GUÍA DE PROCEDIMIENTOS Y PROTOCOLOS

GENÉTICOS DE ESPECIES MARINAS

Autores: Javier Quinteiro, Pablo Manent, Patricia Assunção

Coordinación: Nieves González, Manuel Rey-Méndez
 ÍNDICE

Investigadores/laboratorios participantes en la guía......................................... 2

Objetivo de la guía...................................................................................... 3

Recolección de muestras.............................................................................. 4

Aislamiento de ADN..................................................................................... 8

Protocolos de los kits EZNA de la casa comercial Omega Bio-Tek..................... 8

I.Protocolo detallado usando kit EZNA Mollusc DNA Isolation Kit................. 11

II.Protocolo detallado usando EZNA Tissue kit......................................... 13

Protocolo de extracción para fanerógamas marinas (Método modificado CTAB)....15

Protocolo de extracción de ADN para microalgas (Método CHELEX)................ 17

Análisis electroforético y cuantificación......................................................... 18

Protocolo detallado de visualización de ADN aislado..................................... 18

Protocolo detallado de cuantificación de ADN aislado................................... 20

Reacción de amplificación o PCR.................................................................. 22

Secuenciación de productos de PCR............................................................. 30

Bibliografía............................................................................................... 35

1
INVESTIGADORES Y LABORATORIOS DE LA RED BANGEMAC QUE HAN
CONTRIBUIDO A LA REALIZACIÓN DE ESTA GUÍA:

Dr. Javier Quinteiro

Dpto. Bioquímica e Bioloxía Molecular; Universidad de Santiago de Compostela

(USC)

CIBUS Planta 3. Lab.4. Avda. Lope Gómez de Marzoa s/n. 15782- Santiago de
Compostela, A Coruña. Galicia, Spain

Ldo. Pablo Manent

Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM)

Carretera de Taliarte s/n. CP:35200. Apdo correos 56.Taliarte. Telde- Gran

Canaria, Spain

Dra. Patrícia Assunção

Dpto. de Biotecnología; División de Investigación y Desarrollo Tecnológico;

Instituto Tecnológico de Canarias (ITC)

Playa de Pozo Izquierdo, s/n. 35119 - Santa Lucía - Gran Canaria, Spain

2
 OBJETIVO DE LA GUÍA

La finalidad del proyecto BANGEN es promover el desarrollo y uso de las

Metodologías de Biología Molecular, basadas en el análisis de ADN, con la finalidad
de establecer estrategias de rápida respuesta en la investigación de organismos
marinos y gestión de la biodiversidad, así como establecer la red de colaboración
y transferencia científico-tecnológica BANGEMAC entre el espacio macaronésico.
BANGEMAC pretende articular una red de sinergias que permita maximizar
los recursos regionales destinados a la preservación de la biodiversidad y la
planificación común de los recursos naturales.

Actualmente, la red de socios que desde el año 2009 están interesados en

desarrollar un sistema integrado de transferencia de información transnacional, a
través de la red BANGEMAC, está formada por diversas instituciones como son el
Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) y el Instituto Tecnológico de Canarias
(ITC) en las Islas Canarias, la Universidade dos Açores en Azores (UA) y la Câmara
Municipal do Funchal (CMF), el Museu Municipal de História Natural do Funchal
(MMF) y la Estação de Biologia Marinha do Funchal (EBMF) en Madeira.

Uno de los fundamentos esenciales que alimentan a la red es la obtención de

datos genéticos. Así, una optimización continuada de las metodologías de trabajo
de laboratorio que permitan eliminar errores y agilizar la generación de datos
genéticos es un hito importante. Por lo tanto, en el marco de la red BANGEMAC,
compartir las experiencias prácticas de los laboratorios vinculados a la red permitirá
mejorar y actualizar los trabajos técnicos de un modo continuado por un lado; y por
otro, acelerar la estandarización de métodos de trabajo ya optimizados, facilitando
las condiciones de trabajo práctico. Así, el presente manuscrito pretende servir
como una guía de trabajo técnico en el que se detallan las diversas metodologías
utilizadas en los laboratorios vinculados a BANGEMAC.

3
Recolección de muestras

El primer paso en la mayoría de los trabajos de investigación en biología es la

recolección de los especímenes del medio físico en el que viven. Un especimen
es un organismo individual examinado por un taxónomo el cual, a través de
caracteres merísticos observados, consigue llegar al reconocimiento de la
especie. Una muestra, en general, se refiere a una cantidad limitada de algo que
intenta ser similar o representar una cantidad mayor de ese algo. En genética de
poblaciones por ejemplo, una muestra representa un subconjunto de alelos de los
individuos muestreados, representativos de una unidad de muestreo (ya sea en
un área definida, población, región, etc...). A efectos prácticos, a lo largo de la
guía se entenderá el especimen como el organismo entero, que tendrá un valor
taxonómico, y la muestra corresponderá a la porción de tejido de esos especímenes
conservada, de la que se utilizará un fragmento para la extracción de su ADN.

Las fuentes que suministran especímenes y muestras al banco pueden ser

diversas y, en todo momento, deberán intentar aprovechar especímenes ya
recolectados por varios motivos: logística aparatosa, riesgos condicionados por el
medio marino y sacrificios innecesarios en las poblaciones naturales. Así, siempre
que sea posible, se priorizará la obtención de muestras capturadas en campañas
de muestreo de especies marinas de entidades colaboradoras, colecciones de
museos, mercados locales, etc. No obstante, las muestras suministradas a la red
BANGEMAC deben corresponder a especímenes que, por definición, deben estar
correctamente identificados por taxónomos especializados.

Por un lado, a efectos de obtener una representatividad genética de la

biodiversidad marina de los archipiélagos macaronésicos y que conformarán
el banco de datos genético, serán necesarios un mínimo de 5 y máximo de 10
especímenes. Por otro lado, cuando se realicen estudios de genética de poblaciones
sobre especies concretas como son, por ejemplo, las 5 especies objetivo del
proyecto BANGEN: Sparisoma cretense, Octopus vulgaris, Megabalanus azoricus,
Grapsus adcensionis y Plesionika edwardsii; se ha decidido recolectar 50 individuos
de cada archipiélago, tratando de cubrir el máximo número de islas para intentar

4
capturar el máximo de variación genética inducida por la insularidad.

