Sumar 

UMF “Carol Davila”, București
Facultatea de Moașe și Asistență Medicală
1. Noțiuni generale 
2. Menținerea liniilor celulare în cultură
LP 04: 3. Crioconservarea liniilor celulare 
Tehnici de culturi celulare 4. Inițierea unei linii celulare
5. Determinarea numărului de celule 
Biologie celulară 
Conf. univ. dr. Maria‐Magdalena MOCANU 6. Contaminarea microbiologică și cross‐
contaminarea 

Măsuri de biosecuritate (1)
Scop: 
Protecția personalului
Protecția culturilor 
==
• Se respectă condițiile de asepsie
(lb gr a = fără, sepsis = infecție)
1. NOȚIUNI GENERALE
• Spațiile de lucru – departe de ferestre 
deschise

3 4

Măsuri de biosecuritate (2) Hota de aer cu flux laminar (1)
• Depozitarea deșeurilor – în  Rol: 
containere pt deșeuri biologice • Permite filtrarea aerului din încăpere 
• Suprafețele de lucru – se curăță și se  furnizează o zonă de lucru cu aer steril 
dezinfectează (alcool etilic 70%) filtre HEPA = high efficiency particle air filter
• Se evită contactul instrumentelor   pot reține 99,97% particule cu dimensiuni 
sau mediilor sterile cu aerul expirat/  mai mari de 0,3 μm; debit = 85 l/min
din camera de lucru  se lucrează 
la hota de aer cu flux laminar

5 6

1
 Hota de aer cu flux laminar (2) Tehnici de sterilizare (1)
Flux orizontal Flux vertical 
• Flambarea 
– Trecerea rapidă și repetată a obiectelor din sticlă 
(gâtul baloanelor, flacoanelor, eprubetelor, 
pipetelor etc.) sau din metal (bisturiu, foarfecă 
etc.) prin flacăra becului de gaz

• Protecție probe • Protecție probe
• Protecție operator
7 8
2012, Mihasan et al, Biologie moleculară

Tehnici de sterilizare (2) Tehnici de sterilizare (3)
• Sterilizarea cu ajutorul etuvei/ sterilizarea  • Autoclavarea – sterilizarea cu ajutorul 
prin căldură uscată  vaporilor de apă aflați sub presiune/ 
– Obiecte din sticlă, metalice sterilizarea prin căldură umedă
– 121 – 180 °C – Majoritatea obiectelor, medii de cultură, obiecte
– 1 sau 2 h   din plastic (PP, polipropilenă; PC, policarbonat; PE, 
polietilenă; HDPE, polietilenă de înaltă densitate) 
– 121 °C, 1 atm, 20‐30 min  inclusiv distrugerea
Etuva (cuptor cu aer cald),  sporilor
aparat metalic format dintr‐o inicintă etanșă, folosit pentru sterilizare, prin menținerea 
obiectelor sau substanțelor la temperatură ridicată – 134 °C, 2 atm, 30‐60 min

9 10

Tehnici de sterilizare (4) Culturi celulare
= menținerea in vitro a celulelor disociate

• Filtrarea  • Sterilizarea cu radiații 

Medii de cultură complexe  ultraviolete
– se denaturează dacă  – Distrugerea 
sunt sterilizate prin  microorganismelor 
căldură  filtrarea =  – Atenție! Nu se 
îndepărtarea fizică a  utilizează când există 
particulelor cu diametrul >  persoane în încăpere  
0,22 μm

11 12
www.lgcstandards‐atcc.org

2
 Tipuri de culturi celulare – animale și 
Aplicații ale culturilor celulare
umane  Activitate intracelulară
(căi de semnalizare, ciclul celular, 
Culturi primare apoptoză, flux de calciu, trafic  Imunologie
(hibridoma, 
vezicular)
– Celule sunt menținute în cultură pt o perioadă  Farmacologie citokine)
(acțiunea M, interacțiuni ligand‐
limitată de timp receptor, metabolismul M și 
rezistența la M) Genomică
– Se obțin de la organisme vii  M, medicamente (analiză genetică, 
transfecții)
– Ex: culturi primare de neuroni (embrioni de 
animale de laborator)  Obținere de produși celulari Inginerie tisulară
(sinteză de proteine,  (izolare de celule 
Culturi continue (permanente)  biotehnologii) stem, producere de 
biomateriale)
Interacțiuni celulare Toxicologie
– Celulele pot prolifera pe timp nedefinit  linii  (adeziune, motilitate, interacțiune  (citotoxicitate, 
celulare imortalizate cu matricea extracelulară,  mutageneză, 
invazivitate) carcinogeneză)
13 14

