OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS A PARTIR DEL CULTIVO DE LINFOCITOS

HUMANOS.

Stephanie Diaz.

72684.

OBJETIVOS

 Conocer las metodologías citogenéticas relacionadas con las técnicas de cultivo de

linfocitos para la obtención de cromosomas.
 Obtener los cromosomas, organizarlos y clasificarlos para así realizar un cariotipo.

Introducción.

Los cromosomas son estructuras con apariencia de bastoncillo ubicadas dentro del núcleo
de las células de animales y plantas. Cada cromosoma está compuesto de proteínas
combinadas con una sola molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN). Pasado de padres
a descendientes, el ADN contiene las instrucciones específicas que hacen único a cada tipo
de ser vivo. El término cromosoma se origina de las palabras griegas para color (chroma) y
cuerpo (soma). Los científicos dieron este nombre a los cromosomas porque son estructuras
o cuerpos celulares que se tiñen oscuramente con algunos de los tintes utilizados en
laboratorios (Reprogenetics, 2013).

Los primeros 22 pares de cromosomas son los mismos en las mujeres y los hombres y están
ordenados de mayor a menor del 1 al 22. La pareja 23 determina el sexo. La estructura
única de los cromosomas mantiene al ADN enrollado apretadamente alrededor de proteínas
con apariencia de carretes, de hilo llamadas histonas. Para que un organismo crezca y
funcione adecuadamente, las células deben dividirse constantemente y producir nuevas
células que reemplacen a las células viejas y desgastadas, el ADN debe permanecer intacto
y ser distribuido uniformemente entre las células. Los cromosomas son una parte clave del
proceso ya que aseguran que el ADN se copie y distribuya en la gran mayoría de las
divisiones celulares. Cambios en el número o la estructura de los cromosomas en células
nuevas puede resultar en graves problemas de salud o desarrollo (NIH, 2011)

Todos los cromosomas alcanzan en la metafase, su máximo grado de organización,

ordenamiento y compactación. Cada cromosoma metafásico está constituido por dos
cromátides unidas por el centrómero. Este centrómero divide al cromosoma en dos brazos
que se designan p (petit) para el brazo corto y q para el brazo largo. La posición del
centrómero permite clasificar a los cromosomas en tres tipos principales: Metacéntricos:
cuando el centrómero es más o menos central y los brazos son de aproximadamente igual
longitud. Submetacéntricos: cuando el centrómero está alejado del centro y los brazos son
desiguales. Acrocéntricos: cuando el centrómero está cerca de uno de los extremos y uno
de los brazos es muy corto. (UBA,2012)

Fig. 1. Morfología de tres tipos principales de cromosomas humanos.

La citogenética es la rama de la biología que se encarga del estudio de los cromosomas y

sus anomalías. El cariotipo es la constitución cromosómica de un individuo y es un estudio
de rutina en genética médica. Los cariotipos se pueden informar presentando todos los
pares cromosómicos ordenados de acuerdo a su tamaño, que en un principio eran recortados
de la fotografía de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automáticos. De
los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se señala por separado para indicar el sexo del
individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el número total de
cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma.
(UBA, 2012)

Procedimiento.

 Lo primero que se realizo fue la obtención de fitohemaglutinina, a partir de fríjol verde,

a este se le quito la cutícula, se cortó, y se pesaron 10 gramos en balanza, con 20 mL,
de solución salina se macero y se pasó a un vaso de precipitado, se enjuago el mortero
con otros 30 mL de solución salina y se agregó ese residuo a la muestra del vaso
precipitado. Y se llevó la muestra tapada con vinipel a refrigeración por 24 horas.
Después de este tiempo de refrigeración, se decantó en tubo de falcon y se centrifugo a
6.000 rpm por 10 min a 4°C.

 Consiguiente se obtuvo la muestra de sangre, extraída de Jorge y de Julieth, esta sangre

se depositó en un tubo tapa verde, el cual contiene el anticoagulante Heparina, el cual
mantiene la forma de las células.

Para el cultivo de linfocitos, en un frasco de cultivo de células horizontal se agregaron:

 4,0 mL del medio RPMI 1640,  500 landas o microlitros de Suero

 20 landas o microlitros de Fetal Bovino (SFB) al 5-10%
antibiótico
  400 landas o microlitros de  1 mL de sangre heparinizada
fitohemaglutinina

Y se incubo a 37°C durante 96 horas con 90% de humedad relativa.

 Para la cosecha se saco el cultivo y se le agrego 150 microlitros de colchicina y se

incubo a 37°C por 15 minutos. Después se pasó el contenido del cultivo a tubos de
centrifuga de 15 mL y centrifugar a 1.800 rpm por 10 minutos. terminado el tiempo, se
obtiene la separación de células donde los glóbulos rojos quedan suspendidos en la
parte inferior y encima los glóbulos blancos,con pipeta pasteur decantar el
sobrenadante. Se decantó el sobrenadante y se agregaron 5 mL de solución hipotónica
de KCl 0,075M, se invirtió para homogenizar y resuspender el botón celular, y se
incubo por 20 min a 37°C.

 Fase de pre-fijación: se agregó 1 mL de fijador de Carnoy, se agito y se llevó a la

nevera por 20 minutos. Después se centrifugo a 1.800 rpm por 10 min. y se decantó el
sobrenadante con la ayuda de una pipeta pasteur.

 Fase de fijación: se agregó fijador carnoy y se completó a volumen (5 mL), se

resuspendio el botón celular, se homogenizo y se refrigero por 30 min a 4°C. se
centrifugo a 1.800 rpm por 10 min, se retiro el sobrenadante compuesto de restos de
fijador y de glóbulos rojos.

 Fase de lavado: se agregaron 3 mL de fijador, se centrifugo, se retiro el sobrenadante y

se repitio la fase de lavado 3 veces. hasta que el sobrenadante sea completamente claro,
al menos unas 3 veces.

 Coloración de la lámina: La lámina se limpió con alcohol y una gasa, se dejaron caer
dos gotas de las células resuspendidas se dejó que sequaran al medio ambiente y se
flamearon antes de la coloración, la cual fue con Giemsa al 30% p/v, cubriendo el
extendido completamente y dejándolo actuar durante 10 min a temperatura ambiente, se
dejó escurrir la lámina para quitar el exceso de colorante y luego se enjuago con agua
corriente. Se volvió fijar con calor la muestra y se observo en microscopio invertido en
aumento de 40x.

Resultados

Se logró la visualización de los cromosomas, tanto de Jorge como los de Julieth. Los cuales
se observan en las figuras 2 y 3.
Fig. 2. Cultivo de linfocitos, incubados a 37°C durante 96 horas en cámara húmeda.

Fig 3. Cromosomas de Jorge vistos a 40x.

Fig 4. Cromosomas de Julieth vistos a 40x.

Discusión.

Conclusiones

Bibliografía.

 National human genome research institute “NIH”. (2011). Cromosomas. Obtenido

el 4 de abril de 2017. En: https://www.genome.gov/27562611/cromosomas/
 Reprogenetics spain. (2013). ¿que son los cromosomas?. Obtenido el 4 de abril de
2017. En: http://www.reprogenetics.es/index.php/es/2011-08-12-08-07-16/que-son-
los-cromosomas-esp
 Ruth Mélida Sánchez. (2016). Guía práctica de genética. Universidad Colegio
Mayor de Cundinamarca, Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de
Bacteriología y Laboratorio Clínico.
 Universidad de Buenos Aires. (2012). El estudio de los cromosomas humanos.
Obtenido el 4 de abril de 2014. En:
http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica/adm/sg2.pdf