Práctica 4.

Métodos de cuantificación de proteínas: método de Bradford, Biuret y

Lowry.

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2 personas) 4 horas No presenta indicadores de peligro

1. OBJETIVOS
1. Comparar los métodos de cuantificación de proteínas.
2. Determinar el rendimiento y pureza de una proteína: Caseína.
3. Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para la cuantificación de material biológico.

Conceptos relacionados:

Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva de calibración, caseína, reactivo
de Lowry.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO
Para el estudio de la estructura de una proteína, de la actividad de una enzima o el contenido
proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas.
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de
derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de formar complejos colorimétricos.
Entre los métodos que se basan en la formación de complejos colorimétricos entre las proteínas y
reactivos específicos se encuentran:

Método de Bradford
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en respuesta a diferentes
concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente
arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de
absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del
Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul.
La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se
mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
 Figura1. Estructura del azul de Coomassie.

Método de Lowry
Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un
reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.
Este método consta de dos etapas:
Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los
residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se
mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de
los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador.
El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Método de Biuret
La reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un complejo de
Cu, en un medio alcalino, con compuestos que poseen más de un enlace peptídico, como las
proteínas:

Figura 2. Reacción de Biuret.

La curva patrón es un método en química analítica empleado para medir la concentración de una
sustancia en una muestra por comparación con una serie de compuestos de concentración conocida.
Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la
absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para
ello, se efectúan diluciones de una muestra patrón cuya concentración es conocida y se registra la
lectura del analito presente en cada dilución, estableciendo una función matemática que relacione las
dos variables ―concentración vs variable de respuesta‖. Esto se denomina curva de calibración la cual,
será útil para determinar la concentración de la muestra problema.
En la tabla 1 se resumen las características de cada método de cuantificación de proteínas mencionado
previamente.
Tabla 1. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad.

Método Rango de sensibilidad (µg) Ventajas Aplicaciones

Bradford 1-15 Limite bajo de detección Resultados rápidos

Compatible con agentes Muestras que contienen
reductores agentes reductores
Rapidez

Lowry 25-100 a 500nm Color estable Útil para cuantificar proteínas

de membrana
2-30 a 660 nm Preciso
1-2 a 750 nm

Biuret 1000-10000 Muy específico para Determinación de proteínas

proteínas. en cereal.
Muestra pocas
interferencias
Es barato

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
15 tubos de ensayo Reactivo de Bradford
Micropipetas de 100 y 1000 µL Reactivo de Biuret
Gradilla para tubos de ensayo Reactivo de Lowry
Agitador Vortex Reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
Espectrofotómetro Albúmina sérica bovina (BSA) 10 mg/mL
Agua destilada
NaCl al 1% (p/p)
NaOH 1.0 M
Muestras problema: M1 y M2

4. PROCEDIMIENTO

Método de Bradford

Preparación del reactivo de Bradford

Para 500mL de reactivo de Bradford
 Mida 25mL de etanol al 95% (v/v) en una probeta y protéjalo de la luz con papel aluminio
 Pese 50 mg de azul de Coomassie G-250
 Mida 50 mL de ácido orto fosfórico al 85% (v/v)
 Agregue los 50 mg de azul de Coomassie G-250 al etanol lentamente en agitación constante

Preparación curva de calibración

La curva de calibración debe ir en la misma solución o buffer en el que se encuentran las muestras.
Idealmente medir triplicado cada patrón.
 Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 1mg/mL utilizando agua destilada como
disolvente.
 Prepare los patrones de acuerdo a la tabla 1.
Tabla 1. Especificaciones para la preparación de los patrones de BSA

#Patrón μL de BSA (1mg/mL) μL sln Buffer o H2O Concentración (mg/mL )

1 100 900 0.1

2 200 800 0.2
3 300 700 0.3
4 400 600 0.4
5 500 500 0.5
  Preparar el blanco: 1mL de Buffer o H2O y 1 mL de reactivo de Bradford
 Pasar el blanco en el espectrofotómetro a 595nm y establecer 0 o línea base
 De cada uno de los patrones preparados agregue 50 µL, 950 µL de agua y mezclar con 1 mL
de Bradford, como se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Especificaciones para la curva de calibración de Bradford.

