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Biología Celular y Molecular Departamento de Bioquímica

Enzimas !

Enzimas: Catalizadores biológicos!

La mayor parte de las reacciones biológicas no ocurrirían a tiempos compatibles con la vida, a no ser por la existencia de los catalizadores… !

!

¿Qué son las siguientes sustancias?!

1- Ácido acetilsalicílico (Aspirina) !

! 2- Penicilina (Ampicilina) ! ! 3- Oseltamivir (Tamiflu)! !
!
2- Penicilina (Ampicilina) !
!
3- Oseltamivir (Tamiflu)!
!

4- Enalapril !

1-

Ácido acetilsalicílico (Aspirina): inhibidor

de la enzima ciclooxigenasa que media la producción de prostaglandinas.

2- Penicilina (Ampicilina): inhibidor de una enzima transpeptidasa bacteriana que participa en la síntesis de la pared celular de las bacterias formada por peptidoglicanos.

3- Oseltamivir (Tamiflu): inhibidor de la enzima neuraminidasa del virus de la influenza, que participa en el corte de residuos de ácido síalico de la célula infectada para poder despegarse e infectar otra célula.

4- Enalapril: inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina que regula la presión arterial.

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

A. !Propiedades generales de las enzimas (I) !

A. ! Propiedades generales de las enzimas (I) !

1.Son los catalizadores de las reacciones químicas de los sistemas biológicos !

2.Tienen gran poder catalítico !

3.Poseen un elevado grado de especificidad de sustrato !

4.Funcionan en soluciones acuosas en condiciones suaves de pH y temperatura !

5.Su actividad puede ser regulada !

A. !Propiedades generales de las enzimas (II) !

A. ! Propiedades generales de las enzimas (II) !

6. !La mayoría de las enzimas son proteínas:!

La función depende de la integridad de la conformación proteica nativa !

Existen enzimas que son proteínas simples y otras que requieren componentes químicos adicionales:!

-

!Cofactores:

!- iones inorgánicos ! !- complejos orgánicos!

 

!!!coenzimas !

!!!grupos prostéticos !

Holoenzima / Apoenzima !

Las enzimas se clasifican según la reacción catalizada:!

Las enzimas se clasifican según la reacción catalizada: !

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

Orden y Velocidad de Reacción!

v = !

d [B]

dt!

ln !

[A]!

[A 0 ]!

A

Reacción ! v = ! d [B] d t ! l n ! [A] ! [A

B!

= mol . L -1. s -1 !

= s -1 constante de vel. !

v

k

- d [A] !

dt!

=! k[A]!

=!

[A]! = e ! - kt! [A 0 ]!
[A]!
= e ! - kt!
[A 0 ]!

=! - kt

à !

Vel. es proporcional a la [A]! Vel. de la reacción disminuye a medida que disminuye la [A]! [A] disminuye de manera exponencial con el tiempo!

Constante de Equilibrio! k 1 ! A B! k -1 ! - d [A]! k
Constante de Equilibrio!
k
1 !
A
B!
k
-1 !
- d [A]!
k
=! -k 1 [A] + k -1 [B]
dt!

1 y k -1 = s -1

-v = !

constantes de vel. !

0 = -k 1 [A] eq + k -1 [B] eq à [B] eq /[A] eq = k 1 /k -1 = Keq.

Como A se consume en la reacción hacia la derecha y se forma en la reacción hacia la izquierda à V = ! Este tipo de reacción ocurren hasta alcanzar el equilibrio quimico, en el cual la vel. de ambas reacciones es igual y la velocidad global es cero à ! La Keq. es la relación entre k 1 y k -1 y que relación de concentración de reactivos y productos existen una vez alcanzado el equilibrio !

Definición de constante de equilibrio y velocidad !

Definición de constante de equilibrio y velocidad ! Constante de Equilibrio ! A v = !

Constante de Equilibrio!

A

v = !

equilibrio y velocidad ! Constante de Equilibrio ! A v = ! P ! [P]eq !
equilibrio y velocidad ! Constante de Equilibrio ! A v = ! P ! [P]eq !

P!

[P]eq ! Keq. =! [A]eq !

d [P]

dt!

- d[A] !

=!

dt!

=! k[A]!

Velocidad:

k (de primer orden):

concentración/ tiempo tiempo -1

(µM/min) ! (min -1 ) !

Estados de transición y Velocidad de Reacción!

