especialmente utilizados para a DBO, à
temperatura de 20±1ºC no escuro por um período de cinco dias. No início e ao final do quinto dia mede-
se a concentração de oxigênio dissolvido (OD) presente na amostra e obtém-se por diferença, a demanda
requerida pelos microrganismos para a oxidação da matéria orgânica presente na amostra.
É possível converter valores de DBO obtidos sob condições de tempo e/ou temperatura diferentes das
do método padrão, assim como estimar a DBOúltima do 1º estágio, pelo uso de fatores de correção.
A quantificação de OD pelo método Winkler, ou método iodométrico, é baseado na adição de uma
solução de manganês reduzido (Mn2+) seguida de uma solução contendo uma solução alcalina de íons
iodeto(I-) e azida (N3-), o que resulta na produção de um hidróxido gelatinoso de manganês II.
Com a adição de ácido sulfúrico, o Mn4+ será reduzido e os íons iodeto oxidados, levando à liberação
de iodo (I2) na mesma proporção da concentração inicial de OD.
O iodo é então titulado com uma solução padronizada de tiossulfato de sódio, formando tetrationato de
sódio, utilizando amido como indicador da viragem.
A modificação pela azida tem como objetivo a eliminação da interferência provocada pelo nitrito (NO 2-
), possível de ser encontrado em esgotos e águas ribeirinhas. Os íons nitrito têm poder oxidante sobre
os íons iodeto e podem levar a superestimar a concentração final de OD.
3- MATERIAL
Bomba de ar comprimido
Estufa incubadora para DBO
Medidor de pH
Proveta 100 mL
Béqueres de 100, 500 mL
Frascos de DBO
Pipeta volumétrica de 100 mL
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Erlenmeyer de 250 mL
Pipeta graduada de 2, 5, 10 mL
Bureta de 10 ou 25 mL
5- METODOLOGIA
Preparo da amostra
Deve-se neutralizar amostras muito ácidas ou básicas pela adição de hidróxido de sódio (NaOH) ou
ácido sulfúrico (H2SO4). Deve-se ter o cuidado de não diluir a amostra em mais de 0,5% com a
neutralização.
Amostras contendo cloro residual devem ser tratadas com solução de sulfito de sódio (Na2SO3) para
a neutralização do cloro. O volume de Na 2SO3 de requerido para cada litro da amostra é obtido da
seguinte forma:
- A uma alíquota de 100 mL da amostra neutralizada, adicionar 10 mL de ácido acético 50% e 1 mL de
solução de iodeto de potássio 10% (p/v).
- Titular com solução de Na2SO3, utilizando a solução de amido como indicador.
- Desta forma: V (mL Na2SO3)/L (amostra) = mL Na2SO3 gastos na titulação x 10.
Limpeza de vidraria
Toda a vidraria utilizada na análise deve ser lavada com solução sulfocrômica e enxaguada com
água destilada para eliminar quaisquer traços de matéria orgânica.
Diluição
Diante do desconhecimento do teor de matéria orgânica presente em uma amostra, deve-se levar em
consideração a sua natureza tendo em vista que uma diluição inadequada da amostra pode provocar
um consumo total de oxigênio antes do quinto dia e no outro extremo, uma diluição exagerada pode
resultar em nenhum consumo de OD. Em ambos os casos o teste será inválido. Desta forma é
recomendável que, na medida do possível, reúnam-se informações prévias sobre o teor e a natureza
da matéria orgânica presente na amostra.
Deve-se trabalhar com diluições que ao final do quinto dia garantam no frasco um residual de
oxigênio dissolvido de no mínimo 1 mg/L e um consumo total de no mínimo 2 mg/L. Na ausência
de qualquer outro indicativo, as diluições no quadro a seguir servem como referência. É
recomendável preparar três diluições diferentes de amostras desconhecidas.
mL de amostra
Tipo de Efluente Diluição (%)
(em 300 mL)
Esgoto bruto 0,1 - 1,0 0,3 – 3
Esgoto primário 1–5 3 – 15
Esgoto tratado 5 – 25 15 – 75
Rios ou lagoas poluídas 25 – 100 75 – 150
44
Água de Diluição
As diluições devem ser feitas com água de diluição, preparada em volume determinado pelo número
de amostras, diluições e réplicas a serem analisadas. Borbulhe ar comprimido em volume adequado
de água destilada, por cerca de trinta minutos. Para cada litro de água, adicionar 1 das seguintes
soluções: CaCl2, FeCl3, MgSO4 e solução tampão fosfato. Devem-se esperar trinta min após o
término da aeração antes de se utilizar a água de diluição.