Dependiendo de la especie objetivo de estudio se ajustan las condiciones de

muestreo:

—— Artes de pesca

—— Localización geográfica

—— Época de muestreo

—— Materiales de almacenamiento y preservación

Cada uno de los especímenes, a partir de cuyas muestras se aislará el ADN total, será
caracterizado morfológicamente, fotografiado, y serán recogidos todos los datos de
interés (fecha y posición geográfica de captura, caracteres merísticos de valor
taxonómico, peso, partes de procedencia, etc.). El registro fotográfico es importante
debido a que el medio de conservación puede hacer que se pierdan caracteres
taxonómicos importantes como la coloración, que podrían ser esenciales para una
posible confirmación taxonómica posterior.

En el contexto del trabajo de muestreo, en las difíciles condiciones del medio

marino, se ha mostrado como una eficiente metodología la preservación de cada
muestra en etanol absoluto a temperatura ambiente. Para ello, necesitaremos
retirar una porción de tejido de cada especimen muestreado, aunque se deberá
tener especial atención para evitar la contaminación entre especímenes. Por lo
tanto, la preparación de tejidos para su uso en investigación molecular debe
ser protocolizada y estandarizada. El técnico responsable de las colecciones de
tejidos y/o encargado de la preparación de muestras para su posterior procesado
genético, SIEMPRE deberá usar guantes que impidan la contaminación humana
en primer lugar. Además, los utensilios necesarios como tijeras, pinzas o bisturís
serán siempre limpiados de restos del especimen anterior con papel de laboratorio
y posteriormente esterilizados, empapándolos en alcohol 95% y quemándolos
seguidamente, antes de retirar una nueva porción de tejido. Una vez en el
laboratorio, estas muestras (idealmente muestras de tejidos musculares) serán

5
debidamente codificadas (ver abajo) y almacenadas en etanol absoluto (o 95%),
en viales con rosca de 2 mL, etiquetados y en congelación (-20ºC).

El fin de la codificación de cada tubo (Fig. 1) es facilitar su posterior reconocimiento

en el laboratorio y en la base de datos general, así como en la matriz de datos
de secuencia creada para los análisis estadísticos pertinentes. El código estará
formado por 3 partes sucesivas: 4 letras para definir a la especie (la primera
correspondiente a la inicial del género y las tres siguientes a las tres primeras
letras del epíteto específico), el número de individuo para cada especie, la
inicial del archipiélago y la inicial de la isla donde se recolectó el individuo y el
número de muestreo, por si los hubiera en años posteriores a lo largo del estudio.
Así, por ejemplo MAZO001CC1 se interpretaría del siguiente modo: MAZO: la
especie, Megabalanus azoricus; 001: el individuo 001; C: el archipiélago dónde
se recolectó, Canarias; C: la isla, Gran Canaria.

Figura 1: Ilustración del tubo de 2 ml donde se almacenan las muestras en etanol

95% a -20ºC. Puede observarse el código completo en el lateral del tubo y resumido

en la parte superior de la tapa.

Los datos (información y fotografía) de cada muestra, son codificados y

almacenados en una base de datos (Fig. 2), permitiendo la rápida documentación
de una muestra; cuya disponibilidad online, compartida por los investigadores,
permite una actualización, consulta y edición eficiente.

6
Figura 2: Imagen de la base de datos online de la red BANGEMAC en la que se

pueden tanto actualizar las variables como incorporar nuevas, lo que permite un

enriquecimiento continuo del sistema y que puede ser consultado por cualquier

usuario público.

7
Aislamiento de ADN

Brevemente, el aislamiento consiste en la extracción del ADN genómico total

disuelto, a partir de tejido animal y a través de dos pasos clave. El primero,
es la rotura de las membranas nuclear y mitocondrial, consiguiendo liberar el
ADN, y el segundo la precipitación del mismo. Una vez finalizada la extracción,
la electroforesis en gel de agarosa al 1%, permite visualizar las bandas de ADN
genómico y cuantificar aproximadamente el tamaño del ADN obtenido, por
comparación directa con un marcador cuyo tamaño de bandas es previamente
conocido, y la cantidad, con base en la intensidad de la banda en el gel. La
visualización es posible gracias al uso de marcadores como el bromuro de etidio,
capaces de emitir fluorescencia bajo luz UV.

Hay diversas formas de extracción de ADN, con recetas particulares y protocolos

caseros de laboratorios. Además, en el mercado, se encuentran diversos kits de
extracción de ADN, normalmente más rápidos y menos agresivos que los protocolos
tradicionales, y que suelen ofrecer un óptimo rendimiento. El método “casero” es
más laborioso y lento, aunque más económico. Sin embargo, ambos ofrecen un
rendimiento de trabajo parecido. Por lo tanto, dependiendo de la naturaleza de
la especie, se selecciona el protocolo de aislamiento de ADN total más adecuado.

Para los estudios llevados a cabo por la red BANGEMAC en el marco del proyecto
BANGEN, han sido evaluados los siguientes protocolos, mostrando su eficiencia en
diversas especies de moluscos, peces y crustáceos.

Protocolos de los kits EZNA de la casa comercial Omega Bio-Tek

Los protocolos detallados de los dos kits Omega Bio-Tek: EZNA Mollusc DNA
Isolation Kit y EZNA Tissue kit, se especifican abajo, pero ambos parten de
puntos comunes, que serán abordados a continuación, y que deberán ser
realizados igualmente tanto si usamos el primero como el segundo kit.

8
 MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS EN LOS KITS

—— Guantes

—— Papel de aluminio.

—— Alcohol absoluto

—— Cloroformo

—— Alcohol isoamílico

—— 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL por cada muestra

—— Microcentrífuga de sobremesa

—— Vórtex

—— Micropipetas de 20, 200 μL y 1000 μL, y puntas desechables

—— Gradilla

—— Tampón de digestión del Kit E.Z.N.A.

