ANTIBIOTICE

REZISTENŢA BACTERIANĂ LA ANTIBIOTICE ŞI BIOCIDE

Antibioticele

Definiţie: medicamente cu acţiune antimicrobiană specifică şi selectivă, capabile

să oprească multiplicarea unor microorganisme patogene implicate etiologic în
variate boli şi sindroame infecţioase.
• Sunt substanţe organice provenite exclusiv din metabolismul
microorganismelor,
• Cele care nu sunt produse din metabolism-chimioterapice
• Se obţin pe cale extractivă din actinomicete şi micromicete.
• Unele sunt reproduse prin sinteză chimică sau semisinteză.

Stabilirea sensibilităţii unui germen faţă de un AB

Trebuie determinate:
• concentraţia minimă de AB care în condiţii standard inhibă creşterea
germenului (CMI)( μg/ml).
• concentraţia minimă cu efect bactericid (CMB)( μg/ml).
• timpul de înjumătăţire (T 50%), adică de reducere la jumătatea a
concentraţiei iniţiale de AB. Este obligatorie în cazurile grave!
• Trebuie cunoscut fenomenul de rezistenţă al unor microorganisme la un
anume AB.

Clasificarea antibioticelor
• Clasice şi majore (cele mai des folosite) şi altele noi.
• După specificitatea antimicrobiană: cu spectru larg sau restrâns.
• După structura chimică (unităţile simple ce intră în alcătuirea lor): glucide,
aminoacizi, acizi monocarboxilici inferiori, duble legături (cazul AB
polienice, pentru cele cu acţiune antimicotică).
• După modul de acţiune: asupra biosintezei peretelui celular, biosintezei
proteice, asupra replicării ADN, asup transportului transmembranar.

Tipuri de antibiotice
AB beta-lactamice
• Au denumirea de la structura caracteristică ce conţine inelul beta-lactam (in
albastru, săgeata verde indică locul unde legătura este ruptă de către beta-
lactamazele sintetizate de multe bacterii rezistente la penicilină).
Tipuri de AB beta-lactamice
1. Penicilinele
• penicilina G (produs natural) produs de ciuperca Penicillium chrysogenum
– ampicilina (semi-sintetică)
– amoxicilina (semi-sintetică)
2. Cefalosporinele
Cele mai multe sunt semi-sintetice derivate din secreţia mucegaiului Cephalosporium.
Exemple:
– cephalexin (e.g., Keflex®)
– cefaclor (e.g., Ceclor®)
– cefixime (e.g., Suprax®)
3. Carbapeneme
Exemple:
– meropenem (Merrem®)
– ertapenem (Invanz®)

AB active faţă de germeni Gram+ şi Gram-

Penicilinele
Penicilina este considerată şi astăzi unul din AB majore cu activitate bactericidă şi
bacteriostatică cu toxicitate foarte mică, aproape inexistentă.
Penicilinele naturale: în procesul de biosinteză nedirijată rezultă foarte multe peniciline
cu structură chimică înrudită şi proprietăţi similare, notate fie: F, G, X, K, V, O, fie: I, II,
III, IV.

Obţinerea unui anumit tip de penicilină depinde de:

• Natura microorganismului
• Condiţiile de cultură
• Prezenţa în mediul de cultură a unor substanţe chimice - precursori
Modul de acţiune al AB beta-lactamice
• Toate AB beta-lactamice actionează prin interferenţa cu sinteza peretelui celular
bacterian.
• Peretele celular bacterian este format dintr-un polimer complex numit
peptidoglican. Acesta conţine aminoacizi şi aminozaharuri. Aminozaharurile sunt
de 2 feluri:
• Acid N-acetilglucosaminic (NAG)
• Acid N-acetilmuramic (NAM).
• Aceştia formează un polimer liniar de NAG alternând cu NAM. Sunt legate între
ele prin legături glicozidice între C1 şi C4 (aceasta este legătura atacată de
lizozim).
• AB beta-lactamice se leagă şi inhibă enzimele necesare biosintezei
peptidoglicanului din peretele celular.
• Cu toate că au efect redus în cazul bacteriilor ce nu se divid, sunt letale pentru
cele care se divid şi nu îşi mai pot sintetiza peretele celular care să le protejeze de
şocul osmotic (în jurul lor fiind un mediu hipotonic).
Peniciline cu acţiune prelungită
• Dat fiind că penicilina se elimină rapid şi masiv prin rinichi, pentru a se menţine
în sânge în jur de 0,03 U.I/ml este necesară administrarea în mod ritmic, ceea ce
reprezintă un inconvenient.
• Astfel au apărut penicilinele cu acţiune prelungită: procainpenicilina,
Banzatinpenicilina G (Moldamin).