Amostras
Para cada amostra devem-se realizar duas leituras de oxigênio dissolvido (OD), sendo uma no
primeiro dia (OD0), e outra após o período de cinco dias em estufa incubadora a 20 ±1ºC (OD5). As
análises devem ser realizadas em duplicata. Portanto, será necessário preparar quatro frascos para
cada diluição de cada amostra (dois para OD0 e dois para OD5). Deve-se ter cuidado de se evitar a
formação de bolhas de ar durante o manuseio da amostra e água de diluição na hora de encher os
frascos e durante a execução da análise.
Deve-se ainda fazer uma prova em branco (apenas água de diluição) sendo a análise comprometida
em caso de a diferença entre OD0 e OD5 assumir valores maiores que 0,2 mg/L.
Por ser um bioensaio, o resultado da determinação de DBO sofre fortemente a influência da presença
de substâncias tóxicas ou de um inoculo bacteriano de baixa atividade. Portanto é aconselhável
verificar a qualidade da água de diluição, do inoculo de microrganismos e da técnica analítica
periodicamente. Isto pode ser feito pela análise de uma amostra com DBO conhecida. Uma solução
comumente utilizada para esta finalidade é a de glicose / ácido glutâmico 2%, cuja DBO é de 200 ±
30 mg/L.
isto é, 1 mL Na2S2O3 0,0125 N = 1 mg/L OD quando se titula uma alíquota de 100 mL da amostra.
Semeadura (Inóculo)
A presença de uma população de microrganismos capaz de oxidar a matéria orgânica biodegradável
na amostra é necessária, mas algumas amostras não contêm uma população microbiana suficiente
(ex. águas residuárias industriais de pH extremo, esgotos após a desinfecção). Neste caso, faz-se
necessário semear a água de diluição com um inóculo de microrganismos. De preferência, utiliza-
se um inóculo do sistema de tratamento biológico que trata o esgoto sendo analisado. Quanto este
não estiver disponível, pode se utilizar o sobrenadante de esgoto doméstico, decantado a
temperatura ambiente por 1 a 36 h.
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Alguns efluentes podem conter materiais mais recalcitrantes, que só são degradados por
microrganismos adaptados. Um inóculo adaptado pode ser preparado pela adição de alíquotas
incrementais do efluente a um volume de esgoto doméstico decantado e sob aeração contínua.
Existem também inóculos comerciais disponíveis. O volume do inoculo a adicionar a água de
diluição deve ser escolhido para que produza uma DBO entre 0,6 e 1,0 mg/L O2.
Deve-se determinar a DBO da água de diluição contendo o inoculo da mesma forma que as demais
amostras. Essa análise serve como de controle de inoculo (B).
Cálculos
Quando a DBO for determinada sob condições de tempo e/ou temperatura diferentes das do
método padrão, multiplicar pelo fator de correção apropriado (veja quadro a seguir) para
converter ao valor correspondente de DBO5,20.
46
XVI - DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO)
Para valores de DQO entre 100 e 900 mg/L, o aumento de Cr3+ na região de 600 nm é determinado. Para
valores de DQO abaixo de 100 mg/L, a diminuição de Cr2O72- a 420 nm pode é determinada. Dessa
forma, o cromato formado ou dicromato residual será quantificado colorimetricamente a 600nm ou 420
nm e comparado com uma curva padrão preparado a partir do padrão ftalato ácido de potássio.