Codificar los tubos estériles de 1,5 µL con el código de muestra. Colocar papel
de aluminio en una balanza de precisión (debe obtener 4 decimales) para pesar
el tejido de cada muestra. Luego, con puntas y pinzas estériles, tomar unos
20-30 mg de tejido homogéneo, de alrededor de 5 mm3 aproximadamente, e
incluirlo en un tubo de 1,5 mL. Disgregar el tejido en pequeñas piezas usando
la punta. Añadir 350 µL de tampón de digestión Buffer ML1. Añadir 25 µL de
Proteinasa K y mezclar bien con el vórtex. Incubar a 60ºC como mínimo
30 minutos, o hasta que la mayoría del tejido se ha disuelto (la mayoría de
muestras requieren como mucho 4 horas). El tiempo de incubación varía y
depende de la elasticidad del tejido. Como el tiempo para completar el protocolo
de extracción puede durar 1,5 horas o más, dependiendo del número total de
muestras que se van a procesar, éste es un buen punto para dejar la incubación
durante toda la noche a 60ºC o 37ºC (tiempo indicado por la casa comercial para
producir resultados adecuados).

9
 Tras su digestión se procede a un aislamiento inicial con solventes orgánicos y
CTAB, para la eliminación de mucopolisacáridos que coprecipiten con el ADN. La
fase acuosa se somete a su purificación mediante columnas. EL ADN aislado se
disuelve en 50-200 µL de agua.

Una vez el tejido haya sido digerido, antes de comenzar el protocolo y para
ganar tiempo durante los pasos sucesivos, creemos conveniente preparar
algunos materiales que nos ayudará a seguir la extracción sin contratiempos:

—— Codificar cada tubo estéril de 1,5 µL con el código de cada muestra

que ha sido previamente digerida, y reservarlos para los últimos pasos
de la extracción en los que se captura el ADN en solución.

—— Ensamblar cada columna HiBind en un tubo colector de 2 mL y

codificar la tapa de cada columna con el mismo código que su
respectivo tubo de 1,5 µL anterior. Además, preparar un tubo colector
extra que deberá reponerse durante el protocolo.

—— Verificar que el tampón DNA WASH BUFFER (a utilizar en los pasos 8

y 9), ha sido diluido con etanol absoluto siguiendo las indicaciones de
la casa comercial en función de la referencia del producto adquirido:

—— D3373-00: Añadir 6 mL de etanol absoluto al tampón DNA

Wash Buffer

—— D3373-01: Añadir 60 mL de etanol absoluto al tampón DNA

Wash Buffer

—— D3373-02: Añadir 100 mL de etanol absoluto al tampón DNA

Wash Buffer

10
 I. Protocolo detallado usando kit EZNA Mollusc ADN Isolation Kit
(moluscos y crustáceos)

1. Añadir 350 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y

mezclar cuidadosamente, por inversión del tubo (arriba y abajo)
unos 2 min aproximadamente. Este paso debe realizarse bajo una
campana de flujo laminar.

2. Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min. y recoger

cuidadosamente la parte superior acuosa o sobrenadante
(con 200 μL deberíamos tener suficiente), en un nuevo tubo
estéril de 1,5 mL. Evitar la interfase lechosa, aunque no seamos
capaces de recoger todo el sobrenadante, debido a que contiene
contaminantes e inhibidores. Los restos líquidos de cloroformo
deben ser desechados en contenedores específicos para ello, que
deberán ser almacenados correctamente(1).

3. Añadir un volumen de tampón MBL seguido de 10 μL de

RNasa A, mezclar por vórtex a máxima velocidad 15 segundos.
Incubar a 70ºC 10 minutos.

4. Durante los 10 min de incubación, preparar la columna

HiBind colocándola en un tubo colector de 2 mL, añadiendo 100
μL de tampón Equilibration Buffer (al pipetar apuntar al filtro de la
columna). Centrifugar a 13.000 x g durante 60 segundos. Descartar
el líquido retenido en el tubo.

5. Añadir un volumen (respecto al sobrenadante obtenido) de

etanol absoluto (almacenado a temperatura ambiente) a la
mezcla incubada, y mezclar por vórtex a máxima velocidad 15
segundos(2).

1
Este paso eliminará la mayoría de polisacáridos y proteinas de la solución. Si se ha obtenido
un volumen tan pequeño de sobrenadante que no permite recoger 200 μL, añadir nueva-
mente 200 μL de tampón ML1 a la solución, mezclar por vórtex, centrifugar nuevamente
como arriba y transferir de nuevo la fase superior acuosa al tubo de 1.5 mL previamente
usado.

2
Ejemplo: si hemos recogido 200 μL de sobrenadante, añadir 200 μL de MBL y 200 μL de
etanol absoluto

11
6. Filtrado y adsorción de ADN. Pipetear toda la mezcla del paso
5, incluyendo toda precipitación que podría haberse formado, a la
columna HiBind ensamblada en un tubo de 2 mL y que ya ha sido
previamente preparada (paso 4). Centrifugar a 10.000 x g durante
1 min, descartar el líquido recogido en el tubo colector y reutilizar
el tubo (si fuera necesario repetir este paso pipeteando el resto de
la mezcla y centrifugando como arriba).

7. Lavado de columna. Desechar el tubo colector de 2 mL y

ensamblar la columna en otro nuevo. Añadir 500 μL de tampón HB.
Centrifugar a 10.000 x g durante 30 segundos. Descartar el líquido
filtrado y reutilizar el tubo colector.

8. Primer lavado de ADN. Colocar la columna en el tubo colector

del paso anterior y añadir 700 μL de tampón DNA Wash Buffer
diluido previamente con etanol. Centrifugar 10.000 x g durante 1
min como arriba. Descartar el líquido filtrado y reutilizar el tubo
colector.

