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2.2.

3 Desnaturalización de proteínas
Los cambios en el ambiente o los tratamientos químicos pueden alterar la
conformación nativa de una proteína con la pérdida de su actividad biológica. Esa
alteración se llama desnaturalización. La cantidad de energía necesaria para
causar la desnaturalización es pequeña, con frecuencia, quizá la equivalente a la
que se necesita para alterar tres o cuatro puentes de hidrogeno. Algunas proteínas
pueden desdoblarse por completo cuando están desnaturalizadas y forman una
hélice aleatoria.
El estado desnaturalizado no se equipara necesariamente con el desplegamiento
completo de la proteína y la pérdida total de la conformación. En la mayoría de
condiciones, las proteínas desnaturalizadas existen como un conjunto de estados
parcialmente plegados de los que se sabe muy poco.
Las proteínas se suelen desnaturalizar por calentamiento. Bajo condiciones
adecuadas, un aumento modesto de temperatura causa el desdoblamiento y
perdida de las estructuras secundaria y terciaria.
La brusquedad del cambio sugiere que el desplegamiento es un proceso
cooperativo: Ello indica que el desdoblado es un proceso cooperativo: la
desestabilización de solo unas pocas interacciones débiles causa una pérdida casi
completa de la conformación nativa. El efecto del calor sobre las proteínas no es
un efecto fácilmente predecible.
La desnaturalización sucede dentro de límites relativamente estrechos de
temperatura.
La mayor parte de las proteínas presenta una temperatura característica de
“fusion” (Tm o Temperatura de Fusión), que corresponde a la temperatura en el
punto medio de la transición entre las formas nativa y desnaturalizada. La Tm
depende del pH y de la fuerza iónica de la solución.
Bajo condiciones fisiológicas, la mayor parte de las proteínas son estables hasta
temperaturas de 50 a 60°C. Sin embargo, hay algunas especies de bacterias,
como las que habitan en las fuentes térmicas y en la cercanía de las ventilas
térmicas oceánicas. Todas las proteínas son estables en temperaturas menores a
100°C.
Las proteínas también se pueden desnaturalizar con dos tipos de sustancias
químicas:
Agentes caotrópicos y detergentes
Altas concentraciones de agentes caotrópicos, como urea y sales de guanidinio,
desnaturalizan a las proteínas porque permiten que las moléculas de agua
solvaten a grupos no polares en su interior. Los agentes caotrópicos aumentan la
solubilidad de las sustancias no polares en el agua. Por consiguiente, su eficacia
como desnaturalizantes descansa en su capacidad para romper las interacciones
hidrofóbicas.
Las moléculas de agua interrumpen las interacciones hidrofobicas que en el caso
normal estabilizan la conformación nativa. Las colas hidrofobicas de detergentes,
como el dodecilsulfato de sodio, también desnaturalizan las proteínas al penetrar a
su interior y alterar las interacciones hidrofobicas
Las variaciones de pH alteran los estados de ionización de las cadenas laterales
de los aminoácidos, lo que cambia la distribución de carga de la proteína y los
requerimientos para el enlace de hidrógeno.
Los detergentes, algunos de los cuales perturban de modo significativo las
estructuras de las proteínas a concentraciones tan bajas como 10-6 M. Se asocian
hidrofóbicamente con los restos no polares de una proteína, interfiriendo, por
tanto, con las interacciones hidrofóbicas responsables de la estructura de la
proteína nativa.
Las concentraciones elevadas de sustancias orgánicas solubles en el agua, tales
como los alcoholes alifáticos, interfieren con las fuerzas hidrófobicas con el agua.
Sin embargo, las sustancias orgánicas con varios grupos de hidroxilo, tales como
el etilenglicol, o sacarosa, son desnaturalizantes relativamente débiles, porque su
capacidad para restablecer enlaces de hidrógeno los convierte en agentes con
escasa capacidad para romper la estructura del agua.
