UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PUEBLA.

RECUPERACION, AISLAMIENTO, TINCION Y OBSERVACION DE BACTERIAS GRAM

POSITIVAS Y NEGATIVAS, HONGOS LEVADURIFORMES, HONGOS
FILAMENTOSOS. OBSERVACION DE HONGOS FILAMENTOSOS POR
MICROCULTIVO.

MATERIA:

FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA.

GRUPO:

3BA.

PROFESOR:

MARIA DEL TRÁNSITO BORRAZ ARGUELLO.

INTEGRANTES:

E. SAMANTHA CRUZ ROSALES.

LUZ ARANZA LÓPEZ CABRERA

WILLEBALDO HERNANDEZ.

MIREYA ESPINOSA PEÑA.

CUATRIMESTRE: TERCERO.
 1. INTRODUCCION.
La microbiología se ha definido a menudo como el estudio de organismos y agentes que
son demasiado pequeños para poder observarlos con el ojo humano a simple vista —esto
es, el estudio de los microorganismos—. Como los objetos inferiores a un milímetro de
diámetro no pueden observarse claramente y deben examinarse con microscopio, la
microbiología trata principalmente de organismos de este tamaño o inferior. Esta ciencia se
ocupa del estudio de virus, bacterias, muchas algas y hongos, y protozoos. Sin embargo,
otros miembros de estos grupos, particularmente algunos de algas y hongos, son más
grandes y bastante visibles. Por ejemplo, los microbiólogos estudian los mohos del pan y
las algas filamentosas, aunque se pueden ver a simple vista. Debido a la dificultad para
delimitar el campo de la microbiología, Roger Stainer ha sugerido que se defina a esta
ciencia no sólo respecto del tamaño de los objetos que estudia, sino también teniendo en
cuenta las técnicas empleadas. En general, un microbiólogo aísla primero un
microorganismo específico de una población, y luego lo cultiva. Por ello, la microbiología
emplea técnicas —como la esterilización y el empleo de medios de cultivo— que son
necesarias para aislar y cultivar con éxito microorganismos.
2 OBJETIVO.
2.1 Aprender las diversas técnicas para recuperar, aislar y observar un microorganismo al
microscopio, así como aprender sus características para poder diferenciarlos entre ellos.
2.2 Conocer el crecimiento de un hongo en específico mediante la realización de una curva
de crecimiento.
3 MATERIALES Y METODO.
3.1 MATERIALES.
Matraces Erlenmeyer de Gradilla Mango de bisturí.
250 ml
Hisopos largos y cortos. Hoja de bisturí.
Pipetas de 10 ml
Papel aluminio 7ml de agua estéril.
Probeta de 100 ml
Balanza Barniz transparente.
Mechero
Jeringas de 10 ml Guante limpio.
Tripee.
Gasas de 5cm. Asa punta.
Tela de asbesto
Portaobjetos. Asa de aro.
Placas p100
Cubreobjetos. Frasco grande con boca
Placas p60 ancha.
Pipeta graduada de 5ml.
Tubos de ensaye
Pinza plana.
3.2 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS.

Nombre del medio. Uso. Preparación.

Nutritivo Recuperación y aislamiento Todos los medios de cultivo
de gram positivos. fueron preparados según las
Mac Conkey Recuperación y asilamiento especificaciones del bote, y
de gram negativos. las cantidades fueron
V8 Recuperación y aislamiento adaptadas según la cantidad
de hongos filamentosos. que iba a ser necesaria.
EMB Observación de crecimiento
de cepa (entero bacteria) en
distintos medios de cultivo.
Violeta y rojo bilis. Observación de crecimiento
de cepa (entero bacteria) en
distintos medios de cultivo.
MUG Observación de crecimiento
de cepa (entero bacteria) en
distintos medios de cultivo.
Salmonella-shigella Observación de crecimiento
de cepa (entero bacteria) en
distintos medios de cultivo.
Verde brillante Observación de crecimiento
de cepa (entero bacteria) en
distintos medios de cultivo.
SDA Observación de crecimiento
radial y microcultivo de hongo
filamentoso.
PDA Recuperación y aislamiento
de hongos levaduruformes.