9. Segundo lavado de ADN. Repetir el paso 8.

10. Secado de la columna. Reinsertar la columna en el tubo colector

vacío y centrifugar la columna a 15.000 x g durante 2 min. (este
paso es crítico para eliminar trazas de etanol que interferirán con
los pasos siguientes).

11. ADN en solución. Poner la columna en un tubo estéril de 1,5 mL.

Diluir el ADN añadiendo 50 μL del tampón Elution Buffer (o 10 mM
Tris Buffer, PH 9,0), precalentado a 60–70ºC directamente sobre
el filtro de la columna. Dejar empapar 2 minutos a temperatura
ambiente.

12. Elución de ADN. Centrifugar la columna a 10.000 x g durante 1

min. El ADN en solución se obtiene en el tubo de 1,5 mL.

13. Repetir los pasos 11 y 12 hasta completar 100 μL de ADN en

solución.

12
 II. Protocolo detallado a usar en el EZNA Tissue kit

Se utilizan alrededor de 30 mg de cada muestra. En presencia del tampón de

digestión y de proteasa, los tejidos se mantienen con agitación a 55ºC, durante
24 horas.

PRECAUCIÓN: El tampón Buffer BL puede resultar cáustico.

1. Precipitado de restos no digeridos. Centrifugar en microfuga

durante 5 min. a 13.000 x g para precipitar restos celulares
insolubles.

2. Recojer cuidadosamente con micropipeta (200 μL) el

sobrenadante, transfiriéndolo a un nuevo tubo estéril de 1,5 mL,
dejando el precipitado.

3. Añadir 220 μL(3) de tampón Buffer BL y mezclar con vórtex.

Incubar en baño a 70°C durante 10 min.

4. Añadir 220 μL de alcohol absoluto (AA) y mezclar con vórtex.

5. Filtrado y adsorción de ADN. Montar una columna HiBind® ADN

en un tubo de 2 mL. Tranferir con micropipeta (200 μL) el total de
la muestra en la columna. Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min
para unir el ADN.

6. Lavado de columna. Colocar la columna sobre un nuevo tubo

de 2 mL y lavarla añadiendo 500 μL de Buffer HB. Centrifugar a
10.000 x g durante 2 min.

7. Primer lavado de ADN. Colocar la columna sobre un nuevo tubo

de 2 mL y lavarla añadiendo 700 μL de DNA Wash Buffer (WB).
Centrifugar a 10.000 x g durante 2 min.

8. Segundo lavado de ADN. Añadir a la columna de nuevo 700 μL

de DNA Wash Buffer (WB). Centrifugar a 10.000 x g durante 2
min. Descartar el filtrado.
3
Pipetear 2 veces x 110uL lentamente la solución viscosa.

13
9. Secado de la columna. Centrifugar a 13.000 x g durante 3
minutos, la columna con el tubo de 2 mL vacio.

10. ADN en solución. Colocar la columna en un tubo estéril de 1,5

mL y añadir 100 μL de Elution Buffer (EB), precalentado a 70ºC,
dejando durante 3 min. la columna a temperatura ambiente.

11. Elución de ADN. Centrifugar la columna a 13.000 x g durante 2

min. El ADN en solución se obtiene en el tubo de 1,5 mL.

14
 Los siguientes Protocolos de extracción de ADN han sido evaluados, mostrando
su eficiencia en vegetales marinos (microalgas y fanerógamas marinas).

Protocolo de extracción para fanerógamas marinas (Método modificado

CTAB)

Soluciones necesarias:

—— CTAB 2% (m/v)

—— PVP 1 % (m/v)

—— EDTA 0,020 M, pH 8

—— NaCl 1,4 M

—— Tris-HCl 0,1 M, pH 8

—— Mercaptoetanol 0,2 % (v/v)(4)

4
Previamente a la extracción, el material vegetal a usar deberá limpiarse
y estar totalmente seco. Para el limpiado y la obtención de un mejor
rendimiento en la extracción de ADN, la parte basal (zona blanquecina)
de las hojas será el material idóneo por no presentar epífitos. Una vez
limpia la muestra de tejido vegetal, deberá secarse introduciéndola en
una bolsita codificada de cierre hermético con gel de sílice, manteniéndola
el tiempo necesario hasta su total secado. Si el gel de sílice estuviera
saturado de humedad, debe reponerse por otro nuevo. Una manera fácil
para confirmar el secado de la muestra se basa en que la misma esté
“crujiente”.

Protocolo detallado:

1. Colocar cada muestra en un eppendorf estéril y codificado

con el código de la muestra correspondiente.
4
Preferentemente añadir mercaptoetanol a la cantidad de buffer que se usará cada día, ya que
su actividad se deteriora rápidamente con el tiempo.

15
2. Pulverizar las muestras en un homogeneizador automático o
en nitrógeno líquido

3. Añadir 400 µL del tampón CTAB previamente calentado

a 60ºC, e incubar unas 2 horas aproximadamente en un
baño caliente (60ºC), hasta que los tejidos se hayan digerido
totalmente. Homogeneizar invirtiendo los tubos cada 30 min
aproximadamente.

4. Añadir 800 µL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se

homogeneiza invirtiendo los tubos muy suavemente durante 10
min.

5. Centrifugar 10 minutos a 8.000 x g, pipetear con mucho

cuidado la fase acuosa (superior) y dejarla en un nuevo tubo de
1,5 mL (asegurarse de que se ha extraído sólo el líquido superior,
el cloroformo es muy escurridizo y puede contaminar fácilmente
la muestra. Se recomienda pipetear 200 µL aproximadamente).

6. Añadir 200 µL de isopropanol frío (guardado a - 20º C) para

precipitar el ADN. Aunque 30 min pueden precipitar suficiente
ADN, éste es el único paso en el que se puede parar, por lo que se
recomienda dejar a -20ºC toda la noche.

7. Centrifugar 10 min a 16.000 x g, a 4º C; descartar el

sobrenadante y conservar únicamente el pelet con el ADN.
Añadir 500 µL de etanol frío al 70% y agitar ligeramente.

8. Centrifugar 2 min a 8.000 x g, pipetear con cuidado el etanol

y dejar secar el pelet.