A

Estados de transición y Velocidad de Reacción ! A P ! G A! ∆G ! G
Estados de transición y Velocidad de Reacción ! A P ! G A! ∆G ! G

P!

G A! ∆G ! G P !
G A!
∆G !
G P !
y Velocidad de Reacción ! A P ! G A! ∆G ! G P ! •

Que determina la vel. de una reacción química? Que hace que una k de vel. sea grande o chica?!

Existen múltiples evidencias que muestran que para reaccionar las moléculas deben ser “activadas” de alguna manera à Barrera o Energía de activación/Estado de transición!

Estados de transición y Velocidad de Reacción!

Si asumimos que existe un equilibrio entre las moléculas de A que se encuentran en el estado basal y el estado activado à la fracción activada se puede calcular: !

[A] # = [A]° . e - G#/RT

Como únicamente las moléculas que alcanzan el estado de transición pueden reaccionar, la constante de reacción es proporcional a la [A] # à !

Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas precisas !

equilibrios tienen definiciones termodinámicas precisas ! •   •   Equilibrio de reacción depende

Equilibrio de reacción depende Δ Go ! Velocidad de reacción depende de Δ G !

Equilibrio de reacción depende Δ G ’ o ! Velocidad de reacción depende de Δ G
! S ! !P !
!
S
!
!P !

Keq= !

[P] !

de Δ G ‡ ! ! S ! !P ! Keq ’ = ! [P] !

[S] !

V = k [S]!

ΔGo = - RT ln Keq!

k = !

KT !

[S] ! Δ G ’ o = - RT ln Keq ’ ! k = !

h !

e - ΔG/ RT!

RT ln Keq ’ ! k = ! KT ! h ! e - Δ G

K = constante de Boltzmann ! h = constante de Planck !

Como actúa un catalizador?!

ΔG = ΔH - T ΔS !

1. Muchas veces las moléculas para poder reaccionar tienen que adoptar estados conformacionales “tensos” que demandan energía… los catalizadores pueden reducir esta esta energía uniéndose a las moléculas de reactivos en una conformación similar a la del estado de transición ! 2. Para que una reacción ocurra se requiere que los reactivos adopten una orientación determinada… como una mariz externa, los catalizadores pueden forzar a las moléculas a orientarse para favorecer la reacción !

Como actúa un catalizador? !

ΔG = ΔH - T ΔS !

Como actúa un catalizador? ! Δ G ‡ = Δ H ‡ - T Δ S

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

B. !Principios fundamentales de la acción catalítica de las enzimas !

fundamentales de la acción catalítica de las enzimas ! ¿ cómo funcionan las enzimas ? !

¿ cómo funcionan las enzimas ? !

En condiciones fisiológicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas (estabilidad de biomoléculas) !

Muchas reacciones bioquímicas suponen situaciones poco probables !

Una enzima soluciona estos problemas proporcionando un ambiente tridimensional favorable a la reacción (sitio activo)!

El rasgo dis:n:vo de una reacción enzimá:ca es que :ene lugar dentro de un pequeño lugar de la enzima:

el si:o ac:vo

La molécula fijada en el si:o ac:vo, sobre la que actúa la enzima, se denomina sustrato

de la enzima: el si:o ac:vo La molécula fijada en el si:o ac:vo, sobre la que

Las enzimas alteran las velocidades de reacción pero no los equilibrios !

las velocidades de reacción pero no los equilibrios ! (B) E + S ! (A) S

(B) E + S

!
!
(A) S ! ES ! !
(A) S
!
ES !
!
!P! EP ! !
!P!
EP !
!

E + P !

las velocidades de reacción pero no los equilibrios ! (B) E + S ! (A) S

(A) !

las velocidades de reacción pero no los equilibrios ! (B) E + S ! (A) S

(B) !

Como actúan las enzimas como catalizadores?!

Modelo llave-cerradura (E. Fischer, 1894):

Para que una enzima catalice una reacción su siPo acPvo ha de ser complementario al estado de transición de la reacción (L. Pauling, 1946). Modelo de ajuste inducido (D. Koshland 1958):

al estado de transición de la reacción (L. Pauling, 1946). •   Modelo de ajuste inducido
al estado de transición de la reacción (L. Pauling, 1946). •   Modelo de ajuste inducido

Las interacciones débiles entre enzima y sustrato son óptimas en el estado de transición !

Las interacciones débiles entre enzima y sustrato son óptimas en el estado de transición !
Las interacciones débiles entre enzima y sustrato son óptimas en el estado de transición !