Peniciline de semisinteză
• Sunt AB care se obţin parţial prin biosinteză cu ajutorul unui microorganism, iar
unele etape din calea biosintetică se realizează pe cale chimică.
• Unele AB sunt modificate prin introducerea de grupări active→AB noi.
• Sunt mai multe categorii de peniciline de semisinteză:
1. Peniciline stabile faţă de penicilinază
Meticilina
Este activă faţă de:
• tulpinile de stafilococ auriu rezistente la Penicilina G
• Streptococi
• Pneumococi
• Haemophilus
• Neisseria
Este inactivă faţă de:
• Enterococcus faecalis
• Bacterii Gram-
Oxacilina
• Este stabilă faţă de aciditatea gastrică, se poate administra oral.
• Este activă faţă de stafilicocii penicilinorezistenţi.
Cloxacilina, dicloxacilina: mai active decât oxacilina.
Flucloxacilina: în infecţii stafilococice şi streptococice.
2. Peniciline stabile în mediu acid
• Sunt similare cu Penicilina V, dar mai rezistente la penicilinaza (ex. feneticilina,
propicilina).
3. Peniciline cu spectru larg de acţiune
• Sunt foarte active împotriva germenilor Gram+ şi Gram-.
Ampicilina
Este activă asupra:
streptococului β şi α-hemolitic,
Pneumococilor,
Enterococilor
Bacterii din genurile Salmonella, Shigella, Neisseria
Amoxicilina
• Activă faţă de coci Gram+, bacili Gram- aerobi, sau anaerobi (Clostridium).
• Este mai rezistentă la mediu acid decât ampicilina.
Pivampicilina
• Se absoarbe mai bine decât ampicilina cu care se aseamănă foarte bine.
Carbencilina
• Are spectru larg de acţiune faţă de germenii Gram+ cât şi faţă de cei Gram-
(E.coli, Proteus).
 • Se utilizează în infecţii urinare determinate de E.coli, Proteus şi în special
Pseudomonas.

Cycloserina
• Cycloserina inhibă sinteza peretelui celular bacterian dar nu în acelaşi fel ca AB
beta-lactamice.
• Cycloserina este un analog al D-alaninei şi blochează incorporarea acesteia în
lanţurile peptidice ale peretelui celular.
• Este produsă tot de actinomicete.

Glicopeptide
• Interferează cu sinteza peretelui celular bacterian în alt mod decât AB beta-
lactamice.
• Vancomicina este foarte utilizată în SUA.
• Se leaga de D-alanine şi previne formarea peptidoglicanului de la nivelul
peretelui celular.
• Se utilizează mult în cazul tratamentului infecţiilor cu bacterii rezistente la
majoritatea AB.

AB care interferează cu subunităţile ribosomilor procariotelor

AB aminoglicozidice
• Sunt produse de actinomicete (bacterii din sol) sau sunt produse de semisinteză
• Streptomicina: Streptomyces griseus
• Kanamicina: Streptomyces kanamiceticus
• Neomicina: Streptomyces fradiae
• Gentamicina: Micromonospora purpurea
Mod de acţiune
• Interferează cu formarea complexului de iniţiere a biosintezei proteice.
• Determină o traducere defectuasă a ARNm.
• Afectează şi robosomii mitocondriilor care sunt de tip procariot.
• Ribosomii de tip eucariot nu sunt afectaţi.

Tetraciclinele
• Sunt produşi naturali ai streptomicetelor din sol sau produse de semisinteză.
• Acţionează asupra subunităţii 30S a ribosomului procariot, intervenind in
biosinteza proteică.

Tipuri:
• clortetraciclina (nume comercial = aureomicină)
• oxytetraciclina (nume comercial = terramicin)
• doxyciclina

Macrolidele, Lincosamidele, Streptograminele

• Acţionează asupra subunităţii 50S a ribosomului procariot şi blochează elongarea
lanţului proteic.
Macrolide
Erythromicina, azithromicina (Zithromax®),
Clarithromicina (Biaxin®) sunt cele mai cunoscute
• Eritromicina este produsă de Streptomyces eritreus.
• Denumirea provine de la nucleul macrolidic.
• Se folosesc în tratamentul pacienţilor cu alergii la peniciline.

Lincosamide
• Primul AB de acest fel a fost produs de actinomicete din sol.
• Un derivat semisintetic numit clindamycin (Cleocin®), este utilizat frecvent
împotriva bacteriilor Gram+, bacteriilor anaerobe, protozoarelor şi pentru
tratamentul malariei.

