TEHNICA EFECTUARII PREPARATELOR

Examinarea morfo-functionala a celulelor tumorale se face pe preparate microscopice prelevate de

la niveul tumori si asezate pe o lama de sticla acoperita cu o lamela. Lama pe care se aseaza preparatele
se mai numeste si « lama port-obiect » cu laturi paralele si dimensiuni de 76/26mm si 1.5-2mm grosime.
Lamela care acopera preparatele este din sticla , are forma patrata sau dreptunghiulara, cu dimensiuni
variabile de 18/18, 22/22 sau 22/32mm si o grosime de 0.16-0.18mm.
Proba de studiat este reprezentata de un fragment de tesut sau o cantitate mica dintr-un lichid
corporal, aduse prin sectionare, respectiv etalare la o grosime de cativa microni permitand astfel lumina
microscopului otpic sa strabata proba. In functie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se
clasifica in :
1. Preparate proaspete , temporare sau extemporanee
2. Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amanuntit al celulelor pe piese
fixate si colorate; ele rezista in timp si se pot realiza prin:
a)-metoda efectuarii sectiunilor fine
b)-metoda etalarii materialului biologic in monostrat (frotiu, amprente de organ)
1. Preparatele proaspete, temporare sau extemporanee, le realizam atunci cand vrem sa studiem
structura unui tesut sau organ in stare vie.
In acest scop se recolteaza din organismul animal in timpul vietii (biopsie) un fragment foarte
subtire de organ sau tesut pe care-l disociem pe lama intr-un lichid natural sau artificial, favorabil
mentinerii vietii celulelor in timpul examinarii (plasma, limfa, lichid amniotic, ser fiziologic).
Acoperim apoi preparatul cu o lamela ale carei margini le lipim cu parafina topita, pentru a evita
uscarea tesutului.
Acest tip de preparat se mai foloseste si in studiul culturilor de tesuturi. Pe astfel de preparate
proaspete extemporanee, putem examina celulele sau elementele tesutului respectiv necolorate sau
colorate printr-o metoda numita coloratie vitala.
Coloratia vitala intrebuinteaza diferite substante colorante putin toxice, care nu altereaza viata
celulelor.
Colorantii vitali se impart in :
- Colorantii vitali bazici
- Colorantii vitali acizi
Examenul in stare vie sau proaspata are marele avantaj de a permite studiul celulelor in
viata, de a urmari diferite aspecte functionale ale acestora in desfasurarea lor, de a studia unele
aspecte ale dinamicii celulare.
2. Preparate permanente sau durabil
a)metoda efectuarii sectiunilor fine
Sectiunea este un preparat permanent in care se urmareste mentinerea tesuturilor cat mai
asemanatoare cu aspecutul lor din timpul vietii si durabilitatea in timp.
Obtinerea sectiunilor necesita efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare dintre ei
avand o influenta hotaratoare asupra reusitei finale. In ordinea executarii lor acestia sunt:
-recoltarea
-fixarea
-spalarea
-decalcifierea (in cazul tesuturilor dure)
-includerea
-sectionarea
-aplicarea sectiunilor pe port-obiect
-colorarea
-montarea
-etichetarea
Recoltarea si orientarea pieselor
Fragmentele de organe sau tesuturi recoltate in timpul vietii, (printr-o interventie
chirurgicala, biopsie, sau imediat postmortem, pentru a evita modificarile cadaverice. Piesele
obtinute sunt taiate la o grosime de 2-3 mm si orientate astfel incat sa permita
un studiu cat mai complet.

Recoltarea se face :
-pe o placa de pluta sau PVC
-cu pense fine pentru a nu strivi preparatul
-fasonarea piesei se face cu lame ascutite degresate ( daca tesutul recoltat este moale, de exemplu
SNC, iar fasonarea poate produce strivirea pieselor, se vor fixa fragmente mai mari de tesut, apoi se
fasoneaza).

