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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. DATOS GENERALES

Título del proyecto: “Efecto protector de las semillas de Theobroma cacao en modelo experimental
animal de Parkinson inducido por 6-hidroxipamina”

Autores (nombres y código de estudiante):

Asesor: Dr. Manuel Leiva Beraún

Institución donde se realizará el proyecto de investigación: Bioterios de la Facultad de Medicina

“San Fernando” y para el test de apomorfina, medición por HPLC, e Inmunohistoquímica en los
laboratorios de Neurociencias de la facultad de Medicina de la UPCH.

Duración: 2 meses

II. PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO DE INVESTIGACIÓN

Fundamento del problema

El mal de Parkinson constituye una de las principales causas de discapacidad en etapas posteriores
de la vida; la cual, ha llegado a afectar de un 2-3% a las personas mayores de 65 años e incluso hasta
el 10% a mayores de 80 años (1). Más aún, cuando esta población se incremente a 2000 millones
para el año 2050, siendo en la actualidad 600 millones aproximadamente según la OMS, existirá una
mayor preocupación por prevenir y curar estos males (2).

La enfermedad de Parkinson es la causa más de parkinsonismo, un síndrome que se manifiesta por

temblor en reposo, rigidez, bradicinesia e inestabilidad postural. Se caracteriza por la pérdida
gradual de neuronas dopaminérgicas a nivel ventrolateral de la sustancia negra pars compacta y un
agotamiento casi completo de la dopamina, en particular en el putamen (3). Se han caracterizado
cinco receptores de dopamina que se encuentran a lo largo de los ganglios basales y el sistema
límbico (D1 a D5) de los cuales los receptores D1 y D2 son los más relevantes en la fisiopatología de
dicha enfermedad (4). Aún no hay consenso en cuanto a qué criterios patológicos son necesarios
para el diagnóstico de dicha enfermedad (5), pero la mayoría de los investigadores creen que los
cuerpos de Lewy constituyen la característica patológica de dicha enfermedad, (6)
Independientemente de la activación inicial (etiología) de la degeneración neuronal en la
enfermedad de Parkinson, la patogénesis de la neurodegeneración probablemente se debe a la
muerte celular programada (apoptosis) o necrosis (7). Implica una cascada de eventos que incluyen
la interacción entre factores genéticos y anormalidades en el procesamiento de la proteína, el estrés
oxidativo, disfunción mitocondrial, la excitotoxicidad, la inflamación, la regulación inmunitaria , la

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falta de factores tróficos, y otros todavía desconocidos. Es posible que el estrés oxidativo contribuya
también a mal plegamiento de las proteínas. (8) Aunque la mayoría de los casos de la enfermedad
parecen ser esporádicos, hay formas genéticas de parkinsonismo (designado PARK1 través PARK13)
relacionadas con los genes nucleares y mitocondriales.

Durante muchos años ha sido bien reconocida la acción protectora de los flavonoides (polifenoles)
en la prevención y el desarrollo de diversas “patologías por estrés oxidativo” tales como la diabetes,
las enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares, el cáncer (9) y recientemente, asociado a
desórdenes neurodegenerativos como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, observándose
que el consumo de flavonoides produce una reducción del 40% del riesgo de padecer esta
enfermedad (10). Esta acción neuroprotectora de los flavonoides se basa en dos mecanismos
principales: el primero, en la capacidad de mantener la integridad y funcionalidad de las neuronas,
además de prevenir la oxidación neuronal e inhibir la peroxidación lipídica; y el segundo, en su
propiedad antiinflamatoria neuronal producto de la inhibición de la acción microgliar y de moléculas
pro-inflamatorias como la interleucina 1β (IL-1β) y el factor de necrosis tumoral- alfa (TNF-α) (11).

Si bien existen diversos alimentos con gran contenido de flavonoides como el vino, la manzana, el
té verde o el té negro, es el cacao (Theobroma cacao) el que posee el más alto contenido de
polifenoles y su poder reductor es equivalente al de una solución de 5, 80g de ácido ascórbico /100g
(12). Pueden distinguirse tres grupos principales de polifenoles en el cacao: catequinas o flavan-3-
oles (37%), antocianinas (4%) y proantocianidinas (58%), siendo las catequinas, las que poseen
mayor actividad antioxidante y dentro de éstas, la (-)epicatequina corresponde aproximadamente
el 35% del total de polifenoles presentes en el cacao. Es por esta propiedad antioxidante que se
postula una acción neuroprotectora del cacao y sus productos derivados además de sus múltiples
efectos beneficiosos en la salud humana (13, 14).