Se a cor da amostra interferir na leitura de absorbância, o dicromato residual também pode ser
quantificado por titulação com sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH 4)2(SO4) 2]:
2- INTERFERÊNCIAS
Ácidos orgânicos voláteis alifáticos não são oxidados, a menos que se adicione sulfato de prata (Ag2SO4)
como catalisador. No entanto o Ag2SO4 reage, formando precipitados, na presença de cloreto, brometo
e iodeto. A interferência dos haletos pode ser minimizada mediante adição de sulfato de mercúrio
(HgSO4), como agente complexante.
Íons inorgânicos, na sua forma reduzida (ferro(II), sulfeto, manganês(II), etc.) são oxidados
quantitativamente pelo dicromato. Em amostras contendo quantidades significativas desses íons, deve-
se corrigir o resultado final, subtraindo o consumo de oxigênio devido a esses íons, assumindo sua
oxidação estequiométrica.
4- MATERIAL
Termoreator (150ºC)
Papel absorvente
Pipetas de 5 mL
Espectrofotômetro (c/ adaptação para tubos de 16mm e leitura a 600nm)
Tubos de ensaio de 16x100mm com tampas rosqueáveis
Erlenmeyer de 250 mL
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Solução padrão de ftalato ácido de potássio (HOOCC 6H4COOK), 1500 mg/L DQO
Solução digestora (K2Cr2O7 / H2SO4 / HgSO4) para faixa baixa (0-100 mg/L) ou alta (100-900 mg/L)
Solução de ácido sulfúrico / sulfato de prata (H2SO4 / Ag2SO4)
6- METODOLOGIA
Procedimento com as amostras
Homogeneizar a amostra e com o auxílio de uma pipeta, transferir 2,5 mL para o tubo de ensaio
(resultado da análise depende de uma boa homogeneização).
Adicionar 1,5 mL da solução digestora e, cuidadosamente, adicionar 3,5 mL da solução de ácido
sulfúrico / sulfato de prata.
Tampar o tubo, inverter algumas vezes para homogeneização. Cuidado - este procedimento produz
calor é deve ser realizado longe dos olhos. Limpar o tubo externamente com papel macio e
absorvente (tubos riscados produzem alterações nas leituras e devem ser descartados).
Inserir o tubo no termoreator mantido a 150 ± 2ºC por duas horas.
Resfriar o tubo à temperatura ambiente, inverter algumas vezes e esperar a sedimentação de
quaisquer sólidos. Efetuar a leitura em espectrofotômetro a 420 (faixa baixa) ou 600nm (faixa alta)
e comparar com a curva de calibração previamente preparada.
Curva padrão
Preparar, no mínimo, cinco padrões a partir da solução padrão de ftalato ácido de potássio para a
faixa de DQO desejada, de acordo com a tabela a seguir, e tratá-los da mesma forma que as amostras.
Preparar brancos (sem solução padrão), sem e com digestão. A 600 nm (faixa alta), zerar o
espectrofotômetro com o branco sem digestão e subtrair a DQO do branco após digestão da DQO
da amostra. A 420 nm (faixa baixa), zerar o espectrofotômetro com água destilada. Subtrair a
absorbância do branco digerido da absorbância de padrões e amostras.
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APÊNDICE - PREPARO DE REAGENTES
O preparo e a padronização dos reagentes necessários para a análise dos parâmetros citados nesta
apostila estão descritos neste apêndice, organizados por ordem alfabética do parâmetro.
ALCALINIDADE
Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1N - Colocar cerca de 500 mL de água destilada em balão volumétrico de
1000 mL. Deixar cair de uma pipeta, gota a gota, 2,8mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.
Resfriar, completar o volume e homogeneizar.
Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,02N - Transferir 200 mL da solução de H2SO4 0,1 N para um balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada.
Padronização do H2SO4: Transferir 20 mL de Na2CO3 0,02 N para um erlenmeyer de 250 mL, adicionar
3 gotas de alaranjado de metila. Titular com a solução de H2SO4, aproximadamente 0,02 N até o ponto
de viragem, caracterizado pelo aparecimento de uma coloração vermelha.