9. Añadir 50-100 µL de agua Sigma o TE para disolver el ADN.

16
 Protocolo de extracción de ADN para microalgas (Método CHELEX)

1. Coger de la nevera tubos de 1,5 mL con 300 µL de 10%

Chelex(5). Se coge 1 tubo por muestra.

2. Añadir 50 µL de cultivo (o un poco de cultivo en agar) al tubo

correspondiente.

3. Agitar en el vórtex durante 10-15 seg.

4. Incubar los tubos a 95ºC durante 30 min (con agitación)

5. Agitar en el vórtex durante 10-15 seg (cuidado porque las

tapas de los tubos de 1,5 mL se pueden abrir).

6. Centrifugar 5 min a alta velocidad (>10.000 rpm).

7. El ADN está en el sobrenadante. Pasar el sobrenadante para

otro tubo de 1,5 mL (no coger el Chelex porque es inhibidor de la
PCR).

8. Purificar el sobrenadante. Nuestra experiencia con el Real

Clean Spin kit (REAL, Durviz S.L.U., Valencia, Spain) ha dado
resultados satisfactorios aunque puede servir otro método o kit
de purificación.

9. Congelar a -20ºC.

10. Coger 1-2 µL para la PCR

5
Previamente: pesar 1 g de Chelex [Chelex 100 Molecular Biology Grade Resin. REF: 142-
1253 (BIORAD)] y resuspender en 10 mL de agua desionizada autoclavada (10% chelex).
Hacer alícuotas de 300 µL (hay que agitar frecuentemente en el vórtex mientras se hacen las
alícuotas, pues la resina es muy pesada y va rápidamente al fondo) en eppendorfs estériles
y congelar a -20ºC.

17
Análisis electroforético y cuantificación

El ADN total aislado debe ser caracterizado electroforéticamente para evaluar su

integridad/degradación y cuantificado, estimándose simultáneamente su pureza,
mediante espectrofotometría.

Protocolo detallado de visualización de ADN aislado

Materiales:

—— Guantes

—— Papel de aluminio.

—— Tampón de carga (en tubo 1,5 mL)

—— Horno microondas

—— Marcador de peso molecular

—— Equipo de electroforesis: cubeta, peine, base, fuente de

alimentación.

—— Agarosa

—— Tampón de electroforesis

—— TBE

—— Bromuro de etidio

—— 2 tubos 1,5 mL

PRECAUCIÓN: la manipulación de compuestos que contienen

bromuro de etidio (mutágeno) debe ser cuidadosa, usando guantes para
manipular el gel y los tampones, evitando respirar los vapores del gel fundido.

18
 PRECAUCIÓN: las exposición a la luz UV debe ser evitada mediante
el uso de gafas, guantes y pantallas.

PRECAUCIÓN: la agarosa no debe llegar a ebullición, debe dejarse

en el microondas y no ser agitada para evitar quemaduras.

Preparación del gel de agarosa (1%). Añadir 1 g. de agarosa en 100 mL

de TBE x 1. Se añaden 2 µL de bromuro de etidio (10 mg/mL).

1. Preparación de la muestra. (i) Se pasan 5-10 µL de la solución de

ADN a un nuevo tubo estéril de 1,5 mL y se añaden 2 µL del tampón
de carga, mezclando en vórtex. Otro método: (ii) depositar 2 µL
del tampón de carga por muestra en papel de aluminio o cualquier
superficie plástica. Repetir hasta completar para el número total
de muestras.

2. Carga de la muestra. (i) Se toman 7-10 µL de la solución anterior

y se deposita cuidadosamente en el pocillo correspondiente. (ii)
pipetear 5 µL de la solución de ADN, homogeneizarla con la “gota”
del tampón de carga y, usando la misma punta, recogemos el
volumen total y se deposita cuidadosamente en el pocillo.

3. Carga de un marcador de peso molecular. En un pocillo, se

carga además una muestra de un marcador de peso molecular
(siguiendo los pasos 2 y 3).

4. Electroforesis. Se cierra la cubeta conectándose los electrodos.

Se enciende la fuente de alimentación, llevando a cabo la
electroforesis a 150 V durante 20 min.

5. Visualización. Tras la electroforesis el gel se visualiza sobre un

transiluminador de UV. Las manchas/bandas de ADN poseen una
coloración rojo-naranja, permitiendo estimar su tamaño según la
posición alcanzada tras la migración con respecto a la posición de
las bandas del marcador molecular.

19
 Protocolo detallado de cuantificación de ADN aislado

Materiales:

—— Guantes

—— Papel de aluminio.

—— Espectrofotómetro 260/280 nm

—— Cubeta espectrofotómetro

—— 2 tubos 1,5 mL

—— Micropipeta 20 μL

1. Preparación de la dilución. Para cuantificar el ADN se prepara,

por ejemplo, una dilución de la solución obtenida: 25 μL de la
solución de ADN en 25 μL de agua. (Factor de dilución=2)

2. Medición. Introducir la dilución en la cubeta del espectrofotómetro,

previamente puesto el blanco (25 μL de buffer EB+ 25 μL agua).

3. Determinación de la concentración de ADN en la muestra (2 μL

ADN en 48 μL de H2O).

Absorbancia Cantidad total(7)

Muestra Concentración(6)
260nm en 100 μL

MAZO001CC1 0,056 70 μg/mL 700 μg

6
77

6
50µg/mL x A260 x factor dilución (25).

7
Concentración x volumen.

20
 4. Determinación de la pureza de ADN en la muestra.

Absorbancia Absorbancia Relación(8)

Muestra
260nm 280nm A260/A280

MAZO001CC1 0,056 0,029 1,93

78

8
Entre 1,8 y 2,0.

21
Reacción de amplificación o PCR

El proceso de amplificación se basa en la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR). La enzima polimerasa es la responsable de realizar multitud de copias
de secuencias de ADN, específicas del genoma nuclear y/o mitocondrial, a partir
de un cebador. Para llevar a cabo esta reacción, primero se prepara un “mix” o
“cóctel” de amplificación en el que se añaden todos los ingredientes necesarios
para que la PCR pueda desarrollarse correctamente. Los compuestos genéricos
del cóctel son el tampón de amplificación, MgCl2, dinucleótidos (dNTPs), la enzima
termoestable ADN polimerasa (Taq), los cebadores, agua desionizada y el ADN
extraído previamente. El volumen total por muestra puede oscilar entre los 15-25
μl y los cebadores a utilizar varían en función de la secuencia objeto de análisis.