La desnaturalización completa de las proteínas que contienen puentes de disulfuro
requiere romper esos enlaces, además de la alteración de interacciones
hidrofobicas y de los puentes de hidrogeno. El 2-mercaptoetanol u otros reactivos
tioles se pueden agregar a un medio desnaturalizante para reducir todos los
puentes de disulfuro a grupos sulfhidrilo
El doblamiento es rapido en extremo; en la mayor parte de los casos se llega a la
conformacion nativa en menos de un segundo. El plegado y la estabilizacion de
las proteinas
dependen de varias fuerzas no covalentes, como el efecto hidrofobico, los puentes
de hidrogeno, las interacciones de van der Waals y las interacciones entre cargas.
Aunque las interacciones no covalentes son debiles en lo individual, en lo colectivo
determinan
la estabilidad de las conformaciones nativas de las proteinas. La debilidad de
cada interaccion no covalente suministra la elasticidad y flexibilidad necesarias
para
que las proteinas sufran cambios pequenos de conformacion. (Los puentes de
disulfuro
covalentes tambien contribuyen a la estabilidad de ciertas proteinas).
No se ha descrito todavia una ruta real de plegado de proteina en detalle, pero las
investigaciones actuales se enfocan en intermediarios de las rutas de doblado de
varias
proteinas. En la figura 4.31 se ven varias rutas de plegado hipoteticas. Durante el
plegado
de la proteina, el polipeptido se aplasta sobre si mismo debido al efecto
hidrofobico
y se comienzan a formar elementos de la estructura secundaria. Este eslabon
intermedio
se llama globulo fundido. Los pasos posteriores son el reordenamiento de la
cadena de
columna vertebral para formar los motivos caracteristicos y, por ultimo, la
conformacion
nativa estable. Cada dominio en una proteina de multidominio forma dobleces en
forma independiente.
El mecanismo de plegado de proteinas es uno de los problemas mas desafiantes
de
la bioquimica. Es espontaneo y debe estar determinado en gran parte por la
estructura
primaria (la secuencia) del polipeptido. En consecuencia, debe ser posible indicar
la estructura
de una proteina conociendo su secuencia de aminoacidos. En anos recientes se
avanzo mucho al modelar el plegado mediante computadoras rapidas. En el resto
de esta
seccion se examinan las fuerzas que estabilizan la estructura de las proteinas y el
papel
de los chaperones en el plegamiento de las proteinas.
A. El efecto hidrofobico
Las proteinas son mas estables en agua cuando sus cadenas laterales
hidrofobicas se
agrupan en el interior de la proteina y no quedan expuestas al medio acuoso en la
superficie.
Como las moleculas de agua interaccionan con mas fuerza entre si que con las ca
denas laterales no polares de una proteina, estas cadenas son impulsadas a
vincularse
entre si, lo cual determina que la cadena polipeptidica se colapse y forme un
globulo
fundido mas compacto. Durante el plegado, la disminucion de entropia del
polipeptido
mas que se contrarresta por el aumento de la entropia del solvente, cuando se
liberan
moleculas de agua que estaban unidas a la proteina. (El plegado tambien altera
las jaulas
extendidas de moleculas de agua que rodean a los grupos hidrofobicos). Este
aumento
general de entropia constituye la principal fuerza impulsora del plegado. Mientras
que
las cadenas laterales no polares son impulsadas hacia el interior de la proteina, la
mayor
parte de las cadenas laterales polares quedan en contacto con el agua, en la
superficie de
la proteina. Los tramos de la columna vertebral polar que son impulsados al
interior
de una proteina neutralizan su polaridad con puentes de hidrogeno mutuos y con
frecuencia
generan estructuras secundarias. Asi, la naturaleza hidrofobica del interior no
solo explica la asociacion de residuos hidrofobicos sino que tambien contribuye a
la
estabilidad de helices y laminas. Los estudios de las rutas de doblado indican que
el colapso
hidrofobico y la formacion de estructuras secundarias son simultaneos.
Hay ejemplos localizados de este efecto hidrofobico como las interacciones del
lado
hidrofobico de una helice a anfipatica con el interior de la proteina (seccion 4.4) y
la region
hidrofobica entre las laminas b en la estructura de emparedado b (seccion 4.5). La
mayor parte de los ejemplos que se ven en las figuras 4.24 y 4.25 contiene
regiones
yuxtapuestas de estructura secundaria que se hallan estabilizadas por
interacciones hidrofobicas
entre las cadenas laterales de residuos de aminoacido hidrofobicos.
