LAB MICRO :

1.¿ que precauciones deben tener en cuenta antes de sembrar en medios para anaerobios?

El procesamiento mínimo debe incluir:

1- La observación directa-Características microscópicas. Los frotis de las muestras

deben ser examinadas previamente coloreados por la técnica de Gram. Este
paso es muy importante porque puede sugerir la presencia de bacterias
anaerobias que se caracterizan por su coloración irregular y pleomorfismo.
Además orientará sobre los medios selectivos a utilizar y servirá como control
de calidad, debiendo recuperarse todos los tipos morfológicos en proporción
aproximada a la que se observó.
2- Siembra en medios sólidos-Relación con el O2.Se siembra: una placa de agar
sangre en aerobiosis, otra en anaerobiosis una tercera placa en microaerofilia.
La microaerofilia se logra colocando en un recipiente hermético una vela
encendida que al extinguirse dará una atmósfera con 4% de O2 y 5-10% de CO2
aproximadamente.
3- Siembra en medios líquidos. Los medios líquidos, como el tioglicolato, deben ser
purgados antes de la siembra y suplementarse con vitamina K y CO3HNa.
Se inoculan con pipeta Pasteur llegando al fondo y sin introducir aire. Los
medios de cultivo líquidos son considerados “el respaldo” de los medios sólidos.
Los cultivos de bacterias anaerobias son de desarrollo lento, por lo tanto deben
incubarse 48 hs. antes de la primera observación.
Los cultivos negativos se mantienen en incubación durante dos semanas con
observaciones periódicas.
4- Aislamiento de las colonias desarrolladas. Deben verificarse la anaerobiosis y
observar las características macroscópicas.
Realizar la observación microscópica previa coloración de Gram. Siembra en
medios selectivos
5- Pruebas bioquímicas destinadas a la identificación del microorganismo. Se
recurre en primer lugar a un conjunto de pruebas bioquímicas que permiten la
identificación en grupos preliminares. Luego, dentro de cada grupo se procede a
la identificación definitiva. Existen en el comercio microsistemas completos para
la identificación de los anaerobios por ejemplo: API-20ª y Minitek.
La identificación de los anaerobios también puede llevarse a cabo mediante el
análisis de los productos metabólicos de la fermentación, ácidos volátiles y no
volátiles, por cromatografía líquido-gas.

2¿ que medios de cultivo se utilizan cuando sospecha?

1. Vibrio Cholerae: Se siembra un alícuota en un medio de enriquecimiento que sea

selectivo, como el TCBS (que contiene tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).
• Una vez obtenido en cultivo puro, se procesa la muestra mediante diversos tests
bioquímicos: oxidasa, LDC, ODC, entre otros.
2. 3. • Crecen con rapidez en agar peptona, agar sangre con pH cercano a 9,0; o
sobre agar TCBS, y en 18 horas se pueden observar colonias típicas. Pueden
incubarse unas pocas gotas de heces, para enriquecimiento, durante 6 a 8 horas
en caldo taurocolato- peptona (pH 8 a 9). TCBS Medio: También conocido como
Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o Agar Selectivo para Vibrios. Medio
selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, y otras especies de Vibrio
a partir de heces, agua y alimentos contaminados. También conocido como Agar
Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.
3. 4. • Figura 1. Cultivo de V. cholerae en medio TCBS. Después de 18-24 horas de
incubación a 35-37ºC crecen como colonias amarillas y brillantes de 2-4 mm de
diámetro. Figura 2. Detalle ampliado del aspecto macroscópico de V. cholerae en
 TCBS donde se observa el color amarillo de las colonias producido por la
fermentación de la sacarosa.

Clostridium botulinun: El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato
de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación
alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de
Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono
poco común.