3.2 METODO.
3.2.1 Recuperación.
3.2.1.1 Gram positivas (agar nutritivo).
Después de haber vertido el agar en 1 placa p100 (equipo) y 1 placa p60 (individual), dejar
solidificar.
Tomar un hisopo estéril e introducirlo en la garganta procurando hacerlo cerca del mechero.
Abrir la placa cuidadosamente y hacer siembra por estría masiva doble con el hisopo
tocando cuidadosamente el medio.
Dejar en la incubadora por 24hrs a una temperatura de 35-37°C
3.2.1.2 Gram negativas (agar Mac Conkey).
Después de haber vertido el agar en 1 placa p100 y 2 placas p60, dejar solidificar.
Tomar 1ml de la muestra de salsa con ayuda de una jeringa de 10 ml.
Llenar la misma jeringa y con la salsa dentro, hasta los 10 ml de agua destilada (9 ml).
Soltar la dilución en un tubo de ensaye estéril y volverla a tomar con la jeringa para
homogenizar (repetir 3 veces).
Esterilizar asa de aro hasta que se torne roja.
Tomar el asa e introducirla en el tubo de ensaye, el líquido que se quede en el aro
transferirlo en el centro de la placa.
Esparcir con ayuda del asa drigraslky.
Dejar en incubadora 24hrs a una temperatura de 35-37°C
3.2.1.3 Hongo levaduriforme (PDA)
Después de haber vertido el agar en 1 placa p100 y 2 placas p60, dejar solidificar.
Tomar 1 ml de pulque con la jeringa estéril.
Con la misma jeringa tomar 9 ml del agua destilada.
Verter la mezcla en un tubo de ensaye, volver a tomarla con la jeringa y vaciarla de nuevo
para homogenizar (repetir 3 veces).
Esterilizar el asa de aro e introducirla dentro del tubo de ensaye y con el líquido en el aro
hacer estría masiva doble.
Dejar en incubadora de 24 a 48hrs a una temperatura de 26-48°C.
3.2.1.4 Hongo filamentoso (agar V8)
Después de haber vertido el agar en 1 placa p100 (individual) y 2 placas p60 (equipo), dejar
solidificar.
Tomar el alimento que contenga hongo y con el asa de punta previamente esterilizada y
templada raspar 3 veces el área con hongo.
Hacer siembra por punción en el centro de la placa.
Guardar en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
3.2.2 AISLAMIENTO.
3.2.2.1 Gram positiva (agar nutritivo)
Con el asa de aro previamente esterilizada y templada tomar una colonia de la placa p100
y hacer siembra por estría cruzada de 3 en placa p60.
3.2.2.2 Gram negativa (agar Mac Conkey)
Ídem.
3.2.2.3 Hongo levaduriforme (PDA)
Ídem.
3.2.2.4 Hongo filamentoso (agar V8)
Con el asa de punta previamente esterilizada y templada raspar a ¾ del centro del hongo y
sembrar por punción en placa p60
3.2.2.5 Hongo filamentoso para crecimiento radial (SDA)
Después de haber vertido agar en 1 placa p100 (individual), dejar solidificar.
Con el asa de punta previamente esterilizada y templada raspar a ¾ del centro del hongo
(puro) y hacer siembra por punción.
3.2.2.6 Cepa 3 en agar Mac Conkey, MUG, EMB, Violeta y rojo bilis, verde brillante,
Mac Conkey y salmonella-shigella.
Usando la cepa proporcionada; con el asa de aro previamente esterilizada y templada,
tomar una colonia y hacer aislamiento por estría cruzada de 4 en el medio de cultivo.
Repetir este paso en cada uno de los medios.
3.2.3 TINCIONES.
3.2.3.1 Tinción de gram positiva (tinción de gram).
Desinfectar el portaobjetos con etanol
Esterilizar el asa de aro en el mechero hasta que brille y enfriar. Usar para colocar una
pequeña gota de agua en el porta objetos, esterilizar y enfriar el asa otra vez.
Transferir una pequeña muestra del cultivo y revolver suavemente en la gota de agua (sin
que se vea lechoso).
Fijar muestra por calor, pasar el portaobjetos 3 veces por el medio del mechero.
Una vez fijo colocar 1 gota de cristal violeta y dejar reposar 1 minuto
Agregar una gota de lugol sobre el cristal violeta y dejar reposar 1 minuto
Enjuagar inclinando en portaobjetos con agua destilada.
Agregar mezcla 1:1 de etanol cetona y dejar de 10 a 30 segundos
Enjuagar con agua destilada.
Empapar la mancha con safranina y reposar 1 minuto.
Enjuagar y secar el portaobjetos al aire.
3.2.3.2 Tinción de gram negativa (tinción de gram)
Ídem.
3.2.3.3 Tinción de hongo levaduriforme (tinción lugol)
Esterilizar el asa hasta brille y enfriar
Tomar una gota de agua y esparcirla en el portaobjetos
Esterilizar el asa otra vez y enfriar.
Tomar una muestra de la levadura y espacir en el portaobjetos
Fijar al calor pasando el portaobjetos 3 veces por el mechero.
Agregar 1 gota de lugol y dejar reposar 1 minuto.
Enjuagar con agua destilada
Dejar secar el exceso y cuando quede un poco de líquido, cubrir con el cubreobjetos
3.2.3.4 Tinción de hongo filamentoso (Azul algodón)
Sobre una porta objetos limpio y seco depositar una gota de azul de algodón
Esterilizar el asa de aro y tomar un poco del hongo procurando haberlo raspado 3 veces
antes.
Hacer un pequeño frotis con el asa en la gota de colorante sobre el porta objetos
Tapar con cubre objetos
3.2.3.5 Tinción de hongo filamentoso (Método cinta)
Poner en un portaobjetos una gota de colorante azul de algodón.
Cortar un trozo de cinta
Abrir la placa petri sobre la mesa y acomodar la cinta en los dedos.
Tomar un poco del hongo con el lado del pegamento de la cinta, cuidando hacer poca
presión.
Poner la cinta sobre la gota de azul de algodón sobre el portaobjetos.
Tapar con el cubreobjetos y cortar los extremos sobrantes de cinta.
3.2.3 MICROCULTIVO.
Tener material previamente esterilizado (8 pares de cotonetes, 8 portaobjetos, 8
cubreobjetos, 1 pipeta de 5ml, 1 pinza plana, 1 mango de bisturí y 7ml de agua destilada,
todo correctamente envuelto en papel estraza).
Una vez estéril el material, frente al mechero, cuadricular el agar Sabouraud solidificado de
la placa p60 con el bisturí, siguiendo la guía trazada en la parte exterior de la placa.
Colocar en una placa p100 estéril y limpia, una gasa de 5x5cm, dos cotonetes de forma
paralela dejando espacio entre ellos y posteriormente un portaobjetos sobre los cotonetes,
todo esto con ayuda de la pinza estéril.
Con ayuda del bisturí colocar sobre el portaobjetos un cuadro de agar de 1.5x1.5cm,
tratando de que este quede lo más centrado posible. Procurar ponerle la tapa a la placa
después de cada paso para evitar contaminación.
Hacer un raspado; con el asa de punta previamente esterilizada, a ¾ del hongo puro y
realizar una siembra por punción en los 4 costados del cuadro de agar.
Tomar un cubreobjetos sobre la pinza y colocarlo sobre el cuadro de agar. Hacer todos los
pasos anteriores lo más cerca del mechero que sea posible.
Dejar a temperatura ambiente por aproximadamente 1 semana.
INACTIVACIÓN DE CONIDIOS Y OBSERVACION AL MICROSCOPIO.
Tomar una torunda de fenol y colocarla dentro del microcultivo por 10 minutos.
Colocar en un portaobjetos limpio y estéril una gota de colorante azul de algodón,
posteriormente tomar el cubre objetos del microcultivo con ayuda de las pinzas y con una
torunda de fenol, limpiar los conidios de las orillas, finalmente colocar el cubre objetos sobre
el portaobjetos con colorante.
Con ayuda de los palillos retirar cuidadosamente el cuadro de agar del portaobjetos en el
microcultivo.
Limpiar la parte del portaobjetos que quedara fuera del cubre objetos con una torunda de
fenol y colocar una gota de azul de algodón, posteriormente colocar un cubre objetos
limpios.
Secar las orillas del cubreobjetos con papel de baño, teniendo extremo cuidado de no mover
el cubre, hasta que quede completamente seco.
Barnizar con esmalte trasparente los bordes del cubre para sellarlo.
4 RESULTADOS.
4.1 RECUPERACION.