Streptogramine
• Quinupristin şi dalfopristin sunt comercializate ca o mixtură sub denumirea de
Synercid.
• Această combinaţie reprezintă o mare promisiune pentru tratamentul bacteriilor
rezistente la vancomicină care dau infecţiile nozocomiale.

Aminociclitolii
• Sunt produse tot de actinomicete
• Acţionează tot asupra subunităţii 30S a ribosomului bacterian.
• Spectinomicina (nume comercial = Trobicin) este activă împotriva gonococilor.

Oxazolidinone
• Primul AB din acest grup, linezolid (Zyvox®), a fost aprobat în USA în 2000.
• Are acţiune similară vancomicinei.
• Este activ împotriva multor bacterii Gram+ care au dobândit rezistenţă la AB mai
vechi, ca MRSA.
• Împiedică asamblarea subunităţilor 30S şi 50S ale ribosomului bacterian (nu
afectează ribosomul eucariot), astfel împiedică traducerea.

AB ce blochează topoizomerazele bacteriene

Fluoroquinolone
• Ex: Ciprofloxacin (Cipro®), levofloxacin şi norfloxacin.
• Ciprofloxacinul este preferat pentru tratamentul antraxului.

AB ce acţionează asupra membranelor celulare

Polipeptide

• Cele mai comune sunt polimixinele.

• Se comportă ca nişte detergenţi, mărind permeabilitatea membranelor şi
determină ieşirea conţinutului bacterian în afară.
AB ce blochează ARN polimeraza bacteriană

Rifampicina
• Este un produs de semisinteză.
• Impiedică transcrierea.
• Nu este activă asupra ARN polimerazelor de la eucariote, deoarece are afinitate
mai redusă pentru acestea.

Lipopeptide
• Sunt compuşi naturali ai streptomicetelor.
• Daptomycin (Cubicin®) este activ împotriva bacteriilor Gram+.
• Afectează integritatea membranelor celulare.
• Nu s-a evidenţiat rezistenţă împotriva acestor AB.

Necesitatea de noi AB
• Datorită rezistenţei bacteriene la AB;
• Transformarea speciilor bacetriene nepatogene în patogene;
• Necesitatea de noi AB mai eficiente, mai puţin toxice.

Datorită necesităţilor enorme de antibiotice (AB) anual se descoperă

aproximativ 100-200 de noi AB, pentru care mii de microorganisme sunt testate.
Dintre acestea doar 1-2% din noile AB descoperite sunt adăugate anual în terapie.
Tehnologia ADN poate dezvolta AB noi, unice ca structură, cu activitate
crescută. De asemenea, această tehnologie, poate creşte producţia şi implicit reduce
preţul de cost.

Clonarea prin complementare a genelor pentru biosinteza AB

Biosinteza unui AB poate implica 10-30 enzime diferite, de aceea clonarea

lor este dificil de realizat.
O strategie de izolarea a unui set întreg de enzime implicate în biosinteza
unui AB constă în:
1. transformarea unei sau mai multor tulpini mutante (care nu sunt
capabile să sintetizeze AB) cu ADN dintr-o bancă de clone
construite din ADN cromosomal şi/sau plasmidic de la tipul
sălbatic;
2. transformanţii sunt testaţi pentru sinteza AB;
3. ADN plasmidic de la o singură clonă care completează tulpina
mutantă (furnizează gena funcţională şi produsul genei, asigură
funcţia lipsă), este utilizat pentru hibridizarea ADN, pentru
screeningul unei alte bănci de clone constând din ADN
cromosomal de la tipul sălbatic.

În acest fel, segmentul ADN care este adiacent şi de obicei mai mare decât
ADN iniţial complementar, poate fi identificat şi clonat.
 Dacă genele implicate în biosinteza AB sunt grupate la nivelul ADN
cromosomal, genele adiacente genelor complementare sunt de asemenea, implicate
în biosinteză.
Dacă genele pentru biosinteza AB sunt împrăştiate în grupuri mici în diferite
locaţii pe cromosom, este necesar a avea cel puţin un mutant/cluster de gene pentru
a obţine probe de ADN cu care să se identifice şi să se cloneze restul genelor din acel
cluster.

Alte metode clonare a genelor pentru sinteza AB

Una sau mai multe gene din calea de sinteză sunt identificate şi purificate;
Se determină secvenţa de AA de la capătul N-terminal după care se prepară
probe oligodeoxiribonucleotidice.
Ex. izolarea genei pentru izopenicilin N-sintetaza de la Penicillium
chrysogenum, enzimă cheie în biosinteza penicilinelor, cefalosporinelor şi
cefamicinelor.