Condiții de cultură Condiții de cultură
Celule aderente Celule în suspensie 
Culturi de celule în suspensie  Majoritatea liniilor celulare Linii celulare ne‐aderente – ex: celulele 
hematopoietice 
– Celule independente de adeziunea celulară Necesită subcultivarea periodică  Necesită subcultivarea periodică 
– Ușor de întreținut Subcultura – ușor de efectuat, dar 
necesită numărare înainte de subcultivare 
– Ex: celulele hematopoietice  Celulele sunt disociate și detașate de  Nu necesită detașare enzimatică sau
substrat cu ajutorul enzimelor (tripsina)  mecanică 
Culturi de celule aderente (monostrat)  sau mecanic 
Creșterea este limitată de suprafața  Creșterea este limitată de numărul de 
– Celulele sunt atașate de o suprafața  creșterea  vasului de cultură celule în cultură 
celulelor este limitată de suprafața disponibilă  Uneori necesită vase de cultură ce Nu necesită vase de cultură tratate pentru 
furnizează un substrat pentru aderare aderare 
– Sunt accesibile tehnicilor de microscopie 
Utilizate pentru studii de microscopie  Utilizate pentru producerea de proteine, 
citometrie în flux 

15 16

Morfologia celulelor de la mamifere Bănci de celule
Celulele aderente Celule 
asemănătoare 
– Asemănătoare  fibroblastelor 
(fibroblast‐like)
• Fibroblastelor
• Cel. epiteliale
• Cel. endoteliale  Celule 
• Cel. neuronale  asemănătoare 
celulelor epiteliale 
Celulele în suspensie  (epitelial‐like)

– Asemănătoare 
limfoblastelor Celule 
asemănătoare 
limfoblastelor 
(limfoblast‐like)

17 18
Gibco‐Invitrogen 2011, Cree I, Methods in Molecular Biology – Principles of Cancer Cell Culture

3
 Caracteristici ale cultivării celulelor animale, 
umane (1)
Caracteristici ale cultivării celulelor EK (2)

• Celulele aderente necesită atașarea la  • Ser (ser fetal bovin, FBS)
o suprafață pentru a prolifera – Proteine, nutrienți (aminoacizi, glucoză, nucleozide), 
hormoni, etc. 
• Medii de cultură complete – – Se inactivează la 56 °C  îndepărtarea sistemului 
compoziție:   complement și reducerea actiunii citotoxice a 
– Aminoacizi, vitamine; săruri: sodiu,  imunoglobulinelor 
potasiu, magneziu, calciu – mențin  • pH 7,4
osmolaritatea mediului; glucoză;  – CO2 din incubator
hormoni; factori de creștere 
– bicarbonatul de sodiu din mediu de cultură 
– Ex: 
• RPMI 1640 (Roswell Park Memorial 
• Temperatura 37 °C
Institute)  • Umiditate 
• DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  • 5% CO2

19 20

Echipamente necesare în laboratorul  Consumabile necesare în laboratorul 
de culturi celulare de culturi celulare 
• Hotă cu flux laminar • Microscop inversat  • Pipete serologice
• Incubator cu CO2 • Recipient pt depozitarea  • Vase de cultură
• Baie termostatată N2 lichid  • Tuburi sterile (1,5 – 15 – 50 ml) 
• Etuvă/autoclavă • Recipient pt înghețarea  • Seringi sterile
• Frigider (+4 °C) celulelor • Filtre (0,22 μm)
• Culturi celulare • Dezinfectanți 
• Congelator (‐20 °C)
• Hemocitometru  • Containere pt deșeuri 
• Centrifugă 
• Dispozitiv automat de  • Medii de cultură, ser, antibiotice, tripsină/EDTA 
umplere a pipetelor  (etilendiaminătetraacetat de sodiu/ anticoagulant) etc. 