Fixarea
Are ca scop conservarea constituientilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de cea din timpul
vietii, conservand forma, structura si compozitia chimica precum si raporturile reciproce existente in stare
vie si pregatirea lor in vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare). Fixarea omoara si imobilizeaza
celulele intr-un anume moment al activitatii lor.
Aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituienti ai materiei vii, ceea ce
inseamna ca un bun fixator histologic trebuie sa fie in primul rand un bun fixator al proteinelor.
Mecanismul fixarii proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoaste faptul ca fixatorii histologici
determina o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor si in majoritatea cazurilor un anumit grad de
polimerizare a structurilor organice. O consecinta importanta a acestei coagulari a proteinelor este ca se
realizeaza blocajul reactiilor enzimatice, impiedicand astfel digestia autolitica a tesuturilor.
Fixarea trebuie privita diferit in functie de :
-gradul conservarii morfologice pe care dorim sa-l obtinem : fixarea se realizeaza in mod diferit
pentru microscopia electronica fata de cea fotonica ; in primul caz trebuiesc pastrate relatiile intre
constituientii celulei la scara moleculara.
-de natura constituientilor chimici ce trebuie conservati : anumite structuri macromoleculare sunt
mai usor de conservat (de exemplu proteinele), in timp ce altii sunt foarte labili si dificil de fixat,
(oligozaharidele).
-de volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate : fixarea unui frotiu celular este diferita
de cea a unui organ (de exemplu encefalul) unde patrunderea fixatorului devine elementul esential al
fixarii.
-de tipul reactiilor histochimice sau de culoarea pe care dorim sa le efectuam : fixarea este diferita
cand folosim o coloratie simpla, topografica sau cand incercam decelarea lipidelor sau enzimelor.
Un bun fixator trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :
- sa aiba putere mare de patrundere
-sa produca o cat mai mica retractie a pieselor, evitand modificarea taliei, formei, raporturilor dintre
celule
- sa nu determine aparitia de artefacte, adica modificari ale piesei care nu corespund realitatii
(retractari, umflari, vacuolizari)
- sa confere o anumita consistenta piesei
 - sa permita colorarea pe care dorim sa o efectuam
- sa nu fie toxic pentru cel care il manevreaza
- sa depaseasca piesa ca volum de 30-40 de ori.
Fixarea se face cu agenti fizici sau chimici :
Agentii fizici utilizati : caldura, desicarea sau congelarea
Agentii chimici sunt cel mai frecvent utilizati, fie ca fixatori simpli, fie sub forma de amestecuri
fixatoare.
Reguli generale ale fixarii :
-Evitarea alterarilor autolitice- fixarea trebuie facuta cat mai repede posibil dupa recoltarea
materialului biologic.
-Spalarea fragmentelor, intr-o solutie fiziologica. Nu se foloseste apa, deoarece produce
umflarea tesuturilor.
-Evitarea uscarii tesuturilor, manevrele se fac in mediu umed.
-Facilitarea la maxim a penetrarii fixatorului in organe si tesuturi. Se vor utiliza vase mari,
cu fundul plat si dop rodat, nu se va lasa sange sau mucus la suprafata piesei, se agita din timp in
timp sa nu se lipeasca de peretii flaconului.
-Piesele se introduc in amestecul fixator ambalate in tifon si purtand numar de identificare.
-Durata fixarii, variaza in functie de compozitia agentului fixator, structura, dimensiunea
pieselor.
-Un fixator odata folosit nu se va folosi la fixarea altei piese.
Tratamentul pieselor imediat dupa fixare
Cand se alege un fixator, se are in vedere structura ce va fi studiata, stiind ca anumite
tesuturi si componente celulare implica folosirea anumitor fixatori sau contraindica folosirea
altora.
Pentru glicogen nu se folosesc fixatori aposi.
Pentru fixarea grasimilor nu se folosesc solventi ai acestora.
Spalarea
Este operatiunea in care se opreste fixarea si se indeparteaza excesul de fixator si a unor
eventuale structuri false ce pot apare in preparat datorita unor defecte de fixare.
Se poate face cu diferite substante in functie de fixatorul folosit :
-apa curgatoare pentru formaldehida
-alcool pentru fixatori cu dicromat de potasiu
-alcool absolut pentru fixatorii pe baza de alcool, amestecul Carnoy
La alcoolul in care spalam piesa se adauga in mod obligatoriu si solutie iod iodurata sau