La técnica de la PCR incluye tres pasos:

(i) La desnaturalización de la doble cadena de ADN, en la que las

dos hebras de la doble cadena se separan completamente,

(ii) La ligación del cebador a las zonas flanqueantes de las regiones

a ser amplificadas. El cebador “reconoce” zonas específicas del
ADN extraído con una secuencia nucleotídica complementaria a
la suya, permitiendo la ligación entre ambas secuencias: la del

cebador y la de la secuencia objetivo del ADN extraído.

(iii)La extensión del cebador en sentido 5’–3’, en la que la Taq

va adicionando bases nucleotídicas a la cadena del cebador en
el extremo 3’, hasta completar la cadena complementaria de la

región objetivo del ADN.

Estos tres pasos constituyen un ciclo completo de amplificación, en el que se

obtiene como producto el doble de copias de ADN de doble cadena de la secuencia
objetivo, que servirán nuevamente de molde para el siguiente ciclo. Así, se repite
este ciclo desnaturalización-ligamiento-extensión un número determinado de
veces (normalmente entre 30 y 40 ciclos) y consecuentemente, el número de
copias aumenta exponencialmente a medida que avanzan los ciclos. El número

22
total de ciclos determinará la producción total de copias de la secuencia objetivo
amplificada. Además de los ciclos anteriormente explicados, para completar un
patrón de PCR se adiciona un paso previo de desnaturalización a 94 ºC durante
3-5 minutos, y otro posterior de extensión final, a 72 ºC también durante 7-10
minutos.

Los cebadores empleados en la PCR son secuencias cortas de nucleótidos (20/30

pb), caracterizadas por poseer elevada afinidad por la zona flanqueante a la región
que se quiere amplificar. Así, la selección de los cebadores dependerá principalmente
de la/s especie/s objeto de estudio, del tipo de marcador (secuenciación de ADN
nuclear o mitocondrial, microsatélites, AFLPs, RAPDs, etc.…) que pretende ser
utilizado en el estudio, y del gen analizado. Una vez realizada la PCR, el producto
obtenido puede ser visualizado en una electroforesis, con gel de agarosa 2–2,5 %,
para verificar el correcto funcionamiento de la PCR y confirmar que el tamaño de
los productos amplificados corresponde con los tamaños esperados.

Para la amplificación se seleccionan fragmentos de diversos genes mitocondriales,

con distintas características y sometidos a distintas presiones evolutivas, con el fin
de maximizar su capacidad de resolución, necesaria para capturar variación en la
región geográfica que comprende BANGEMAC. Para cada grupo de organismos se
selecciona preferentemente un marcador, en función de su utilidad e información
disponible.

A. Genes mitocondriales seleccionados para especies de animales

marinos

I. ARNr 16S

Gen con un elevado grado de conservación a lo largo de la escala evolutiva.

Su uso es adecuado para la resolución de relaciones filogenéticas. De aplicación
generalmente para moluscos y crustáceos.

23
 II. COX1

Representa un gen de uso generalizado, dentro de la iniciativa BOL

(Barcoding Of Life), mostrando una gran capacidad taxonómica a nivel de
especie y con una evolución más rápida que el gen anterior. En consecuencia,
se aplica a la mayoría de las especies consideradas, tanto en estudios a nivel
microevolutivo como macroevolutivo.

III. Región control

La región control es la zona no codificante más amplia del ADN mitocondrial

y se encuentra implicada en la replicación y transcripción del ADN mitocondrial.
Presenta una elevada tasa de mutación con un sesgo hacia la presencia de A+T.
La elevada tasa de mutación la hace adecuada como marcador en estudios
de estructuras poblacionales o en filogenia entre especies íntimamente
relacionadas.

B. Cebadores de utilidad en animales marinos

I. 16S rRNA

Para la amplificación de un fragmento de la subunidad mayor del gen

mitocondrial ARNr 16S han mostrado su utilidad los cebadores 16Sa-5’
(5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) y 16Sb-3’ (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’)
(Palumbi, 1998).

II. COX1

La amplificación de un fragmento del gen COX1 en invertebrados es

generalmente realizada mediante el uso de los cebadores LCO1490 (5’-GGT
CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’) y HCO2198 (5’-TAA ACT TCA GGG

24
TGA CCA AAA ATC A-3’) (Folmer et al., 1994). No obstante, estos cebadores
también han mostrado ser eficientes para especies de peces. También se han
obtenido resultados satisfactorios mediante el uso de los cebadores COL6 (5’-
TYT CHA CAA AYC ATA AAG AYA TYG G-3’) y COH6 (5’- TAD ACT TCD GGR TGD
CCA AAR AAY CA-3’) específicos de crustáceos decápodos (Shubart, 2009).

Para especies de peces, se han obtenido resultados satisfactorios mediante

el uso de los cebadores FishF2 (5’- TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC
-3’) y FishR2 (5’- ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA-3’) (Ward et al.,
2005).

III. Región control

La elevada variabilidad nucleotídica en esta región y la diversa posición de

esta secuencia dentro del ADN mitocondrial en los diversos rangos taxonómicos,
dificulta la existencia de cebadores “universales” para su amplificación.

Una primera estrategia es la utilización de cebadores que hayan mostrado

su eficiencia en taxa relacionados. La segunda aproximación es la definición
del orden génico del taxón implicado y el diseño de cebadores en las zonas
flanqueantes de la región control (Figura 3).

Figura 3. Estrategia de amplificación para la caracterización de la región control en

Megabalanus azoricus, de acuerdo a la secuencia del genoma mitocondrial de

Megabalanus volcano (NC 006293).