B. Puentes de hidrogeno
Los puentes de hidrogeno contribuyen a la cooperatividad del plegamiento y
ayudan a
estabilizar las conformaciones nativas de las proteinas. Los primeros puentes de
hidrogeno
son los que se forman en las helices a, las laminas b y los giros, y forman regiones
definidas de la estructura secundaria. La estructura nativa final contiene tambien
puentes de hidrogeno entre la columna vertebral del polipeptido y el agua, entre
aquella
y las cadenas laterales polares, entre dos cadenas laterales polares y entre estas
y el
agua. La tabla 4.1 muestra algunos de los diversos tipos de puentes de hidrogeno
que
caracterizan a las proteinas junto con sus longitudes tipicas de enlace. La mayor
parte
de los puentes de hidrogeno en las proteinas es del tipo N—H—O. La distancia
entre
los atomos donador y aceptador varia de 0.26 a 0.34 nm y los puentes pueden
desviarse
de la linealidad hasta en 40°. Recuerdese que los puentes de hidrogeno dentro del
interior
hidrofobico de una proteina son mucho mas estables que los que se forman cerca
denas laterales no polares de una proteina, estas cadenas son impulsadas a
vincularse
entre si, lo cual determina que la cadena polipeptidica se colapse y forme un
globulo
fundido mas compacto. Durante el plegado, la disminucion de entropia del
polipeptido
mas que se contrarresta por el aumento de la entropia del solvente, cuando se
liberan
moleculas de agua que estaban unidas a la proteina. (El plegado tambien altera
las jaulas
extendidas de moleculas de agua que rodean a los grupos hidrofobicos). Este
aumento
general de entropia constituye la principal fuerza impulsora del plegado. Mientras
que
las cadenas laterales no polares son impulsadas hacia el interior de la proteina, la
mayor
parte de las cadenas laterales polares quedan en contacto con el agua, en la
superficie de
la proteina. Los tramos de la columna vertebral polar que son impulsados al
interior
de una proteina neutralizan su polaridad con puentes de hidrogeno mutuos y con
frecuencia
generan estructuras secundarias. Asi, la naturaleza hidrofobica del interior no
solo explica la asociacion de residuos hidrofobicos sino que tambien contribuye a
la
estabilidad de helices y laminas. Los estudios de las rutas de doblado indican que
el colapso
hidrofobico y la formacion de estructuras secundarias son simultaneos.
Hay ejemplos localizados de este efecto hidrofobico como las interacciones del
lado
hidrofobico de una helice a anfipatica con el interior de la proteina (seccion 4.4) y
la region
hidrofobica entre las laminas b en la estructura de emparedado b (seccion 4.5). La
mayor parte de los ejemplos que se ven en las figuras 4.24 y 4.25 contiene
regiones
yuxtapuestas de estructura secundaria que se hallan estabilizadas por
interacciones hidrofobicas
entre las cadenas laterales de residuos de aminoacido hidrofobicos.