tinctura de iod pentru a se elimina precipitatele pe care le formeaza sublimatul in tesuturi in
timpul fixarii.
Includerea
Este etapa in care piesa , odata fixata, este procesata intr-o forma care sa permita efectuarea
de sectiuni subtiri. Aceasta se realizeaza prin inglobarea si impregnarea pisei cu o substanta
solidificabila, rezultand un bloc cu consistenta solida, omogena.
Cel mai frecvent e utilizata parafina, cu o densitate asemanatoare tesuturilor, ce permite
obtinerea de sectiuni cu grosimi de 3-10microni.
Alte substante folosite : celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronica rasinile
sintetice.
Includerea la parafina- etape :
-deshidratarea
-clarificarea
 -impregnarea cu parafina
-includerea propriu zisa
Deshidratarea este operatiunea in care se indeparteaza apa din piesa. Acest pas este
necesar deooarece parafina nu e solubila in apa.
De obicei de face cu alcool in bai de concentratii succesiv crescute (70%, 95% si 100%). In
acest fel alcoolul inlocuieste treptat apa din tesuturi.
Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie sa fie de aproximativ 10 ori mai mare
decat volumul piesei.
Durata depinde marimea fragmentelor, in medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool.
Ultima baie trebuie sa se faca intotdeauna in alcool absolut nou.
Clarificarea, este operatiunea in care alcoolul din piesa este inlocuit cu o substanta care
are proprietatea de a fi miscibila atat cu alcoolul cat si cu parafina.
Dintre aceste substante mentionam xilenul, benzenul, toluenul, cloroformul. Cel mai folosit
e xilenul.
Clarificarea consta , de asemenea in bai succesive de aceeasi substanta , de obicei 3 bai de
xilen cu durata de 3-6 ore in functie de marimea fragmentului.
La sfarsitul operatiunii de carificare, piesa devine translucida.
Impregnarea la parafina- se utilizeaza parafina cu punct de topire 56°C, care e mentinuta
la aceasta temperatura printr-un termostat.
Se trec piesele prin cel putin 3 bai de parafina pentru a se indeparta orice urma de solvent
din piese.
Includerea propriu –zisa, sau turnarea blocului, consta in inglobarea pieselor in parafina
noua, neutilizata, turnata intr-o forma ; frecvent se folosesc barele paralele Leuckhardt. Piesa se
introduce in parafina topita cu fata care va fi sectionata spre fundul formei. Prin racire la
temperatura camerei blocul se solidifica si va putea fi sectionat.
Exista inconveniente pentru preparatele ce contin mult tesut conjuntiv, care se sectioneaza
greu. Recomandat a se folosi incluziune in celoidina.
Sectionarea
Piesele histologice pot fi sectionate :
a)-imediat dupa fixare, fara a fi incluse
b)-imediat dupa ce au fost incluse
a)Sectionarea piesei neincluse se face in mod curent in urma intaririi ei prin congelare sub
actiunea vaporilor de bixid de carbon, proveniti dintr-o bomba mecanica, pusa in legatura printr-
un ventil cu un microtom special pentru acest scop, numit microtom pentru sectiuni de gheata.
Sectionarea la gheata este foarte expeditiva si este folosita in histologie, in histochimie,
histoenzimologie. Cu ajutorul ei se usureaza punerea in evidenta a unor componenti celulari :
grasimi, enzime, care dispar in metodele de incluziune. Sectiunile sunt in general groase, mai
mari de 10 microni.
b)Sectionarea pieselor incluse la parafina se realizeaza cu ajutorul unui alt tip de microtom.
Acesta are la baza un cutit foarte ascutit prevazut cu un mecanism care se deplaseaza de-a lungul
blocului inclus in parafina, avansand cu o distanta standard. Prin miscarea repetata a blocului in
lungul cutitului se obtin sectiuni seriate, de cativa microni (obisnuit 4-6), care adera una de alta,
formand o panglica.
 Etalarea
Este o operatiune prin care sectiunile se aplica pe lama portobiect bine degresata. Pe lama
de sticla se aplica o picatura de albumina Mayer sau solutie apoasa de gelatina si se intinde bine
de-a lungul lamei.
Din panglica de sectiuni se taie fragmente de 3-4 care se aplica cu fata lucioasa pe
suprafata unsa cu albumina Mayer a lamei. Se picura apa distilata la una din extremitatile
panglicii astfel incat sectiunile sa pluteasca, apoi se aseaza pe o platina incalzitoare, unde, in
cateva secunde, sectiunile se descretesc si se intind complet. Lamele se tin apoi, 24 de ore la
termostat, 37°C, pentru ca sectiunile sa se usuce si sa se lipeasca.
Astfel procesate, preparatele permanente pot fi pastrate necolorate, ferite de praf si lumina
timp indelungat.