Solução de carbonato de sódio (Na 2CO3), 0,02N - Secar de 3 a 5g de carbonato de sódio (Na 2CO3) à
250ºC por quatro horas e resfriar em dessecador. Pesar exatamente 1,060g e dissolver em balão de 1000
mL. Completar o volume com água destilada e homogeneizar.
Solução indicadora de verde de bromocresol – Dissolver 100 mg do sal sódico de verde de bromocresol
em 100 mL de água destilada.
CLORETOS
Ácido sulfúrico 0,1N – Diluir 2,8 mL de H2SO4 concentrado a 1000 mL com água destilada.
Peróxido de hidrogênio (água oxigenada, H2O2), 30% - solução comercial (300 g H2O2 em 1000 mL)
Solução de nitrato de prata (AgNO3) 0,0141N, padronizada - Dissolver 2,395 g de AgNO3 em água
destilada e diluir a 1000 mL.
Padronização de AgNO3: Titular 20 mL da solução padrão de NaCl 0,0141M com AgNO3. Analisar
um corpo de prova em branco, contendo 20 mL de água destilada em vez de NaCl.
Normalidade de AgNO3 = FC x 0,0141 N.
Solução padrão de cloreto de sódio (NaCl) 0,0141 M (0,0141N) – Dissolver 824,0 mg NaCl,
previamente seco a 140ºC, em água destilada e diluir a 1000 mL. Um mL da solução padrão = 500 µg
Cl-.
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Solução indicadora de cromato de potássio - Dissolver 50 g K2CrO4 em água destilada. Adicionar
AgNO3 até formar um precipitado vermelho. Deixar em repouso por 12 h, filtrar e diluir a 1000 mL
com água destilada.
CLOROFILA a
Ácido clorídrico (HCl) 0,1N – Diluir 83 mL de HCl concentrado a 1000 mL com água destilada.
Etanol (EtOH) 80% - Diluir 80 mL de etanol absoluto ou 83,3 mL de etanol 96% a 100 mL com água
destilada.
COLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES e Escherichia coli
Meios de cultivo - meios desidratados disponíveis comercialmente devem ser utilizados para garantir
uniformidade de resultados. Siga as instruções do fabricante para a hidratação e esterilização dos meios.
Os meios podem estar na forma líquida (caldo) ou sólido (agar).
DIFCO Caldo M-Endo MF, BBL Caldo M-coliforme (MC), ou equivalente
DIFCO Caldo Laurel Tri ptose, BBL Caldo Laurel Sulfato, ou equivalente (caldo lactosado)
BBL Caldo Bile Lactose Verde Brilhante (BGLB), ou equivalente
DIFCO Meio EC, BBL Caldo EC, ou equivalente
Agar Eosina Metileno Azul (EMB)
Caldo triptonado com reagente de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído)
Tampão fosfato estoque – Adicionar 34 g KH2PO4 em 500 mL água destilada. Ajustar p pH 7,2 com
NaOH 1 N e completar a 1000 mL com água destilada. Esterilizar na autoclave por 15 min a 121º C.
Estocar na geladeira, e manusear assepticamente.
Água de diluição tamponada – Adicionar 1,25 mL do tampão fosfato estoque e 5,00 mL da solução de
MgCl2 e completar o volume a 1000 mL em balão volumétrico. Distribuir em frascos autoclaváveis,
esterilizar e estocar na geladeira. Manusear assepticamente.
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DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO / OXIGÊNIO DISSOLVIDO
Solução alcalina de iodeto-azida
Amostras saturadas ou insaturadas - Dissolver 500 g de NaOH (ou 700g de KOH) e 135 g de NaI (ou
150 g de KI) em água destilada e completar o volume para 1 L. Adicionar 10 g de azida sódica (NaN3)
dissolvidos em 40 mL de água destilada. Esta solução não deve ficar colorida na presença de amido
quando diluída e acidificada.
Amostras supersaturadas – Dissolver 10 g de NaN3 em 500 mL de água destilada. Adicionar 480 g de
NaOH e 750 g de NaI e agitar até dissolvidos. A solução ficará turva, devido à presença de carbonato
de sódio (Na2CO3), mas essa turbidez não interferirá na análise. Não acidificar esta solução para evitar
possível formação de gases tóxicos.