Estudios anteriores realizados en China, indican que los polifenoles contenidos en él te verde poseen
un efecto reductor de los trastornos neuroconductuales. Como ya se ha mencionado la Theobroma
cacao contiene altos valores de polifenoles, por encima de los contenidos en el té verde, por ende
se deduce que su acción es similar o mucho mayor que la de esta última (15). Por todo lo descrito
en líneas anteriores, podemos concluir que el Teobroma cacao posee un efecto neuroprotector
frente a la enfermedad de Parkinson.

Pregunta de investigación

¿Tiene el extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao efecto protector en modelo
experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos Holtzman.

Hipótesis

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El extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao poseen un efecto protector en modelo
experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos Holtzman.

Objetivos

i. Principal
Determinar que el extracto etanólico de las semillas de Theobroma cacao poseen un efecto
protector en modelo experimental de Parkinson inducido con 6-hidroxidopamina en ratas machos
Holtzman.

ii. Específicos
a. Clínicos: Determinar y comparar el número de rotaciones contralaterales al hemisferio
lesionado mediante el test de apomorfina en todos los grupos en los días 15 y 29 de la
intervención.
b. Bioquímico: Cuantificar y comparar los niveles de dopamina cerebral, mediante HPLC, en
todos los grupos al final de la intervención.
c. Anatomopatológica: Determinar el número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia
negra, mediante la inmunohistoquímica para tirosina hidroxilasa, en todos los grupos al
final de la intervención.

Justificación e importancia del problema

Durante los últimos 150 años, el desarrollo socioeconómico y los avances sanitarios en los
tratamientos han permitido reducir grandemente la tasa de morbimortalidad por enfermedades
infectocontagiosas y por ende, la esperanza de vida, especialmente en los países industrializados,
ha llegado incluso a ser superior a los 75 años. Si bien éste es considerado un índice de mejoría de
la calidad de vida, no debemos olvidar que ante el aumento de la población de adultos mayores, las
enfermedades crónicas y degenerativas se van haciendo cada vez más prevalentes. Dentro de las
patologías degenerativas que se conocen, encontramos al mal del Parkinson, una enfermedad
progresiva y neurodegenerativa, que si bien no desencadena la muerte de las personas afectadas,
produce un deterioro grave de la calidad de vida de estos pacientes y de su entorno familiar y social,
además de generar grandes gastos y posibles efectos secundarios por la administración prolongada
del tratamiento antiparkinsoniano.

Por todo lo indicado anteriormente es que se ha visto la necesidad de indagar en no solo nuevas
formas de tratamiento, sino que mediante esta investigación intentamos contribuir a la búsqueda
de productos naturales beneficiosos para la prevención de este mal, como lo es la Theobroma cacao
o más conocida como “cacao”, semilla cuyo valor neuroprotector pretendemos demostrar.

III. METODOLOGÍA

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Diseño de investigación: El estudio es analítico, prospectivo y experimental incompleto.

Población:
Tipo de muestra: Aleatorizado simple
Tamaño de muestra: 40 ratas macho Holtzman
Criterios de inclusión:
 Ratas macho de edad aproximada 3 meses
 Peso promedio de 250 Kg
Criterios de exclusión:
 Ratas con alguna patología adyacente.

Obtención de los animales:

40 ratas macho Holztman de 3 meses (16), con peso promedio de 250 ±15 g, serán obtenidas del
Bioterio del Instituto Nacional de Salud (INS; Chorrillos, Lima-Perú), aclimatadas durante 1 semana
y mantenidas a una temperatura (22±1°C) y humedad adecuados, en un ciclo de 12 horas luz/12
horas oscuridad. Se les administrará agua ad libitum y alimentación estándar.

Obtención de las semillas:

Luego de la obtención de las semillas de Theobroma cacao, estos serán molidos en un molino
mecánico, luego diluidos en etanol 96° en un frasco ámbar y se dejará macerar por 7 días. Luego se
filtrará, con lo que se retirará el detritus, será colocada en un recipiente de superficie plana y
permanecerá durante 4 días en la cámara de secado. Una vez formada una película fina, se raspará
y almacenará en frascos ámbar para su posterior dilución. A este se llamará extracto etanólico de
semillas de Theobroma cacao.