21 22
2005, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, by R. Ian Freshney

Badly arranged work area Suggested layout of the work area

23 24
2005, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, by R. Ian Freshney 2005, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, by R. Ian Freshney

4
 Măsuri de asepsie în laboratorul de 
culturi celulare

• Se utilizează mănuși 
• Se dezinfectează suprafața de lucru și toate obiectele 
care sunt introduse în hotă cu alcool etilic 70%
• Timpul în care recipientele sunt fără capac să fie cât 
mai redus
• Spațiul de lucru este în permanență curat și ordonat 
• La finalizarea lucrului se îndepărtează toate obiectele  2. MENȚINEREA CELULELOR ÎN 
inutile și se curăță suprafața de lucru cu alcool etilic
70%  CULTURĂ

25 26

Vase de cultură  Corelații volum‐suprafață
• Cutii Petri (diametrul: 35, 60, 100 mm) 
• Plăci cu godeuri (6, 12, 24, 96 godeuri) 
• Vase de cultură cu suprafața de 25, 75, 150, 
250 cm^2 (lb engl. flask = sticlă)

27 28
www.sigmaaldrich.com

Schimbarea mediului Schimbarea mediului
• Celulele pot metaboliza substratul • Concentrația celulelor este prea mare 
– Celule în suspensie: 3 x 10^6 celule/ml
• Componentele din  mediu se pot degrada
– Celule în monostrat: confluență mai mare de 70% 
• pH‐ul mediului se modifică; indicator de  • Morfologia celulară este modificată
culoare: fenol roșu  – Vacuolizarea citoplasmei, detașarea celulelor de 
– pH neutru: roz substrat 
– pH acid: portocaliu  galben (pH 6,0‐6,5 – • Raportul volum/suprafață recipient de cultură 
pierderea viabilității) este modificat  
– Optim: 0,2‐0,5 ml/cm^2 – ex: pt T25 = 25 cm^2 se 
utilizează 5 ml 

29 30

5
 Evoluția unei linii celulare Subcultura (pasajul) 
Etape principale:
1. Disocierea celulară 
1. Perioadă de pauză – Celule în suspensie – re‐suspendare 
2. Creștere exponențială – Celule în monostrat – enzimatic (tripsină)
3. Perioadă staționară
2. Diluarea (reducerea nr. de celule)
– Celule în suspensie: 0,2‐1x10^6 celulele/ml
Subcultura  – Celule aderente: 5x10^4 celule/ml sau 1/2, 1/3 etc.
• Ex: 2‐3x/săptămână
3. Adaugare mediu proaspăt: până la 5 ml/T25
4. Incubare: 37 °C, 5% CO2

31 32
2000, Animal Cell Culture, J. Masters, Oxford Univ. Press

Aspecte generale
Scop:
• Depozitarea liniilor celulare pentru realizarea altor 
studii
Substanța crioprotectoare:
• DMSO = dimetilsulfoxid – depozitarea celulelor la 
temperaturi sub ‐70 °C
3. CRIOCONSERVAREA LINIILOR  • Ex: 5% DMSO, 10% FBS, 85% mediu complet
CELULARE Cultura de celule:
• În faza de creștere exponențială 
33 34

Crioconsevarea – etape principale
1. Disocierea celulelor
2. Centrifugarea: 300 xg sau 1500 rpm 
3. Numărarea celulelor ‐ concentrația optimă: 10^6‐
10^7 celule/ml 
4. Etichetarea criotuburilor
5. Adaugarea mediului de crioconservare  și transferul 
suspensiei celulare în criotuburi: 1 ml/criotub 
6. Depozitarea peste noapte la ‐80 °C
7. Depozitarea în azot lichid (‐196 °C) – se pot utiliza  4. INIȚIEREA UNEI LINII CELULARE
pentru mai mulți ani
8. Înregistrarea criotuburilor

