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ESCUELA

DE MICROBIOLOGÍA – MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL


Manual de prácticas Ingeniería Genética

PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MANEJO DE PIPETAS

1. INTRODUCCIÓN

En el laboratorio de Ingeniería genética los ensayos que se llevan a cabo requieren de


pequeño volúmenes que deben ser medidos con la mayor precisión posible, y para esto se
cuenta con las micropipetas, dispositivos que permiten la medición desde 0. 2 μl a 5000
µl. Estas pipetas están basadas en el desplazamiento aire entre el líquido y el pistón, de tal
manera que el desplazamiento del volumen depende del pistón. Para facilidad de uso
existen una variedad de modelos con puntas eyectoras, digitales y con diferentes tipos de
dispensación. Para su preciso funcionamiento es fundamenta la excelente calibración y
mantenimiento.

Dentro de las explicaciones con la micro pipeta utilizaremos el término tope para designar
el impedimento que entramos al deslizar el pistón con el pulgar.

Operación general: A continuación se presenta una manera resumida y grafica del uso
general de la micropipeta.

Adecuación del volumen requerido para pipetear, esto permitirá que el pistón se mueva
en la posición apropiada.


Figura 1a


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Preparación de la aspiración. La pipeta debe ser presionada para aspirar la muestra, esto
se debe a que el pistón desciende y expele el volumen de aire igual al volumen
seleccionado para el líquido.


Figura 1b
Aspirado de la muestra. La punta removible es sumergida en el líquido, se libera
lentamente el pulgar y el vacio succiona el líquido dentro de la punta.


Figura 1c

Dispensación de la muestra. La pipeta es presionada con el pulgar lo que hará que la
presión del aire interna se aumente, teniendo como resultado la salida del líquido de la
punta.


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Figura 1d.

Desplazamiento positivo: Este tipo de desplazamiento se utiliza preferiblemente cuando
se usan líquidos pesados, viscosos y volátiles, para evitar que el contacto directo de la
aspiración sea sin evaporación. De otro lado esto evita la contaminación cruzada entre
muestras.
Para llevar a cabo las prácticas siguientes es necesario preparar algunas soluciones,
además es de vital importancia que se dominen completamente los cálculos necesarios
para preparar diferentes soluciones y las unidades de concentración utilizadas.

Algunas de estas unidades son:

Porcentaje masa-masa (% m/m)

Porcentaje volumen-volumen (% V/V)

Molaridad: (M), o concentración molar, es el número de moles de soluto por cada litro de
disolución.


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Molalidad: (m) es el número de moles de soluto por kilogramo de disolvente (no de
disolución).

Normalidad(N) es el número de equivalentes (eq-g) de soluto (sto) por litro de disolución


(sc). El número de equivalentes se calcula dividiendo la masa total por la masa de un
equivalente: n = m / meq, o bien como el producto de la masa total y la cantidad de

equivalentes por mol, dividido por la masa molar: .

Partes por millón (ppm)

2. OBJETIVOS
Objetivo general
Realizar los cálculos para la preparación de soluciones stock para el desarrollo de las
prácticas en Ingeniería Genética.
Retomar el correcto funcionamiento de las micropipetas.

Objetivos específicos
− Identificar los procedimientos de desplazamiento normal y desplazamiento
positivo en el uso de micropipetas.
− Recordar los conceptos de Normalidad, Molaridad, Formalidad, porcentaje m/m,
m/V, V/V.


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− Comprender el uso de las diferentes soluciones y su efecto sobre los
procedimientos en ingeniería genética
− Realizar los cálculos para la preparación de las soluciones utilizadas en la práctica
de extracción de ácidos nucleicos.


3. MATERIALES Y EQUIPOS
ü Azul de metileno
ü Glicerol
ü Etanol
ü Puntas de 10, 100 y 1000 µl
ü Papel absorbente
ü Micropipetas de 10, 100 y 1000 µl
ü Balanza analítica

4. METODOLOGÍA

Uso correcto de micropipetas
Desplazamiento normal: cada estudiante con la micropipeta adecuada debe medir los
siguientes volúmenes de una solución de azul de metileno: 10, 100, 500 y 1000 µl; y
dispensarlos en el papel absorbente. Realizar 10 repeticiones por cada volumen.


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Desplazamiento positivo: en este caso se deben medir volúmenes de 10 y 100 µl de
glicerol y etanol. Dispensar en papel absorbente y repetir 10 veces cada medición.



Para la pipeta de 100 ul y 1000 ul medir con agua, los volúmenes indicados y pesarlos en
la balanza analítica (llenar la siguiente tabla) por triplicado:

Volumen medido (µl) Peso Densidad
100
1000

Preparación de soluciones

Soluciones Stock o Madre o Concentradas: a continuación se presentan las soluciones


concentradas a partir de la cual se deben preparar las soluciones de trabajo. Realice los
cálculos para determinar cuantos gramos o mililitros debe de utilizar para su preparación.


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Buffer TBE 10X
Tris base 820mM
Acido bórico 740mM
EDTA pH 8.0 70 mM
Volumen final 100 ml

EDTA 200 mM Volumen final 200 ml

HCL 500 mM volumen final 100 ml


5. REFERENCIAS
− The gilson guide to pipetting ISO 8655.
− http://www.iso.org/iso/home.htm
− http://www.sizes.com/units/BIPM.htm
− Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and
Struhl, K.. Current protocols in molecular biology. 1994-20051 - USA 5 vols.
Different Chapter.
− Sambrook, J.F. & Rusell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tercera
edicion Cold Spring Harbor Press, New York, USA. 2001; vol 1.
− http://www.protocol-online.org/

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