25
C. Cebadores de utilidad en vegetales marinos (microalgas)

Región
Secuencia 5’-3’ (Cebadores) Referencia
amplificada

AB28 (GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC) Goff et al.,

ITS
TW81 (GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT) 1994

18Seuk-F (GTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTA) Ferris et al.,

18S rDNA
18Seuk-R (AGGGCAGGGACGTAATCAACG) 2005

D. Reactivos de PCR

Existe una amplia disponibilidad comercial de reactivos de PCR, incluyendo

enzimas y tampones de reacción correspondiente, MgCl2, dinucleótidos y servicios
de síntesis de cebadores.

Enzimas evaluadas positivamente:

I. GoTaq (Promega)

II. AmpliTaq (Applied Biosystems)

E. Condiciones de PCR

Para un juego de cebadores se definen las condiciones ideales de amplificación

que permiten obtener un producto de PCR adecuado para la secuenciación. Se
definen tanto las condiciones de reacción, en particular la concentración de
MgCl2, como el perfil térmico de la PCR.

26
 Tabla 1. Ejemplo de preparación de un “Mix” de PCR.9

Tampón de reacción Green GoTaq Flexi Buffer X1

Magnesio MgCl2 3,5 mM

Mezcla de nucleótidos PCR Nucleotide Mix 0,8 mM

Cebador “forward” 0,2 μM

Cebador “reverse” 0,2 μM

Polimerasa GoTaq DNA Polimerase (8)

0,075 unids./reac.

Agua estéril Milli-Q

Como ejemplo, en muestras de ADN de Megabalanus azoricus, la amplificación

se realizó en un volumen de 12,5 µl de una mezcla constituida por 1,25 µl de
Buffer x 10 Promega; 2,5 mM de MgCl2; 200 µM de cada uno de los dNTPs; 0,2
µM de cada cebador; 0,025 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied
Biosystems) y 20-75 ng de ADN aislado.La reacción se llevó a cabo en un
termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Las condiciones
de amplificación consistieron en una etapa inicial de desnaturalización/activación
enzimática a 94ºC durante 12 minutos seguida de 35 ciclos, cada uno de los
cuales consistió en una desnaturalización a 94ºC durante 20 segundos, fusión
a 50ºC durante 20 segundos y extensión a 60ºC durante 60 segundos y una
etapa final de extensión a 60ºC en 5 minutos. En todas las ocasiones fue llevada
a cabo simultáneamente una reacción de control negativo conteniendo sólo los
reactivos, para verificar la ausencia de contaminación por ADN extraño.

Ejemplo de protocolo detallado de Amplificación

1. Preparación Mix PCRs. Se elabora una mezcla de reacción para

3 reacciones de 25 µL.

5 Unidades/ μL
9

27
 Tabla10 2. Mezcla de reacción para una reacción de 25 µL.

Componente Volumen (µL) X3 reacciones (75µL)

H2O 14,775 44,325

5x Flexi Buffer GoTaq 5 (x1) 15

Mg Cl2 (25mM) 3,5 (3,5 mM) 12,25

dNTPs (100mM) 0,2 (0,8 mM) 0,6

GoTaq (0.5 U/µL) 0,125 (0,625 U) 0,375

Primer For 0,2 (0,16 µM) 0,6

Primer Rev 0,2 (0,16 µM) 0,6

ADN 1(10)
3

2. Se reparten 24 µL del Mix en cada tubo de PCR de 0,2 mL. Se

añade 1 µL del aislado de ADN al tubo 1 y 1 µL de una dilución 1/100
al tubo 2. El tubo 3, no contendrá ADN y será utilizado como control
negativo frente a contaminación.

3. Se colocan los tubos en el termociclador y se arranca el ciclo

correspondiente de PCR:

—— Desnaturalización inicial: 95ºC, 3 min

—— 35 ciclos x:

—— Desnaturalización: 95ºC, 3 min

—— Fusión de cebadores: 55ºC, 40 seg

—— Extensión: 72ºC, 40 seg

F. Verificación PCR

El producto de PCR es verificado mediante la carga de una alícuota de la

reacción en un gel de agarosa al 2–2,5 % (Fig. 4). Se comprueba el tamaño
esperado, su intensidad, la ausencia de amplificaciones inespecíficas, la ausencia

10
A añadir a cada tubo de reacción.

28
de dímeros de cebadores y la ausencia de señal en las reacciones utilizadas
como control negativo (sin ADN molde).

Figura 4. Ejemplo de amplificaciones obtenidas incluyendo un fragmento del gen

mitocondrial COX1 en Megabalanus azoricus.

29
Secuenciación de productos de PCR

1. Purificación

Una vez verificada la obtención del producto de PCR, cualquier resto de

nucleótidos no consumidos y/o cebadores remanentes en el producto de PCR
debe ser eliminado, al poder interferir en la posterior reacción de secuenciación.

Purificación enzimática de los productos de PCR:

La ExoSAP-IT (Amersham-Biosciences) es un producto que utiliza dos

enzimas hidrolíticas, Exonucleasa I y Fosfatasa Alcalina para eliminar esos
restos no deseados y preparar el producto de PCR para el siguiente paso. A
pesar de que el protocolo comercial indica volúmenes mayores, las siguientes
indicaciones han dado resultados satisfactorios reduciéndolo en gran medida.
Añadir 0,5 µL de ExoSAP-IT (USB)(11) a cada reacción. Para incrementar el
volumen a añadir (1 µL) se completa el volumen final con PCR Buffer: 100
reacciones x 1 µL (50 µL ExoSAP-IT + 5 µL PCR Buffer x10 + 45 µL H2O).
También funciona óptimamente usando 1 µL de ExoSAP-IT (USB) en 10 µL de
producto PCR. Luego, en un termociclador incubar a 37ºC durante 30 min.,
seguido de un paso final a 80ºC durante 15 minutos.