35 36

6
 Aspecte generale Inițierea culturii – etape principale
1. Se transferă criotubul din azot lichid în baia 
termostatată 
• Topirea – se efectuează rapid  2. Dezghețarea culturii celulare <60 secunde
3. Curățarea exteriourului criotubului cu 70% 
etanol
• Inițierea culturii – la densitate crescută 
4. Se transferă suspensia celulară în mediu complet
5. Centrifugare 
6. Sedimentul se suspendă în mediu complet și se 
transferă în vasul de cultură 
7. Se verifică la 24 h 

37 38

Numărarea celulelor – hemocitometrul 
(lb. gr. haima = sânge, kytos = celulă, metron = măsura)

5. DETERMINAREA NUMĂRULUI DE 
CELULE 
Improuved Neubauer

39 40
Current protocols în cell biology

Numărarea celulelor – hemocitometrul  Numărarea celulelor – hemocitometrul 

• Calcularea numărului de celule Latura cadran = 1 mm
Înălțime = 0,1 mm
• Se numără celulele din  Media aritmetică a  Volum cadran = 0,1 mm^3
numărului de celule
5 cadrane (1 cadran =  = 0,1 ml = 10^4 μl

16 pătrățele) 
ț 10

• Se numără celulele care 
ating liniile din stânga și 
Volum suspensie  Volum albastru Factor de diluție
de sus ale unui cadran celulară (μL) de tripan (μL)

10 10 2

41 42
www.abcam.com Current protocols în cell biology

7
 Numărarea celulelor – hemocitometrul  Viabilitatea celulară
• Calcularea numărului de celule • Calcul viabilitate celulară 

% 100
Exemplu:

media/cadran = (25+20+19+22+19)/5 = 21
Exemplu:
Nr. celule/ml = 21 x 2 x 10 000 = 420 000 celule/ml
Media celulelor viabile/cadran = (24+19+18+21+18)/5 = 20
Nr. celule/ml = 20 x 2 x 10 000 = 400 000 celule/ml
Nr. total de celule = nr. celule/ml x nr. ml suspensie celulară
% celule viabile = 400 000 celule viabile/ 420 00 celule = 95%
420 000 celule/ml x 10 ml = 4,2 x 10^6 celule 

43 44
Current protocols în cell biology Current protocols în cell biology

Contaminarea microbiologică
Surse de contaminare:
• Nerespectarea regulilor aseptice în manipulare culturilor 
celulare 
• Hote cu flux laminar care nu funcționează corect 
• Incubatoare 
• Sisteme de sterilizare inadecvate 
6. CONTAMINAREA MICROBIOLOGICĂ  • Serul fetal bovin, personalul, alte linii celulare – surse de 
ȘI CROSS‐CONTAMINAREA contaminare pt micoplasma 

45 46
Current protocols în cell biology

Contaminarea microbiologică Contaminarea microbiologică
Consecințe: Contaminarea cu bacterii

• Costuri:  
– timp 
– financiar 
– muncă
• Efecte adverse asupra celulelor în cultură
• Rezultate experimentale eronate 
• Afectarea emoțională (sentiment de jenă) a personalului 
implicat în menținerea aseptică a culturilor de celule 

47 48
Gibco

8
 Contaminarea microbiologică Contaminarea microbiologică
Contaminarea cu drojdii Contaminarea cu micoplasma (bacterii fără perete celular)

Hoechst 33258

• Nu se observă în microscopia optică în câmp luminos
• Reduce rata proliferării
49 • Induce aglutinarea celulelor – suspensii celulare  50
Gibco Gibco

Managementul contaminării 
Cross‐contaminarea 
microbiologice
1. Decontaminarea prin autoclavare a culturii  = procesul prin care celule dintr‐o linie celulară sunt 
infectate și înlocuirea culturii  transferate în mod accidental unei alte linii celulare 
2. Păstrarea culturii (dacă nu poate fi înlocuită)
– Identificarea tipului de microorganism contaminat Evitarea cross‐contaminării:
• Utilizarea de linii celulare direct de la bănci de celule
– Tratamentul cu antibiotice (14 zile) – rata de 
• Respectarea regulilor aseptice de menținere în cultură a 
succes depinde de severitatea infecției
celulelor
– Verificarea culturii – absența contaminării  • Caracterizarea periodică a liniilor celulare 

51 52
Current protocols în cell biology