Técnicas y Procedimientos a emplear

a. Tratamiento
Las ratas serán aclimatadas por una semana, sin ser sometidas a ningún tipo de intervención y
divididas aleatoriamente en cuatro grupos: Modelo (6-OHDA i.c. 2ug/uL+ sol. Salina v.o.), Cacao50
(EEC 50mg/kg), Cacao200 (EEC 200mg/kg) y Cacao500 (EEC 500mg/kg). Se las dará el tratamiento
precirugía por un periodo de dos semanas. Se evaluará clínicamente mediante test de rotación,
bioquímica por medición de dopamina por HPLC, e histopatológica por Inmunohistoquímica para
tirosina hidroxilasa.

b. Cirugía estereotáxica
Se administrará intracranealmente la neurotoxina 6-OHDA a todos los grupos. Las ratas serán
anestesiadas con Ketaxyl® (0,25 ml/kg) asegurando un tiempo de trabajo de 1,5 horas. 4 μg de 6-
OHDA (Sigma- Aldrich) disuelta en 0.2mg/ml de ác. Ascórbico y 4 μl de solución salina se inyectaron
unilateralmente, con una frecuencia de 1μL/min, a través de una jeringa Hammilton, en la pars
compacta derecha de la sustancia negra. Las coordenadas que se usarán son bregma

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anteroposterior -5,0 mm, lateral 2,1mm y 7,7mm de profundidad desde la duramadre (Atlas de
Paxinos&Watson).

c. Test de Rotación
Se realizará a todos los grupos los días 15, un día antes de la cirugía y 29, postcirugía. Las ratas serán
puestas en recipientes circulares y permanecerán por 15 minutos para habituarse. Se contará el
número total de vueltas contralaterales durante los 30 minutos siguientes a la administración
subcutánea de apomorfina disuelta en metabisulfito de sodio al 0,5% (sc, 0.5 mg/kg). Las
rotaciones se definen como vueltas completas de 360° y resultan de la diferencia neta entre las dos
direcciones de giro.

d. Inmunohistoquímica Tirosina hidroxilasa (TH)

Las ratas serán anestesiadas con pentobarbital sódico (0.6 ml/kg) por vía IP, y perfundidos
transcardialmente con solución salina (150ml) seguida por la solución fijadora (240ml
paraformaldehído 4%) durante 30 minutos. Luego de la perfusión los cerebros serán removidos,
fijados en formol10% por 2 semanas y postfijados por inmersión en el formol10%. Las secciones de
parafina de las regiones de la sustancia negra (5 micrómetros de espesor) se montarán y teñirán
inmunohistoquímicamente con tirosina hidroxilasa (TH). Las secciones de parafina se lavarán por 5
minutos en tampón fosfato salino (pH=7.4) y tratarán con peróxido al 3%. Posteriormente, se
lavará las secciones de parafina 3 veces, por 5 minutos cada vez, en tampón fosfato salino 10mM,
seguidos por una pre incubación de 30 minutos con suero normal de cabra al 10%. Las secciones del
cerebro serán incubadas con anticuerpo anti-TH (1:200), incluyendo Triton X-100 al 0.3% en la
noche a 4ºC. Después de un enjuague de 15 minutos en tampón fosfato salino 10mM, las secciones
se incubarán con un complejo avidine- biotinperoxidasa por 30 minutos a temperatura ambiente.
Las microfotografías serán tomadas con lentes objetivos de 10x, en el microscopio óptico. El conteo
de neuronas dopaminérgicas se hará con el software Jmicrovision®. La densidad de células positivas
a inmunohistoquímica será calculada con Image-Pro Plus image®.

e. HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución para cuantificación de dopamina

Las ratas serán decapitadas, se diseccionará rápidamente el estriado de ambos lados del cerebro y
se congelará a 80°c hasta su análisis por HPLC. Se centrifugará la muestra y se homogenizará en una
solución que contiene 0,1 de ácido perclórico y 10-7 hidroxibenzilamina como un estándar interno.
Luego el homogenizado se centrifugará a 12.000 durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se
utilizará para determinar la concentración de dopamina y su metabolito el acido3, 4
dihidroxifenilacético utilizando el aparato de HPLC. Brevemente, una columna (Kromasil 100C18 de
5m) será perfundida con una fase móvil (100mM de tampón de sodio dihidrogenofosfato, pH 3,0,
700 millones de octanaje de ácido sulfónico, 200 estándares. Las concentraciones se expresarán
como ng/mg de peso húmedo de tejido cerebral y se presentará como un porcentaje del estriado
contralateral.

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Operacionalización de variables

DIMENSIÓN ESCALA
DEFINICIÓN DEFINICIÓN TIPO DE CRITERIOS DE VALORES
VARIABLE DE LA DE INSTRUMENTO
CONCEPTUAL OPERACIONAL VARIABLE MEDICIÓN FINALES
VARIABLE MEDICIÓN

Media y
Cantidad total
desviación
de rotaciones no
Conducta estándar del
menor de 150

MACROSCÓPICA
de giro intenso porcentaje de
giros durante 45
NÚMERO DE en sentido Cuantitativa contactos de
minutos Razón Test de apomorfina contacto/minuto
ROTACIONES contralateral al discreta los grupos
(denervación
hemisferio controles y
nigro-estriatal
lesionado experimentales
mayor del 80 %.)
al finalizar el
(17)
tratamiento