2. Reacción de secuenciación

Una vez tenemos el producto de PCR purificado, se lleva a cabo la reacción de

secuenciación en la que las bases nucleotídicas, de las secuencias amplificadas,
quedan marcadas con fluorescencia para poder ser detectadas en el secuenciador.
Para ello el kit comercial BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) ofrece resultados satisfactorios. A pesar de que el fabricante
indica un protocolo a seguir con unos volúmenes específicos que aseguran el
correcto funcionamiento de los reactivos, la modificación de los protocolos del
11
Cat.No.: 78200 (100 reactions): Exonuclase I + Shrimp Alkaline Phosphatase (5µL PCR+2
µL ExoSAP-IT, 370C, 15`, 80C, 15`). Cat. No. USB 78201 (500 reactions).

30
fabricante funciona siempre correctamente, consiguiendo reducir drásticamente
el volumen del Big Dye.

Protocolo:

1. Añadir el ADN template (1-7 µL de producto de PCR) a cada

pocillo, distribuyéndolo en la placa.

2. Cantidad de template a usar de un producto de PCR recomendado

por la casa comercial en función del tamaño esperado de la
secuencia problema:

PCR product template (bp) Quantity (ng)

100-200 1-3

200-500 3-10

500-1000 5-20

1000-2000 10-40

>2000 40-100

3. Mezclar los siguientes componentes por cada reacción de 10µL:

Reagent Quantity
(1µL BigDye Mix + 1µL Seq.
Ready Reaction Mix 2 µL
Buffer)
Template -- µL

Primer 1 µL (3,2 pmoles/µL)

H2O -- µL

Volumen total 10 µL

4. Cycle Sequencing. Programar el siguiente perfil de PCR en un

termociclador: 96ºC, 1’/ (96ºC, 15’’/ 50ºC, 15’’/ 60ºC, 4’’) x 35.

31
3. Purificación de la reacción de secuenciación

La purificación del producto obtenido en la reacción de secuenciación puede

realizarse utilizando el kit comercial BigDye XTerminator Purification Kit (Applied
Biosystems) el cual, a pesar de ser algo más caro que otros kits o protocolos,
es muy simple, rápido y con un óptimo rendimiento. El protocolo siguiente es el
de la casa comercial sin modificar. El kit viene con dos reactivos, XTerminator y
SAM que deben mezclarse y deben guardar unas proporciones entre uno y otro,
proporcionadas por la casa comercial en función del volumen total, que va a estar
condicionado, en parte, por el secuenciador que va a ser usado posteriormente.
En nuestro caso, la red BANGEMAC dispone de un secuenciador automático
ABI3500 (Applied Biosystems), en el que sólo pueden cargarse placas de 96
muestras y el volumen total de producto de la reacción de secuenciación usado
hasta el momento de 10 µL (ver tabla).

Volume/Well (µL)
Plate Type and reaction
XTerminatorTM
Volume/Well SAMTM Solution
Solution
384-well, 5 µL 5 22,5

96-well, 10 µL 10 45

96-well, 20 µL 20 90

La mezcla de estos dos reactivos puede realizarse previamente (PREMIX),

o directamente en la placa de secuenciación donde previamente se han
pipeteado los 10 µL de producto de la reacción de secuenciación. Si se hiciera
una premezcla, se multiplicarían los volúmenes de cada reactivo por el número
de muestras a secuenciar, más algunas extra debido al error de pipeteo. Para
hacer la premezcla, agitar la solución XTerminator en un vórtex, 15 segundos,
a velocidad máxima para que esté bien homogeneizado antes de recoger el
volumen deseado. Posteriormente (o cuando se añada esta solución directamente
en la placa sin premezcla), se recomienda pipetear los 55 µL de la mezcla
(XTerminator + SAM) en cada pocillo de la placa de secuenciación en series de

32
12 muestras máximo (una fila), antes de volver a repetir este pequeño ciclo. La
agitación es fundamental para que la purificación se lleve a cabo correctamente.

PRECAUCIÓN: La solución XTerminator necesita estar muy bien

mezclada, ya sea cuando se hace la premezcla, como cuando se pipetean
ambos directamente en cada muestra. Además, la casa comercial indica
el uso de puntas con una boca más ancha debido a las partículas de esta
solución, para el correcto funcionamiento. Sin embargo, nuestra experiencia
con puntas de pipetas de 1.000 µL ha funcionado bien aunque si el número
de muestras es bajo la primera opción de puntas especiales sería lo correcto
para realizar el premix.

Una vez tengamos la placa completa con la mezcla (XTerminator + SAM) y

el producto de la reacción de secuenciación en cada pocillo, seguimos con los
siguientes pasos para que esté preparada para cargar en el secuenciador:

1. Sellar la placa y colocarla en el agitador a velocidad elevada

(nosotros usamos la Thermo finemixer, FinrPCRSh 2000-
DX sujetando la placa con cinta adhesiva, en la posición 7), a
temperatura ambiente durante 30 minutos

2. Centrifugar a 2.000 x g durante 2 minutos

4. Secuenciación

Actualmente, la red BANGEMAC realiza las secuenciaciones en el secuenciador

automático ABI3500 (Applied Biosystems) de 8 capilares de 50 cm, obtenido
por el Instituto Canario de Ciencias Marinas a través del proyecto BANGEN,
cofinanciado por los fondos FEDER europeos y el Gobierno de Canarias. Este
secuenciador está capacitado para el genotipado de fragmentos como los
microsatélites, AFLPs, etc… y el secuenciado de secuencias de nucleótidos.
Además, puede cargar y analizar de forma continuada 2 placas de 96 pocillos.
El tiempo estimado necesario para secuenciar una placa de 96, en la que se

33
esperan obtener secuencias de hasta 700 nucleótidos, es de unas 12 horas
(60 minutos aproximadamente por columna de la placa, es decir, 8 muestras).
Para secuencias más extensas y hasta un máximo de 1.200 nucleótidos son
necesarios entre 2,45 h y 3 h por cada columna de la placa, lo que hacen un
total de entre 33 y 36 horas.

Figura 5. Secuenciador 3500 (Applied Biosystems).

34
Bibliografía

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B. 360, 1847-1857.

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