Solução de amido - Dissolver 2 g de amido solúvel e 0,2 g de ácido salicílico (conservante) em 100 mL
de água destilada quente.
Solução padrão de bi-iodato de potássio (KH(IO3)2) 0,00104M – Dissolver 0,4062 g de KH(IO 3)2 em
água destilada e diluir a 1 litro.
FC = 20 mL .
Vol Na2S2O3 (mL)
Solução tampão fosfato – Dissolver 8,5 g de KH2PO4, 21,75 g de K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4.7H2O e
1,7 g de NH4Cl em, aproximadamente, 500 mL de água destilada e completar o volume para 1 litro. O
pH deve ser 7,2, sem ajuste. Descartar a solução se apresentar sinais de crescimento biológico.
Solução de cloreto de cálcio (CaCl2) – Dissolver 27,5 g de CaCl2 em água destilada e completar o volume
para 1 L.
Solução de cloreto férrico (FeCl3) – Dissolver 0,25 g de FeCl3.6H2O em água destilada e completar o
volume para 1 L.
Solução de sulfito de sódio (Na2SO3) – Dissolver 1,575 g de Na2SO3 em 1000 mL de água destilada.
Esta solução é instável e deve ser preparada diariamente.
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DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO
Solução padrão de ftalato ácido de potássio (1500 mg/L DQO) - Dissolver 0,6375 g ftalato ácido de
potássio, previamente seco a 120ºC por uma hora, e diluir a 500 mL em balão volumétrico. A solução
é estável por 3 meses quando refrigerada, desde que não se observe crescimento biológico. (1 mg ftalato
ácido de potássio = 1,176 mg DQO). Para amostras com reduzido teor de DQO, diluir a solução padrão
1/10 (150 mg/L DQO) em água destilada antes de preparar a curva padrão.
Solução digestora
Faixa alta (100 a 900 mg/L) - A aproximadamente 500 mL de água destilada, adicionar 10,216 g de
dicromato de potássio (K2Cr2O7), previamente seco à 103ºC por duas horas; 167 mL de ácido sulfúrico
concentrado (H2SO4) e 33,3 g de sulfato de mercúrio (HgSO4). Dissolver, resfriar a temperatura
ambiente e diluir a 1000 mL em balão volumétrico.
Faixa baixa (0 a 900 mg/L) – Preparar conforme descrito anteriormente, mas usar apenas 1,022 g
K2Cr2O7.
Solução de ácido sulfúrico / sulfato de prata - Adicionar 2,53 g de sulfato de prata (Ag2SO4) a 250 mL
de ácido sulfúrico concentrado (H 2SO4). Deixar em repouso por 2 dias para total dissolução do Ag2SO4.
DUREZA
Solução de EDTA (Na2-EDTA) 0,01M (0,02N) - Pesar 3,723 g de sal dissódico do ácido
etilenodiaminotetracético (Na 2H2C10H12O8N2.2H2O), p.a., dissolver em água destilada, transferir para
um balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume até a marca de aferição.
FC = 20 mL ,
Volume EDTA gasto (mL)
Solução padrão de cálcio - CaCO3 0,01M (0,02N) - Pesar 1,000 g CaCO3 anidro, em pó, padrão, e
transferir para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar aos poucos, com auxílio de um funil, HCl 1:1 até
dissolver todo o CaCO3. Adicionar 200 mL de água destilada e ferver por alguns minutos para eliminar
CO2. Esfriar, adicionar algumas gotas de vermelho de metila, e ajustar à cor laranja intermediária, pela
adição de NH4OH 3 N ou HCl 1:1. Transferir toda a mistura para um balão de 1000 mL, e completar até
a marca com água destilada. 1,00 mL = 1,00 mg CaCO3.
Solução tampão cloreto de amônio/hidróxido de amônio (NH 4Cl/NH4OH) (pH 10 ± 0,1) - Dissolver
16,9g de cloreto de amônio (NH 4Cl) em 143 mL de hidróxido de amônio concentrado (NH 4OH).