Decalcifierea
Pentru a efectua preparate din piese ce contin in ele formatiuni impregnate cu saruri de
calciu, cum sunt oasele sau dintii este necesar dupa fixare sa procedam la decalcifierea acestora.
Dupa fixare, spalam bine piesa in apa curgatoare, respectiv cu alcool, apoi o trecem printr-o
serie de alcooluri cu concentratii crescande pana la 96°, apoi din nou in apa. Apoi se trece la
decalcifiere. Piesele sunt trecute prin cateva bai de solutie decalcifianta pana se demineralizeaza..
Dupa decalcifiere, piesele sunt trecute pentru neutralizare printr-o solutie de sulfat de Na 5%
timp de 24h, apoi bine spalate in apa curgatoare, 48h.
Unii fixatori, Bouin, Zenker, actioneaza si ca solutii decalcificatoare dar doar la piese
foarte mici.
Consideram incheiata decalcificarea cand piesele sunt moi si se pot taia usor.
Dupa decalcificare, piesa e supusa tehnicii de impregnare ca orice alt tesut necalcificat.
Colorarea sectiunilor
Sectiunile piselor incluse in parafina si lipite pe lama, nu pot fi colorate in aceasta stare ,
deoarece solutiile colorante nu le pot patrunde , din cauza parafinei cu care a fost impregnata
piesa in timpul incluziei. De aceea aceste sectiuni trebuiesc in prealabil deparafinate si apoi
hidratate pentru a le face apte de a fi colorate cu diferite substante colorante , care sunt folosite in
majoritatea lor , in solutii apoase.
Deparafinarea, se face prin trecerea lamelor pe care sunt lipite sectiunile , prin 3 bai
successive care contin unul din solventii parafinei amintiti la incluzie, xilen, benzene, toluene,
pentru a elimina parafina.
In fiecare vas cu xilen se va tine lama aproximativ 1, 3 minute. Apoi, lamele sunt trecute
mai departe prin 3 bai de alcool de 96° cu scopul de a elimina solventul parafinei.. In fiecare baie
de alcool, lama va fi lasata 1, 2 minute.
In sfarsit, lamele sunt cufundate intr-un vas cu apa pentru a fi rehidratate sectiunile.
Colorarea propriu zisa, ocupa un loc important in tehnica histologica. In stare vie,
constituientii tisulari , au indici de refractie practic asemanatori, din care cauza la examenul cu
microscopul obisnuit apar omogeni. La fel raman tesuturile si dupa fixare. Principiul coloratiei
histologice este de a folosi substante colorante care se combina in mod selectiv numai cu una sau
o parte din structurile unui tesut , pe care in acest fel le pune in evidenta. Folosirea a doi sau mai
multi coloranti intr-o metoda va da o imagine de ansamblu diferentiata a diferitilor componenti
tisulari.
 Clasificari coloranti
1.Colorantii folositi in histologie sunt de doua feluri dupa modul de obtinere :
-naturali (hematoxilina, colorant de origine vegetala, carminul, colorant de origine
animala)
-artificiali
2.Dupa capacitatea de actiune a gruparilor continute se clasifica in :
-coloranti acizi , care coloreaza structurile celulare cu reactie alcalina, cum sunt
citoplasmele. Exemple : eozina, fuxina acida, orange G, albastrul de anilina, verdele de lumina.
- coloranti bazici, ce coloreaza structurile nucleare. Exemple :albastrul de metil, fuxina
bazica, hemalaunul, albastrul de toluidina.
- coloranti neutri, ce rezulta dintr-un amestec in anumite proportii dintr-un colorant acid
cu unul bazic si coloreaza diferite incluziuni citoplasmatice cu reactie neutra. Exemple :
eozinatul de albastru de metilen.
- coloranti indiferenti, nici acizi ,nici bazici, nnici neutri, ei actionand printr-un fenomen
fizic de absorbtie pe un substrat tisular. Exemple : Sudan III, ce loreaza grasimile in rosu-
portocaliu.
3.Dupa modul in care se realizeaza coloratia se clasifica in :
-coloratii progresive, in care coloratia se face progresiv, urmarind rezultatul
-coloratii regresive, in care se realizeaza supracolorarea, apoi se scoate excesul de colorant
cu ajutorul unor substante diferentiatoare.
4.Dupa numarul colorantilor folositi se clasifica in :
-coloratii simple : presupun folosirea unui singur colorant. Exemple : albastrul de metilen
-coloratii combinate : presupun folosirea a 2-3 coloranti, atat nucleari cat si
citoplasmatici.
5.Dupa modul in care colorantul actioneaza asupra tesuturilor se clasifica in:
-coloranti directi
-coloranti indirecti sau prin mordansare
6.Dupa afinitatea electiva a colorantului pentru anumite structuri tisulare, se clasifica
in:
-ortocromatici, coloreaza structurile in aceeasi culoare cu a lui
-metacromatici, coloreaza structurile in alta culoare