μL de patrón μL sln Buffer o μL reactivo de Concentración final

Tubo
de referencia H2O Bradford proteína (µg/mL )

Blanco - 1000 1000 0.0

Tubo 1 50 950 1000 2.5
Tubo 2 50 950 1000 5.0
Tubo 3 50 950 1000 7.5
Tubo 4 50 950 1000 10.0
Tubo 5 50 950 1000 12.5
 Mezcle por inversión, y deje actuar por 3 minutos.
 Leer la absorbancia a 595nm de cada patrón preparado en la tabla 2.
 Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
 El docente entregará dos muestras problemas, M1 y M2, para la determinación de la
concentración de proteína. Si la muestra se encuentra fuera del rango de la curva estándar, el
estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de tal manera que se garantice que la
absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro del rango de los datos obtenidos en la
curva de calibración.

Método de Biuret

Preparación del reactivo de Biuret

Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita, añadir 200 ml
de NaOH 5.0 N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plástico.

Preparación curva de calibración

  Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 10 mg/mL.
 Prepare los patrones de BSA de acuerdo a la tabla 3.
Tabla 3. Especificaciones para la preparación de patrones de BSA para cuantificación método de
Biuret.

#Patrón mL de BSA (10 mg/mL) mL sln Buffer o H2O Concentración (mg/mL )

1 0.2 1.8 1.0

2 0.4 1.6 2.0
3 0.6 1.4 3.0
4 0.8 1.2 4.0
5 1.0 1.0 5.0
6 1.2 0.8 6.0
 De cada uno de los patrones preparados en la tabla 3, mezclar 500 µL con 750 µL del reactivo
de Biuret (ver tabla 4). Prepare el blanco mezclando 500 µL de agua (o buffer) con 750 µL del
reactivo de Biuret.
Tabla 4. Especificaciones para la curva de calibración para Biuret

Tubo μL de patrón de μL sln Buffer o μL reactivo de Concentración final proteína

referencia H2O Biuret (mg/mL )
Blanco - 500 750 0.0
Tubo 1 500 - 750 0.4
Tubo 2 500 - 750 0.8
Tubo 3 500 - 750 1.2
Tubo 4 500 - 750 1.6
Tubo 5 500 - 750 2.0
Tubo 6 500 - 750 2.4
 Mezcle por inversión, y caliente por 5 minutos a 37 °C o deje actuar por 30 minutos.
 Leer la absorbancia a 545 nm del blanco y ajustar a cero.
 Leer la absorbancia de cada patrón a la longitud de onda seleccionada.
 Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
  Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra fuera del
rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de tal
manera que se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro del
rango de los datos obtenidos en la curva de calibración.

Método de Lowry

Preparación del reactivo de Lowry

La preparación del reactivo de Lowry se debe realizar al momento de utilizarse para garantizar
mejores resultados. Para ello, se deben preparar tres soluciones:
Solución A: carbonato sódico al 2% p/v en NaOH 0.1M y guardar a temperatura ambiente.
Solución B: Sulfato cúprico al 1% p/v y guardar a temperatura ambiente.
Solución C: Tartrato de sodio-potásico al 2% p/v y guardar en el refrigerador.
El reactivo de Lowry se prepara mezclando 50 mL de la solución A, 0.5 mL de la solución B y 0.5 mL
de la solución C.

Preparación curva de calibración

 Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 1 mg/mL.
 Prepare los patrones de BSA de acuerdo a la tabla 5.

Tabla 5. Especificaciones para la curva de calibración método de Lowry.

mL de BSA (1 mL sln Buffer o Concentración

#Patrón mL reactivo Lowry
mg/mL) H2O (mg/mL )

Blanco - 1.0 5.0 0.000

1 0.2 0.8 5.0 0.033
2 0.3 0.7 5.0 0.050
3 0.4 0.6 5.0 0.066
4 0.6 0.4 5.0 0.100
5 0.8 0.2 5.0 0.133
Mezclar por inversión cada tubo y dejar reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Cubrir
el tubo con papel aluminio o mantener en la oscuridad.
Agregar a cada tubo 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
Mezclar por inversión y dejar en reposo durante 30 minutos en la oscuridad.
Calibrar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm y ajustar a cero con el blanco.
Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína son los
valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra por fuera del
rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de tal manera que
se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro del rango de los datos
obtenidos en la curva de calibración.

Determine el coeficiente de extinción molar para los tres métodos utilizados.

Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

1. Método de Bradford

Patrón Proteína (µg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)

1 2.5
2 5.0
3 7.5
4 10.0
5 12.5
M1
M2
2. Método de Biuret

Patrón Proteína (mg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)

1 0.4
2 0.8
3 1.2
4 1.6
5 2.0
6 2.4
M1
M2
 3. Método de Lowry

Patrón Proteína (mg/mL) Absorbancia Factor de dilución Proteína (mg/mL)

1 0.033
2 0.050
3 0.066
4 0.100
5 0.133
M1
M2

Disposición final de los residuos generados en la práctica:

Los residuos químicos generados en la práctica de laboratorio deben ser descartados en el recipiente
apropiado, rotulado de acuerdo al tipo de sustancia.

5. CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

1. Defina con sus propias palabras ¿qué es una curva patrón?
2. ¿Qué cuidados se debe tener en la práctica para garantizar la precisión en la cuantificación de
proteínas?
3. ¿Qué es y qué importancia tiene el uso de un blanco en un experimento?
4. Explique por qué en el método de Biuret la absorbancia de una proteína se lee a una longitud
de 545 nm.
5. ¿Cuál método es el más sensible?, y ¿el menos sensible? ¿Por qué?
6. Decide qué método de determinación de proteínas elegirías para la cuantificación de proteínas
en: suero, orina, durante una purificación enzimática, en un extracto bacteriano concentrado,
en preparaciones de membranas plasmáticas solubilizadas con SDS, en preparaciones de
membranas mitocondriales solubilizadas con Tritón X-100. Justifique su respuesta.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). ―Principles of Biochemistry‖, Worth Publishers, 2º edición.

2. D. Voet, JG Voet, CW Pratt. ―Fundamentos de Bioquímica‖. Editorial Médica Panamericana. 2ª

Ed.Bioquímica, Madrid, 2007.
3. Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.

4. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275).

5. Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum proteins by means of the biuret
reaction. J Biol Chem. 177: 751–766.

6. Determinación de proteínas por el método de Lowry. (Online)

https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf (Consultada el 15 de Octubre de 2017).
Práctica 5. Fraccionamiento de proteínas de la leche por punto isoeléctrico y
precipitación salina

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2 personas) 4 horas

OBJETIVOS
 Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de proteínas hidrosolubles en solución acuosa.
 Separar proteínas de una solución acuosa de proteínas hidrosolubles utilizando precipitación salina.
 Cuantificar la concentración de proteínas en diferentes fracciones de leche entera bovina.

Conceptos relacionados:

Proteína Caseína, contenido proteico de la leche, hidrólisis enzimática, desnaturalización de proteínas.

FUNDAMENTO TEÓRICO
La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la
leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche,
se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha
denominado caseinógeno. La tabla 1 recoge el contenido de esta proteína en la leche de distintas
especies de mamíferos.

Tabla 1. Contenido proteico y caseínico de la leche de algunas especies animales

Especie animal
Componente
Humana Bovina Ovina Caprina

Proteínas (% del total lácteo) 1.3-1.5 3.2-3.5 5.4-6.0 3.1-4.0

Caseínas (% del total proteico) 44.9 82.5 84.8 81.3

Características de las caseínas

Las caseínas son un conjunto heterogéneo de aminoácidos por lo que es difícil fijar una definición. Sin
embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica
común: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4.6. Por ello, a la caseína también se le suele
denominar proteína insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las proteínas que se denominan
caseínas son específicas de cada especie, se clasifican en los siguientes grandes grupos de acuerdo con
su movilidad electroforética: αs1-caseína, αs2-caseína, β-caseína y κ-caseína (véase la Figura 1). Esta
última es de especial interés en la industria quesera, ya que su hidrólisis enzimática por el cuajo (la
enzima quimosina) genera una nueva proteína, denominada para-κ-caseína. Cuando esta última
reacciona con el calcio genera p-caseinato de calcio. Durante el proceso de maduración del queso, y
a partir de la para-κ-caseína, se forman unos macropéptidos denominados γ-caseínas, responsables
de las características reológicas y organolépticas de los quesos.

Figura 1. Patrón de electroforesis que se obtienen con las

proteínas lácteas. Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2:
Proteínas procedentes de las especies humanas. Carril 3:
Proteínas procedentes de la especie bovina. (Tomada de Farrell,
et al.)