Adicionar 1,179g de Na2EDTA e 0,780 g de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) [ou 0,644 g de cloreto
de magnésio (MgCl2.6H2O)] e diluir a 250 mL com água destilada. Guardar, preferencialmente, em
frasco de polietileno, bem fechado para impedir perda de NH 3 e entrada de CO2. Descartar o tampão se
a adição de 1-2 mL à amostra não eleva o pH a 10,0 ,0,1. A solução é estável por 30 dias quando em
frasco freqüentemente aberto.
Hidróxido de sódio (NaOH) 1,0N - Dissolver 10,5 g de NaOH em um béquer de 100 mL com água
destilada e transferir para um balão de 250 mL. Após o resfriamento completar o volume e
homogeneizar.
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Solução de hidróxido de amônio (NH4OH) 3N - Diluir 11,6 mL de hidróxido de amônio em água
destilada completando o volume para 100 mL em um balão volumétrico.
Indicador sólido negro de eriocromo T (Erio.T) - Misturar 0,5 g de negro de eriocromo com 100 g de
NaCl. Guardar em frasco bem fechado. Indicador deteriorado apresenta mudança de cor imprópria na
titulação.
Indicador sólido murexida - Misturar 0,5 g de negro de eriocromo com 100 g de NaCl. Guardar em
frasco bem fechado. Indicador deteriorado apresenta mudança de cor imprópria na titulação.
FERRO
Solução estoque de ferro (200 mg/L) - Adicionar lentamente 20 mL H2SO4 conc. a 50 mL de água
destilada e, em seguido, acrescentar 1,404 g sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH 4)2(SO4)2.6H2O].
Adicionar permanganato de potássio (KMnO4) 0,1 N por gotejamento até o aparecimento de uma cor
rosa clara persistente. Diluir a 1000 mL com água destilada. 1,00 mL = 200 µg Fe.
Solução padrão de ferro (1 mg/L), preparo diário - Pipetar 5,0 mL da solução estoque para um balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada. 1,00 mL = 1,00 µg Fe.
FÓSFORO
Solução de ácido sulfúrico/nítrico (solução ácida forte) – Adicionar lentamente 300 mL de H2SO4 a
aproximadamente 600 mL de água destilada. Deixar resfriar e adicionar 4,0 mL de HNO3 conc. e diluir
a 1000 mL.
Solução de cloreto estanoso – Dissolver 2,5 g SnCl2.2H2O em 100 mL glicerol. Aquecer em banho-
maria e agitar com bastão de vidro.
Solução estoque de fosfato – Dissolver 219,5 mg KH2PO4 anidro em água destilada e completar a 1000
mL: 1,00 mL = 50 µg PO43-
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Solução padrão de fosfato - Diluir 50,0 mL da solução estoque de fosfato a 1000 mL em água destilada:
1,00 mL = 2,5 µg PO43-
Tampão borato (pH 9,5) – Adicionar 88 mL de NaOH 0,1 N a 500 mL de tetraborato de sódio 0,025
M (Na2B4O7) e diluir a 1000 mL.
Solução digestora – Dissolver 134 g K2SO4 e 7,3 g CuSO4 em 800 mL água. Adicionar cuidadosamente,
134 mL H2SO4 conc. Deixar resfriar e diluir a 1000 mL. Misturar bem e estocar à temperatura de 20º C
para evitar cristalização.
Solução indicadora mista – Dissolver 200 mg vermelha de metila em 100 mL etanol 95%. Dissolver
100 mg de azul de metileno em 50 mL etanol 95%. Combinar as soluções. Preparar mensalmente.
pH
Soluções de tampões-padrão (tipicamente pH 4, 7 e 10) – disponíveis comercialmente.
TURBIDEZ
Solução I (sulfato de hidrazina) - Diluir 1,00 g de (NH2)2.H2SO4 em 100 mL de água destilada em balão
volumétrico. Atenção: Sulfato de hidrazina é um agente cancerígeno – evitar inalar, ingerir e contato
com a pele.
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