Coloratia hematoxilin-eozina

Solutiile care contin acesti coloranti trebuiesc preparate anterior.

-hematoxilina, 1g
-iodat de potasiu, 0.2g
-alaun de potasiu, 50g
-apa distilata, 1000cc
Se dizolva intai alaunul de potasiu in apa, apoi se adauga hematoxilina si la urma se pune
iodatul de potasiu pentru a grabi oxidarea hematoxilinei. Eozina se foloseste in solutie apoasa de
1%.
 Timpii coloratiei :
Sectiunile deparafinate si hidratate sunt introduse succesiv in :
1. solutie de hemalaun, 5-10 min.
2. spalare in apa 5-10 min.
3. solutie de eozina, 1-2min.
4. spalare in apa distilata, cateva secunde
5. deshidratare in alcool de 90%s si alcool absolut
6. xilen fenicat, pentru clarificare, 5-10 min.
7. clarificare in xilen pur, cateva minute.
8. montare, se pune pe sectiunea colorata si clarificata o picatura de balsam de Canada si se
acopera cu o lamela de marime potrivita.
Rezultate :
1. nuclei, albastru-violet
2. nucleoli, rosu
3. citoplasma, roz
4. granulatiile bazofile, albastriu-violet
5. granulatii acidofile, rosu caramiziu
6. matricea cartilaginoasa si osoasa, roz intens

Coloratie van Giemsa

Sectiunile deparafinate si hidratate sunt introduse succesiv in :

1. solutie de hematoxilină Weigert (2 părţi hematoxilină + 1 parte mordant) - 5 minute

2. spalare in apa 5-10 min
3. diferentiere rapida in alcool-acid clorhidric
4. spalare in apa
5. contrastare în solutie saturata de Li2CO3
6. colorare cu picrofucsină - 2-5 minute
7. spalare
8. deshidratare
9. clarificare
10 . montare

Rezultate :
1. nucleii-negri
2. citoplasma-galben
3.citoplasma-galben