MEDIOS SÓLIDOS.- Se pueden utilizar son el agar sangre o yema de huevo, el agar
Brucella con 5% de sangre ovina y el agar alcohol feniletílico con sangre. MEDIOS
LÍQUIDOS.- Incluyen un medio de almidón, glucosa y carne picada, un medio de carne
cocida, un medio clostridial reforzado, caldo anaerobio y otros. En los medios sólidos, las
colonias de C. botulinum a menudo son de un color blanco grisáceo con un borde irregular.
Las colonias son generalmente betahemolíticas en agar sangre, mientras que en un medio
de yema de huevo, con frecuencia muestran iridiscencia en la superficie, que se extiende
más allá de la colonia (lipasa positiva), y son variables para la actividad de la lecitinasa. La
zona iridiscente que rodea la colonia tiende a ser mayor para las toxinas C, D y E.

Brucella spp: En medio TSA, las cepas lisas (S) producen colonias circulares, convexas con
bordes regulares, translúcidas y coloración ámbar. A la luz reflejada son brillantes, ligeramente
opalescentes y de color gris azulado (Fig. 4).

En gelosa sangre no produce hemólisis, en agar Mac Conkey crecen poco y no fermentan la
lactosa.

Las cepas rugosas (R), el TSA, producen colonias semejantes en la forma pero varían
considerablemente en tamaño, color, consistencia y textura (Fig. 5).

En las cajas de TSA, se aconseja determinar la producción de catalasa y oxidasa, para las cuales
las brucelas son positivas. Inmediatamente se procede a aglutinar a las colonias sospechosas con
suero polivalente anti Brucella. Se recomienda realizar la suspensión de brucelas en solución
salina fenolada al 1.0% extremando las precauciones. Si hay aglutinación, muy probablemente
se trate de bacterias del género Brucella.

Campylobacter jejuni: Cultivo de C. jejuni en medio Skirrow. C. jejuni requiere condiciones

microaerófilas de cultivo con 5-10% de O₂ y 5-10% de CO2. Campylobacter crece a 37ºC pero la

incubación a 42ºC permite recuperar las especies termofílicas implicadas con más frecuencia en cuadros
de enteritis (C. jejuni y C. coli). Fuente: http://www.eolabs.com/productdetail.html?id=PP0110 ©

Figura 2. Detalle ampliado de colonias de Campylobacter coli. Se recomiendan 48 horas de incubación

para el diagnóstico rutinario. En Skirrow u otros agares con sangre, las colonias típicas
de Campylobacter son de color rosa pálido, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde regular.

En ocasiones son más grandes y se extienden sin solución de continuidad. Fuente: www.vetbact.se. Märit

Pringle (BVF, SLU) ©

CUESTIONARIO3:

1¿Pruebas bioquímicas para

1. Streptococcus pneumoniae

Solubilidad en bilis. Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de

lisarse en presencia de sales biliares, las m·s utilizadas de las cuales son el taurocolato y
el desoxicolato de sodio. Ambas provocan un descenso de la tensiÛn superficial, que,
unido a la actuaciÛn de enzimas auto líticos, destruyen la cÈlula. El efecto de esta
enzima autolÌtica se pone de manifiesto sobre colonias de S. pneumoniae crecidas en
medios sÛlidos, en las que se aprecia una umbilicaciÛn central, y tambiÈn en colonias
mucoides.

SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA

Objetivo: Diferenciar S.pneumoniae de otros estreptococos α-hemolíticos.

Fundamento: Se basa en la sensibilidad de S.pneumoniae a una concentración menor o
igual a 5µg/ml de hidroxicuprina (optoquina). Procedimiento: Estriar un cuadrante de
una placa de agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc Farland 0,5.
Colocar luego un disco de optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas
a 37ºC. Interpretación de resultados: Halos de inhibición mayores de 15mm son
característicos de S.pneumoniae .

2. Streptoccus Pyogenes

Aminopeptidasa: PYR. La Lpirrolidonil-β-naftilamida sirve como sustrato para la

detecciÛn de pirrolidonil peptidasa. Se utiliza principalmente en la identificaciÛn de
Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. TambiÈn en la diferenciaciÛn de
Staphylococcus lugdunensis de otros estafilocos coagulasa negativa.