B. Puentes de hidrogeno
Los puentes de hidrogeno contribuyen a la cooperatividad del plegamiento y
ayudan a
estabilizar las conformaciones nativas de las proteinas. Los primeros puentes de
hidrogeno
son los que se forman en las helices a, las laminas b y los giros, y forman regiones
definidas de la estructura secundaria. La estructura nativa final contiene tambien
puentes de hidrogeno entre la columna vertebral del polipeptido y el agua, entre
aquella
y las cadenas laterales polares, entre dos cadenas laterales polares y entre estas
y el
agua. La tabla 4.1 muestra algunos de los diversos tipos de puentes de hidrogeno
que
caracterizan a las proteinas junto con sus longitudes tipicas de enlace. La mayor
parte
de los puentes de hidrogeno en las proteinas es del tipo N—H—O. La distancia
entre
los atomos donador y aceptador varia de 0.26 a 0.34 nm y los puentes pueden
desviarse
de la linealidad hasta en 40°. Recuerdese que los puentes de hidrogeno dentro del
interior
hidrofobico de una proteina son mucho mas estables que los que se forman cerca

mayoria de las proteinas se pueden desnaturalizar mediante


calor, el cual afecta de una manera compleja a las interacciones
debiles de una proteina (los enlaces de hidrogeno
principalmente). Si se aumenta lentamente la temperatura, la
conformacion de la proteina suele permanecer intacta hasta que
tiene lugar una perdida brusca de la estructura (y de la fundon)
dentro de un estrecho margen de temperaturas
La
brusquedad del cambio sugiere que el desplegamiento es un proceso
cooperativo: la perdida de estructura en una parte de la
proteina desestabiliza otras partes. El efecto del calor sobre las
proteinas no es un efecto facilmente predecible. Las proteinas
muy estables al calor de las bacterias termoiUas y arqueas han
evolucionado para poder funcionar a la temperatura de las fuentes
termales (-100 °C). No obstante, la estructura de estas proteinas
difiere a menudo muy poco de la de sus proteinas
homologas de bacterias tales como Escherichia coli. Aun no se
La desnaturalizacion de proteinas tambien puede llevarse a
cabo por la accion de extremos de pH, de ciertos disolventes organicos
miscibles en agua como por ejemplo el alcohol o la acetor\
a, de ciertos solutos tales como la urea o el cloruro de
guanidinio, o mediante detergentes. El tratamiento con cada
uno de estos agentes desnaturalizantes puede considerarse relativamente
suave, en el sentido de que no se rompen enlaces
covalentes de la cadena polipeptidica. Los disolventes organicos,
la urea y los detergentes actuan principabnente rompiendo
las interacciones hidrofobicas que forman el nucleo estable de
las proteinas globulares; los extremos de pH alteran la carga neta
de la proteuia, dando lugar a la aparicion de repulsiones electrostaticas
y a la destruccion de algunos enlaces de hidrogeno.
Las estructuras desnaturalizadas obtenidas con estos diversos
tratamientos no son necesariamente equivalentes.
tante vino de experimentos que demostraron que la desnaturalizacion
de algunas proteinas es reversible. AJgunas proteinas
globulares desnaturalizadas por el calor, extremos de pH o
reactivos desnaturalizantes, son capaces de recuperar su estructura
nativa y su actividad biologica si son devueltas a condiciones
en las que la conformacion nativa es estable. Este
proceso se conoce como renaturalizacion.
Un ejemplo clasico es la desnaturalizacion y renaturalizacion
de la ribonucleasa A, demostrada por Christian Anunsen
en la decada de 1950. La ribonucleasa A purificada se desnaturaliza
completamente mediante exposicion a una disolucion
concentrada de urea en presencia de im agente reductor. El
agente reductor rompe los cuatro puentes disulfuro dando lugar
a ocho residuos Cys y la urea elimina las interacciones hidrofobicas
estabilizantes, con lo que el polipeptido pierde
completamente su conformacion plegada. A la desnaturalizacion
de la ribonucleasa le acompana una perdida completa de
la actividad catalitica. Cuando se eliminan la urea y el agente
reductor, la ribonucleasa desplegada y desnaturalizada se
vuelve a plegar espontaneamente adoptando su estructura
terciaria correcta y recuperando completamente su actividad
catalitica (Fig. 4-26). El replegamiento de la ribonucleasa es
tan preciso que los cuatro puentes disulfiiro intracatenarios
se forman en las mismas posiciones originales observadas en
la ribonucleasa nativa. Calculos matematicos demuestrai\ que