Química y física de las caseínas

A diferencia de muchas otras proteínas, incluso del queso, las caseínas no precipitan por acción del
calor. Por el contrario, precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los
mamíferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracaseína. Si la precipitación se
realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. En la elaboración de los quesos tienen lugar
ambos tipos de precipitaciones.
Cuando se emplea la enzima tripsina, la caseína se hidroliza a una molécula fosfatada llamada pepto.
Las características de las caseínas de la leche de vaca se resumen en la tabla 2. La secuencia
aminoacídica de la caseína contiene un número inusual de residuos del aminoácido prolina: entre 10
en la α-s2-caseína y 35 en la β-caseína. Como resultado, las caseínas son relativamente hidrofóbicas
(poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien definidas. En la leche se
encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas
hidrofílicas en el exterior e hidrófobicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones
de calcio e interacciones hidrofóbicas.
Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las proteínas lácteas mediante su
precipitación, es que su punto isoeléctrico (pI) promedio es de 4.6. A este pH, las caseínas se
encuentran en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones
intermoleculares, por lo que precipitan. Ahora bien, el pI es diferente para cada una de las fracciones
caseínicas, ya que varía entre 4.44-4.97 para la α-s1-caseína y el 5.3-5.8 en la variante genética B de
la κ-caseína.

Tabla 2. Algunas características fisicoquímicas de las caseínas bovinas

Caseína
Característica
αs1 αs2 β κ

Concentración en leche (g/L) 12-15 3-4 9-11 2-4

Variantes genéticas ByC A A1 y A2 AyB
Masa molecular (Dalton) 23545- 25226 23983-24023 19006-
23615 19037
Punto isoeléctrico (pI) 4.44-4.76 … 4.83-5.07 5.45-5.77
Restos de aminoácidos (no) 199 207 209 169
Por otra parte, cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se
dice que presenta una estructura nativa (Figura 2). Se llama desnaturalización de las proteínas a la
pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero sin ninguna estructura tridimensional fija.

Estado nativo Estado desnaturalizado

Figura 2. Estados de una proteína.

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes.
Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica).
Como en algunos casos el fenómeno de desnaturalización es reversible, es posible precipitar
proteínas de manera selectiva mediante cambios en:
1. La polaridad del disolvente
 2. La fuerza iónica
3. El pH
4. La temperatura
Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad
en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la
neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno
facilitarán la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser
consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.
La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una
fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una
sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-H2O porque remueve la
capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de
las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las
proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas
particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal
fin, a causa de su gran solubilidad (70.6 g de sulfato de amonio/100 mL de agua a una temperatura de
20°C) y porque el ion sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. La adición gradual de
ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no
desnaturalizadas.

MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos

Tubos de centrífuga Reactivo de Bradford

Tubos de ensayo Reactivo de Biuret
Micropipetas Solución sulfato de amonio saturada
Vaso de precipitados Leche (40 mL, leche entera
Papel filtro
Embudo Büchner
Erlenmeyer con desprendimiento lateral
Bomba de vacío
pH-metro
Centrífuga
Espectrofotómetro
PROCEDIMIENTO

1. Determinación de las proteínas totales en la leche.

1. En un tubo de ensayo tome 1 mL de agua destilada y adicione 1.0 mL del reactivo de Bradford.
Mezcle bien y calibre el espectrofotómetro. Si la determinación de proteínas se va a realizar por el
método de Biuret, tome 500 μL de agua destilada y adicione 750 μL del reactivo de Biuret.
Mezcle bien y calibre el espectrofotómetro a cero.
2. En otro tubo de ensayo realice una dilución 1:100 de la muestra de leche (990 μL de agua + 10
μL de leche). De la dilución tomar 50 μL y mezclar con 950 μL de agua destilada y 1.0 mL del
reactivo Bradford. Espere por 2 minutos y mida la absorbancia a una λ =595nm. Tenga en
cuenta la curva de calibración que obtuvo en la práctica de cuantificación de proteínas. Si la
absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga una dilución mayor hasta que tenga un valor
de absorbancia en el rango de la curva de calibración. Para realizar las diluciones use la fórmula
V1C1=V2C2. Anote los datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para multiplicar por
el factor de dilución cuando vaya a calcular la concentración de las proteínas totales de la leche.
3. Si la determinación de las proteínas de la leche se va a realizar por el método de Biuret, realizar
una dilución 1:40 de la muestra (975 μL de agua + 25 μL de leche). De la dilución tomar 500 μL
y 750 μL del reactivo Biuret. Mezcle bien, caliente por 5 minutos a 37°C y mida la absorbancia a
una λ =545nm. Tenga en cuenta la curva de calibración que obtuvo en la práctica anterior
utilizando el reactivo de Biuret. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga una
dilución mayor hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de calibración.
Para realizar las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. Anote los datos de las diluciones para que
los tenga en cuenta multiplicar por el factor de dilución cuando vaya a calcular la concentración de
las proteínas totales de la leche.