En el estado de transición las interacciones entre la enzima y el sustrato son óptimas !

En el estado de transición las interacciones entre la enzima y el sustrato son óptimas !
En el estado de transición las interacciones entre la enzima y el sustrato son óptimas !

La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y catálisis !

La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y catálisis !
La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y catálisis !

Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis !

Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis !
Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis !
Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis !

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

El modelo de Michaelis-Menten (1913) !

El modelo de Michaelis-Menten (1913) !
Leonor Michaelis! Maud Menten !
Leonor Michaelis!
Maud Menten !

E + S

!
!
ES ! !
ES !
!

E + P !

Postularon que la enzima se combina en primer lugar con el sustrato, de forma reversible ! El complejo se descompone en una reacción más lenta, dando lugar al producto y enzima libre!

Cinética Enzimática: estado estacionario!

Cin ética Enzimática: estado estacionario !
Cin ética Enzimática: estado estacionario ! v o = k 2 [ES] !

v o = k 2 [ES] !

Cin ética Enzimática: estado estacionario ! v o = k 2 [ES] !

Cinética del estado estacionario !

Cinética del estado estacionario !
Cinética del estado estacionario !
Cinética del estado estacionario !
Cinética del estado estacionario !
! Formación de ES: Descomposición de ES: k - 1 [ES] + k 2 [ES]

!

Formación de ES:

Descomposición de ES: k -1 [ES] + k 2 [ES]!

k 1 [E][S]!

! !k1[E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES]!

! !k 1 [E][S] = (k -1 +

k 2 ) . [ES]!

! !k -1 + k 2

! E T = E + ES !

E = E T - ES !

k 1

=

[E][S]!

[ES]!

Relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción enzimática !

de sustrato y velocidad de reacción enzimática ! k 1 [E L ][S] = k -

k

1 [E L ][S] = k -1 [ES] +

k 2 [ES]!

 

k

1 [E T - ES][S] = k -1 [ES] +

k 2 [ES]!

k

1 [E T ][S] – k 1 [ES][S] = k -1 [ES] + k 2 [ES]!

k

1 [E T ] [S] = k -1 [ES] +

k 2 [ES] + k 1 [ES][S] !

k

1 [E T ] [S] = [ES] (k -1 +

k 2 + k 1 [S]) !

Dividimos por k 1 :!

[E T ] [S] = [ES] ((k -1 +

k 2 ) + [S]) !

k 1 !

Constante de Michaelis: ! K M = ! k - 1 + k 2 k

Constante de Michaelis:!

K M =!

k -1 + k 2

k 1

=

[E T - ES][S]!

[ES] !

Constante de disociación del complejo ES:!

K s =!

k

-1

=

k

1

[E][S]!

[ES]!

E T = E + ES! E = E T - ES!

!

[E T ] [S] = [ES] (K M +[S]) !

[ES] = !

[E T ] [S]!

(K M +[S]) !

ücomo

v o = k 2 [ES]!

k 2 [E T ] [S]!

v o =!

K M + [S]!

Ecuación de

T ] [S] ! v o = ! K M + [S] ! Ecuación de Michaelis-Menten

Michaelis-Menten!

Cuando toda la enzima se encuentra formando complejo

ES: ! k 2 [E T ] = v max !

v o = !

v max [S]!

K M + [S]!

Variación de la velocidad de reacción con la concentración de sustrato de acuerdo a la ecuación de Michaelis y Menten!

Variación de la velocidad de reacción con la concentración de sustrato de acuerdo a la ecuación
Variación de la velocidad de reacción con la concentración de sustrato de acuerdo a la ecuación

La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !

La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !
La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !

La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !

La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !
La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas !

K m y V max son característicos para cada pareja enzima-sustrato!

K m y V m a x son característicos para cada pareja enzima-sustrato !
K m y V m a x son característicos para cada pareja enzima-sustrato !

K m y V max son característicos para cada pareja enzima-sustrato !

K m y V m a x son característicos para cada pareja enzima-sustrato !
K m y V m a x son característicos para cada pareja enzima-sustrato !

Diferencias entre K M y K s !

Diferencias entre K M y K s !
Diferencias entre K M y K s ! Constante de Michaelis: ! K M = !

Constante de Michaelis:!

K M =!

k -1 + k 2

k 1

=

[E T - ES][S]!

[ES] !

Constante de disociación del complejo ES:!