las ocho Cys podrian haberse recombinado al azar para formar
cuatro puentes disulfuro de 105 maneras diferentes. De
hecho, cuando se permite reformar los disulfuros en presencia
del desnaturalizante (y sin el agente reductor), se obtiene
una distribucion de enlaces disulfuro esencialmente al azar,
lo que indica que las interacciones por uniones debiles son
necesarias para el posicionamiento correcto de los enlaces disulfuro
y la adopcion de la conformacion nativa. Mas adelante
se obtuvieron resultados similares usando ribonucleasa A sintetizada
quimicamente y cataliticamente activa. Con esto se
eliminaba la posibilidad de que algun contaminante residual
de la preparacion de ribonucleasa de Anfinsen hubiera podido
contribuir a la renaturalizacion del enzima, disipando cualquier
No todas las proteinas se pliegan espontaneamente a medida
que se sintetizan en la celula. Para el plegamiento de muchas
proteinas es necesaria la accion de las chaperonas moleculares,
proteinas que interaccionan con polipeptidos parcial o incorrectamente
plegados, facilitando rutas de plegamiento
correctas o aportando microentomos en los que pueda tener
lugar el plegamiento. Se conocen bien dos clases de chaperonas
moleculares. Ambas se localizan en organismos que van de
bacterias a humanos. La primera clase, una familia de proteinas
denominada Hsp70 (vease la Fig. 3-30), presentan generalmente
una masa molecular cercana a 70.000 y son mas abundantes
en celulas sometidas a estres por temperaturas
elevadas (de aqui proteinas de choque termico -por heat shock
proteins- de 70.000 o Hsp70). Las Hsp70 se unen a regiones
ricas en residuos hidrofobicos de polipeptidos no plegados, evitando
la agregacion inapropiada. Por tanto, estas chaperonas
“protegen” a las proteinas que se han desnaturalizado por calor
y a los peptidos que se estan sintetizando (y que aun no estan
plegados). Las proteinas Hsp70 tambien bloquean el plegamiento
de determinadas proteinas que deben permanecer desplegadas
hasta que hayan sido traslocadas a traves de la
membrana (como se describe en el Capitulo 27). Algunas chaperonas
tambien ayudan en el empaquetamiento cuaternario
de proteinas oligomericas. Las proteinas Hsp70 se unen a polipeptidos
y los liberan en un ciclo que usa la enei:gia del ATP y
en el que tambien intervienen otras proteinas (incluidas las de
una clase llamada Hsp40). En la Figura 4-29 se muestra el
plegamiento asistido por chaperonas tal como se ha elucidado
para las chaperonas DnaK y DnaJ de Exoli, homologas de las
Hsp70 y Hsp40 de eucariotas. Las proteinas DnaK y DnaJ se
identificaron en un principio como proteinas necesarias para la
replicacion in vitro de ciertas moleculas de DNA virico (de aqui
la designacion de “Dna").
La segunda clase de chaperonas se denominan chaperoninas.
Estas son elaborados complejos proteicos necesarios para
el plegamiento de muchas proteinas celulares que no se
pliegan espontaneamente. En condiciones normales, se estima
que entre un 10 y un 15% de proteinas celulares de E. coli
necesitan el sistema propio de chaperonina, denominado
GroEUGroES, para plegarse (cuando las celulas se someten a
estres por calor hasta un 30% necesitan esta asistencia). Las
chaperoninas se descubrieron cuando se observo que eran necesarias
para el crecimiento de ciertos virus bacterianos (de
aqui la designacion “Gro**, firrTowth). Las proteinas desplegadas
La estructura tridimensional y la funcion de las
proteinas puede destruirse por desnaturalizacion,
lo que demuestra la relacion entre estructura
y funcion. Algunas proteinas desnaturalizadas
pueden renaturalizarse espontaneamente para formar
proteinas biologicamente activas, lo que demuestra
que la estructura terciaria de las proteinas esta
determinada por la secuencia de aminoacidos.
Es probable que el plegamiento de proteinas en la
celula implique la existencia de multiples caminos.
En un prindpio pueden formarse elementos de
estructura secundaria, seguidos por la formacion
de estructuras supersecundarias. Los numerosos
intermediarios de plegamiento evolucionan
rapidamente hacia una uiuca conformacion rmtiva.
Muchas proteinas reciben la asistencia de chaperonas
Hsp70 y de chaperoninas en su plegamiento. Enzimas
especificos catalizan la formacion de enlaces disulfuro
y la isomerizacion cis-trans de enlaces peptidicos
de Pro.
El plegamiento defectuoso de proteinas es la base molecular
de una amplia gama de enfermedades humanas.