Media del
número de
Parte de la
Numero de neuronas
sustancia negra
MICROSCÓPICA

SUSTANCIA neuronas que se Microscopio dopaminérgicas

formada por
NEGRA encuentran por Cuantitativa Software por campo en Numero de
neuronas Razón
Pars campo al discreta Inmunohistoquimica los grupos neuronas/campo
dopaminérgica
Compacta finalizar el controles y
con el pigmento
tratamiento experimentales
melanina
al finalizar el
tratamiento

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Media y
Contenido de desviación
dopamina en estándar de los
Concentración
muestras Prueba niveles de

BIOQUÍMICO
de FSH en
NIVELES DE estriatales Cuantitativa cromatográfica para dopamina de
sangre al Razón ng.g-1 proteína
DOPAMINA determinado continua medición de los grupos
finalizar el
por prueba dopamina controles y
tratamiento
cromatográfica experimentales
(HPLC). al finalizar el
tratamiento

EXTRACTO
Masa del
ETANÓLICO Theobroma

NUTRICIONAL
extracto …
DE SEMILLAS cacao procesado Cuantitativa Prueba estándar de
según peso de Razón mg/Kg
DE para la continua dilución para ETC
animal de
theobroma experimentación
experimentación
cacao (ETC)

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Análisis de datos
 Evaluación estadística
Los resultados serán procesados por la prueba de Kruskall-Wallis para determinar diferencias entre
los grupos, y luego el test pos hoc de Dunn determinará entre qué grupos existe la diferencia. Para
ello, se empleará el paquete estadístico SPSS® Versión 20.0 y se considerará un valor de p < 0,05
para que sea significativo.

Consideraciones éticas

Se usará solamente la cantidad de ratas necesarias para poder lograr los objetivos planteados,
considerando siempre que este sea el menor número posible y siguiendo el esquema de otras
investigaciones experimentales acerca de este tema. Los animales a lo largo del tiempo que duró la
experimentación contaron con el cuidado apropiado respecto a su alimentación, manipulación y
acondicionamiento de su jaula. En el momento de la cirugía estereotáxica se administrará un
anestésico para evitar el dolor.

IV. ASPECTOS ADMINISTRATIVOS

Presupuesto

BIENES COSTO(S/.)
Adaptación del Bioterio 580.00
Materiales de limpieza (escoba, recogedor, jabón 25.00
liquido, toalla, tachos, trapeador, etc)
Calefactor 75.00
Termohigrómetro y balanza 75.00
Material biológico (Ratas machos Holzman ) 400.00
Jaulas, Comederos, bebederos, viruta 180.00
Alimento (ratina) 200.00
Material de Laboratorio (guantes, mascarilla, etc) 120.00
Materiales químicos 1580.00
Material fitoquimico 100.00
Subtotal 3435.00
SERVICIOS COSTO(S/.)
Gastos de Fotografía 30.00
Movilidad 160.00
Llamadas telefónicas 100.00
Subtotal 290.00
TOTAL 3725.00

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Fuentes de financiamiento

El presente trabajo será financiado por los mismos estudiantes de medicina que realizarán el
proyecto con el apoyo de la Facultad de Medicina “San Fernando” y de los laboratorios de
Neurociencias de la facultad de Medicina de la UPCH.

Cronograma de actividades

Periodo Número de semana

Actividad 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13
Elaboración del proyecto X X
Implementación del X
bioterio
Adquisición de los animales X
experimentales
Medición basal de los X
animales experimentales
Aclimatación de los X
animales experimentales
Formación de los grupos X

Experimento X X X

Sacrificio X

Análisis de los resultados X X

Elaboración del informe X X

final

Recursos:

Humano
 Los autores del proyecto de investigación
 Nuestro asesor, el Dr. Manuel Leiva Beraún
 Profesores de apoyo: Dr. Jorge Arrollo
 Personal técnico de la facultada de Medicina de “San Fernando”
 Personal técnico de los laboratorios de Neurociencias de la facultada de Medicina de la UPCH

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Materiales
De trabajo:
 20 jaulas (con bebedero y comedero cada uno)
 2 cánulas
 Agua ad libitum, ratina
 Termohigrómetro, calefactor y balanza

De experimentación:
 Biológicos (40 ratas macho Holtzman y Semillas de Theobroma cacao)
 Fitoquímico (Extracto etanólico de semillas de Theobroma cacao)
 Químicos (6-Hidroxidopamina (6-OHDA), Apomorfina, Dopamina hidrocloride y Anticuerpos
anti Tirosin Hidroxilasa (Anti TH))

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V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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