K s =!

k

-1

=

k

1

[E][S]!

[ES]!

E T = E + ES! E = E T - ES!

!

Si k 2 es la constante del paso limitante de reacción entonces: !

k 2 = k cat

à ! v max = k cat [E T ] !

kte catalítica es una medida directa de la producción catalítica de producto! Cuanto más grande kcat à más rápidos son los eventos catalíticos en el sitio activo. ! Kcat = s -1 à 1/kcat = s à el tiempo necesario para que una mólecula de enzima transforme un sustrato en producto = tiempo que dura un ciclo catalítico.! Kcat nos dice cuantas moléculas de sustrato la enzima saturada transforma en un segundo = Nro de recambio!

K cat y K M

K cat y K M
K cat y K M Cuando [S] << k M à [E] T ∼ [E] L

Cuando [S] << k M à [E] T [E] L à !

v =

kcat

Km

[ E ][ S ]

El significado de Km y Vmax y la eficiencia catalítica !

El significado de Km y Vmax y la eficiencia catalítica ! De este modo la relación

De este modo la relación kcat/Km se aproxima a una constante de velocidad de segundo orden para la reacción de S y E, sería k 1 .!

d[ES] = k 1 [E][S]! dt!

v = kcat [E] [S] !

K M !

Enzima

Km (M)

kcat (s -1 )

kcat/Km (M -1 s -1 )

Pepsina

3x10 -4 7.9x10 -3 5x10 -6

0.5

1.7x10 3

Ribonucleasa

790

1.5x10 7

Fumarasa

800

1.6x10 8

Gráfico de dobles recíprocos!

Gráfico de dobles recíprocos !

v o = !

1

v o

=!

v max [S]!

K M + [S]!

K M

1

V max [S]

+!

1 !

V max!

y= ax + b !

a x [S] ! K M + [S] ! K M 1 V max [ S

Ecuación de Lineweaver -Burk !

Inhibición competitiva !

Inhibición competitiva !
Inhibición competitiva ! K M aparente es mayor que K M real ! V m á

K M aparente es mayor que K M real!

V máx no se modifica !

Inhibición competitiva ! K M aparente es mayor que K M real ! V m á

Inhibición mixta (no-competitiva) !

Inhibición mixta (no-competitiva) !
Inhibición mixta (no-competitiva) ! K M aparente es igual que K M real ! V m

K M aparente es igual que K M real!

V máx disminuye !

Inhibición mixta (no-competitiva) ! K M aparente es igual que K M real ! V m

Inhibición incompetitiva !

Inhibición incompetitiva !
Inhibición incompetitiva ! K M /V m á x se mantiene constante !

K M /V máx se mantiene constante !

Inhibición incompetitiva ! K M /V m á x se mantiene constante !

Efecto del pH sobre la actividad enzimática !

Efecto del pH sobre la actividad enzimática !
Efecto del pH sobre la actividad enzimática !
Efecto del pH sobre la actividad enzimática !

Muchas enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos !

Muchas enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos !
Muchas enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos !
Muchas enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos !

Enzimas !

Enzimas ! A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto
A. !Propiedades generales de las enzimas! ! B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de
A. !Propiedades generales de las enzimas!
!
B. Velocidad de Reacción Química y Efecto de los
Catalizadores !
! C. !Principios fundamentales de su acción catalítica ! ! D. !Introducción a la cinética
!
C. !Principios fundamentales de su acción catalítica !
!
D. !Introducción a la cinética enzimática !
!

E. !Enzimas reguladoras !

Enzimas reguladoras !

Enzimas reguladoras !

1.Enzimas alostéricas ! Son reguladas por unión no-covalente de

moduladores ! Constituyen excepciones a muchas reglas generales !

-

-

efecto homotrópico (positivo o negativo) !

efecto heterotrópico (positivo o negativo) !

-

Hay dos modelos que explican el comportamiento cinético de las enzimas alostéricas !

-

-

modelo simétrico (Monod) ! Modelo secuencial (Koshland) !

modelo simétrico (Monod) ! Modelo secuencial (Koshland) !

Enzimas reguladoras !

Enzimas reguladoras !

2.Modulación covalente reversible !

Fosforilación !

Adenililación !

Uridililación !

ADP-ribosilación !

Metilación !

Fosforilación / defosforilación!

Fosforilación / defosforilación !
Fosforilación / defosforilación !

Activación de zimógenos !

Activación de zimógenos !
Activación de zimógenos !