Tulpinile de Streptomyces (care există sub formă de filamente), trebuie să

formeze protoplaste pentru transformare. Fără aceasta, nu ar fi posibilă separarea
celulelor transformate de cele netransformate. Pentru transformare, protoplastele
sunt tratate cu PEG.
După transformare protoplastele sunt transferate pe mediu solid pentru a nu
se regenera peretele celular şi apoi repicate pe mediu selectiv ce conţine de obicei,
neomicină sau tiostrepton, care acţionează ca agent de selecţie pentru celulele
transformate.

Sinteza de noi AB

Un AB nou cu proprietăţi unice şi specifice poate fi produs prin manipulare

genetică a genelor implicate în biosinteza AB existente. Cercetările se referă la
consecinţa plasării căilor de biosinteză a 2 AB într-un singur organism.

Ex. Plasmidul pIJ2303 de la Streptomyces purtător a unui fragment ADN

cromosomal de 32,5 kb de la S. coelicolor codifică toate genele pentru enzimele
responsabile de biosinteza AB – actinorhodină (membru al familiei
isochromanequinonelor) (pornind de la acetat).

Plasmidul intact şi porţiuni din plasmid conţinând fragmentul de ADN de

32,5 kb ( ex. pIJ2315) au fost introduse atât în Streptomyces sp. AM-7161, care
produce AM înrudit – medermicină sau în S. violaceoruber B 1140 sau Tü22,
amândouă producând AB înrudite – granaticină şi dihidrogranaticină.

Toate aceste AB funcţionează ca indicatori acido-bazici, conferind mediului

de cultură o culoare caracteristică în dependenţă de pH-ul mediului. pH-ul şi
culoarea depinde de compusul sintetizat.
 Mutanţii parentali de S. coelicolor care nu sunt capabili să producă
actinorhodină, sunt incolori. Apariţia unei noi culori în unele cazuri ca urmare a
transformării tulpinilor de Streptomyces sp. AM-7161, S. violaceoruber B 1140 sau
Tü22 cu un plasmid conţinând fie toate, fie unele dintre genele ce codifică enzimele
care sintetizează actinorhodina, sugerează că un nou AB este produs.

Transformanţii de Streptomyces sp. AM-7161 şi S. violaceoruber B 1140

conţinând pIJ2303, produc antibioticele codificate de ADN plasmidic şi cromosomal.

Dar când S. violaceoruber B 1140 sau Tü22 este transformat cu pIJ2303 se

sintetizează un nou AB – dihidrogranatirhodină, pe lângă actinorhodină.
Când Streptomyces sp. AM-7161 este transformat cu pIJ2315 un al doilea AB
– mederrhodină A este produs.

Aceste AB noi constituie variante structurale minore a antibioticele

preexistente, actinorhodină, medermicină, granaticină şi hidrogranaticină şi probail
apar câd un compus intermediar într-o cale biosintetică acţionează ca substrat
pentru o enzimă din altă cale biosintetică.

Mecanisme de inducere a rezistenţei la AB a bacteriilor

Inactivarea sau modificarea antibioticului

• Ex: inactivarea enzimatică a penicilinei G la unele bacterii penicilin-rezistente.
• Datorită sintezei β-lactamazelor.
2. Alterarea situsului ţintă
• Ex: alterarea PBP-penicilin binding target site la MRSA şi alte bacterii rezistente
la meticilină.
3. Alterarea unei căi metabolice
• Ex: bacterii rezistente la sulfonamide nu necesită PABA (acid para amino
benzoic) – precursor pentru sinteza acidului folic şi a acizilor nucleici şi vor
utiliza acid folic preformat.
4. Reducerea acumulării AB
• Ex: reducerea permeabilităţii pentru AB şi/sau creşterea efluxului activ (pompare
la exterior)→reducerea acumulării AB.

Achiziţionarea rezistenţei

• Transfer orizontal: via conjugare, transducţie, transformare sau via elemente

genetice transpozabile.
• Mutaţii în genomul bacterian.

Multe din genele rezsitenţei sunt plasate pe plasmide şi sunt ancestrale.

• Sunt cunoscute sub denumirea de environmental rezistome-având rol în
rezistenţa faţă de multe biocide.
Diagnosticul molecular al rezistenţei la antibiotice

Identificarea prin PCR a genelor ce codifică rezistenţa la antibiotice

Identificarea integronului Clasa 1 la bacterii

Integronii sunt elemente genetice similare transpozonilor care pot fi deplasaţi d epe u
genom pe altul ducând cu ei elemente genetice (casete) ce codifică rezistenţa la
antibiotice şi sau biocide.
Există mai multe clase de integroni, dar cei din Clasa 1 poartă gene de rezistenţă la
antibiotice şi biocide.