MICROORGANISMO. MEDIO. COLONIAS. OBSERVACIONES.

Forma: circular
Elevación: plano
Margen: entero
Transmisión de luz:
traslucida
Agar Superficie: lisa
Gram positivas. Consistencia: viscosa
nutritivo.
 Forma: circular
Elevación: convexa
Margen: ondulado
Transmisión de luz:
Agar traslucida
Gram negativas. Superficie: lisa
MacConkey
Consistencia: viscosa

Forma: circular
Elevación: plana
Margen: entero
Transmisión de luz: opaca
Superficie: lisa
Levaduras. PDA Consistencia: viscosa

Borde: irregular
Superficie: plana
Consistencia: suave
Textura: granular

Hongo filamentoso Agar v8

4.2 AISLAMIENTO.

MICROORGANISMO. MEDIO. COLONIA OBSERVACIONES.

Forma: circular
Elevación: plano
Margen: entero
Transmisión de luz:
Agar traslucida
Gram positiva.
nutritivo. Superficie: lisa
Consistencia: viscosa
 Forma: circular
Elevación: convexa
Margen: ondulado
Agar Transmisión de luz:
Gram negativa.
MacConkey traslucida
Superficie: lisa
Consistencia: viscosa

Forma: circular
Elevación: plana
Margen: entero
Transmisión de luz: opaca
Levadura Superficie: lisa
PDA
Consistencia: viscosa

Borde: irregular
Superficie: plana
Hongo filamentoso Agar V8 Consistencia: suave
Textura: granular

Forma: Circular
Elevación: plana.
Margen: entero.
Transmisión de luz: opaca.
Cepa 3 (E, coli) EMB Superficie: Lisa.
E coli presenta brillo verde
brillante por fermentación de
lactosa.