1. Fraccionamiento de las proteínas de la leche.

a) Precipitación de caseína por punto isoeléctrico

1. Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitado y mida el pH.
2. Agregue lentamente pequeñas alícuotas de HCl, agite (con agitación magnética), hasta obtener un
pH de 4.7. Registre las observaciones del efecto del pH sobre las propiedades de la leche
(suspensión de proteínas en agua).
3. Pese el papel de filtro y filtre al vacío usando un embudo Büchner. Someta a sequedad el sólido
obtenido (caseínas) junto con el papel filtro a una temperatura no mayor a 50°C durante 24
horas. Deje enfriar a temperatura ambiente y determine el peso de las caseínas. Tenga en cuenta
este peso para determinar la concentración de caseínas totales en la leche (%).
4. Mida el volumen del sobrenadante y téngalo en cuenta para determinar el porcentaje de las
proteínas de la leche que son solubles a pH 4.7.

b) Determinación de la concentración de proteínas solubles (presentes en el sobrenadante)

1. Realice una dilución 1:100 de las proteínas solubles (sobrenadante). Tome 50 μL de la dilución y
repita el procedimiento para cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Tenga en
cuenta la curva de calibración que se obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a
los valores de la curva, haga diluciones hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la
curva de calibración y tenga en cuenta estos datos para calcular la concentración de proteínas
solubles totales en la leche (mg/mL). Si se utiliza el reactivo de Biuret, realizar una dilución 1:40
de las proteínas solubles y siga el procedimiento descrito para la cuantificación de proteínas por
éste método.

2. Precipitación salina de las proteínas solubles.

1. Realizar la precipitación de las proteínas solubles (presentes en el sobrenadante) con Sulfato de
amonio (NH4)2SO4 al 20%, 40%, 60% y 80%. A cada grupo se le asignará dos concentraciones
salinas.
2. Para realizar la precipitación salina obtenga el cálculo del volumen de (NH4)2SO4 y de proteínas
solubles teniendo en cuenta un volumen final de 7.0 mL. Por ejemplo si le correspondió el
porcentaje de (NH4)2SO4 al 20%, realizar el cálculo así:
( )
( )( )
( )
( )
3. Adicionar 1.4 mL de solución de (NH4)2SO4 a 5.6 mL de proteínas solubles.
4. Centrifugue a 7500 rpm por 15 minutos y observe si se forma un pellet. Pese el pellet (si es
posible) y mida el volumen del sobrenadante.
5. Tome el volumen del sobrenadante y determine la concentración de proteína por cualquiera de
los métodos (Bradford o Biuret), como se ha descrito anteriormente. Tenga en cuenta si debe
realizar diluciones.
6. Presente los datos de concentración de proteínas totales, proteínas solubles a pH 4.7 y proteínas
en el sobrenadante de las precipitaciones utilizando 20%, 40%, 60% y 80%, según el porcentaje
que le correspondió.
7. Incluya los cálculos que realizó para obtener las diferentes concentraciones de proteínas (tenga en
cuenta el factor de dilución).
8. Especifique las proteínas presentes en el sobrenadante de la precipitación a pH 4.7 y justifique su
presencia.
9. Mencione qué proteínas estarían presentes en cada uno de los sobrenadantes de la precipitación
salina con Sulfato de amonio. Explique el porqué de los resultados.
10. Haga un análisis y discusión de los resultados.

Disposición final de los residuos generados en la práctica:

Los residuos químicos generados en la práctica de laboratorio deben ser descartados en el recipiente
apropiado, rotulado de acuerdo al tipo de sustancia.

CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. ¿Qué es desnaturalización de una proteína?
2. Consulte las aplicaciones alimenticias e industriales de la caseína.
3. Consulte el pI para las proteínas Lactoferrina, albúmina sérica bovina, α-Lactoalbúmina y β-
Lactoalbúmina de la leche. Explique por qué estas proteínas no precipitan a pH 4.7.
4. ¿Qué tipo de proteínas son las proteínas de la leche, solubles a pH de 4.7?
5. ¿Qué otros métodos, diferentes a la precipitación salina, se pude usar para la precipitación de
proteínas?
6. Se ha encontrado que durante la digestión de la caseína y proteínas del suero de la leche, se
pueden generar ciertos péptidos con actividad biológica. Consulte algunos de ellos especificando
su origen, forma de absorción intestinal e importancia biológica para el ser humano.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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