Forma: Circular
Elevación: convexa.
Margen: Globulado.
Cepa 3 (E, coli) MUG Transmisión de luz: traslucida
Superficie: Lisa
Con luz uv las colonias de e.
coli fluorecen
Forma: Circular
Elevación: convexa.
Margen: entero.
Salmonella- Transmisión de luz:
Cepa 3 (E, coli) Traslucida.
shigella
Superficie: Lisa.
Crecimiento casi nulo,
colonias rosadas.
 Forma: Circular
Elevación: plana.
Margen: ondulado.
Transmisión de luz:
Traslucida.
Superficie: Lisa.
Verde
Cepa 3 (E, coli) La lactosa y sacarosa con rojo
brillante
fenol forman un sistema de
diferenciación para excluir los
fermentadores de lactosa o
sacarosa (p. ej. E. coli), por
eso el crecimiento es casi
nulo.
Forma: Circular
Elevación: convexa.
Margen: entero.
Transmisión de luz:
Traslucida.
Cepa 3 (E, coli) MacConkey Superficie: Lisa.
Fermentadores de lactosa
como E. coli forman
colonias rosadas.

Forma: Circular
Elevación: plana.
Margen: entero.
Transmisión de luz:
Violeta y rojo traslucida.
Cepa 3 (E, coli) Superficie: Lisa.
bilis
Es un medio para
coliformes, por eso E.coli
crece satisfactoriamente.
4.3 OBSERVACION AL MICROSCOPIO POR TINCIONES.

MICROORGANISMO. OBSERVACIONES
Se encuentran en forma de
cocos en cadenas cortas de 2
(diplococos). Se observa color
violeta ya que en el proceso de
tinción estas no se decoloraron
Gram positiva. mucho debido a las
caracterisicas de su pared
celular, su gruesa capa de
peptidoglicano les proporciona
resistencia.

Se pueden observar bacterias

con forma de bacilos de color
rosa. Esta coloración se debe a
las características que poseen
las gram – en su pared celular.
Gram negativa. Debido a su delgada capa de
peptidoglicana la cantidad de
lugol y cristal violeta que retienen
en la decoloración es minima.

Se pueden observar células de

diferentes tamaños, pero todas
con la misma forma. Las células
pequeñas son las recién
formadas por gemación, también
Levadura. se pueden observar células
llevando a cabo esta
reproducción.

El azul de algodón tiene una

afinidad por las estructuras
fúngicas. El acido láctico que
contiene ayuda a conservar sus
Hongo filamentoso estructuras, este se adhiere a las
(tinción) hifas y conidios.
 Este método permite la
observación del hongo mientras
este se desarrolla de forma que
sus características se observan
Hongo filamentoso fácilmente.
(método cinta)

Aspergillus niger.
Podemos observar su vesicula,
conidios, metulas, fialides e hifa
septada.
Hongo filamentoso
(microcultivo)

Penicillium.
Solo se observaron hifas
septadas y conidios ya que estos
ya se habían desprendido de sus
fialides.

Penicillium.
Hifa septada. Igual que en el
caso anterior, pueden
observarse los fialoconidios que
ya se han desprendido de sus
fialides.

Aspergillus niger.
Se pueden observar hifas
septadas, hialinas. Los
conidióforos con vesículas
esféricas en el ápice. Los
conidios son globosos y tienes
una superficie áspera.
4.4 REGISTRO Y CURVA DE MICROCULTIVO.

Crecimiento (mm)
Horas Aspergillus niger. 1 Aspergillus niger. 2 Penicillium. 1 Penicillium.2
0 0 0 0 0
24 3 3 3 3
48 4 3 3 4
72 4 4 5 4
96 4 4 2 5
120 4 5 0 5
144 3 5 0 5
186 5 0 5
192 5 3
216 4
240

CRECIMIENTO RADIAL EN SDA

Aspergillus niger. 1 Aspergillus niger. 2
Penicillium. 1 Penicillium.2
6

0
0 50 100 150 200 250 300
-1
OBSERVACIONES.
Las placas p100 con agar sabouraud utilizadas para la graficación de la curva de
crecimiento radial de los hongos filamentosos, se contaminaron con un hongo. La tabla de
resultados no pudo ser concluida debido a esto.
5. CONCLUSION.
5.1 Aprendimos las diversas técnicas para recuperar, aislar y observar un microorganismo
al microscopio, también, aprendimos sus características para poder diferenciarlos entre
ellos.
5.2 Conocimos el crecimiento en horas de dos hongos en específico mediante la realización
de curvas de crecimiento.