Cours Pasteur 2011

Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)
Plantae Protista Animalia

Les microorganismes
jusqu’au XIXème siècle
Phylogénie et diversité des Découverts au milieu du

microorganismes 17ième
Master Microbiologie générale (Institut Pasteur) Considérés pendant deux
siècles comme:
⇒ Des curiosités sans intérêt
Des intermédiaires probables
Céline Brochier-Armanet ⇒
entre le monde minéral et le
monde vivant
Professeur – Université Lyon I ⇒ Classés au sein des Plantes
ou au sein des animaux (dans
Laboratoire de Biométrie et Biologie évolutive (UMR5558)
le groupe mal défini des vers)
(celine.brochier-armanet@univ-lyon1.fr)
Haeckel (1866)
Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)
Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011) Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)
Place des microorganismes au sein du Est-il possible d’établir une classification

monde vivant phylogénétique des microorganismes?
Copeland (1938 et 1947) Whittaker (1969)
Plantae Protista Animalia Plantae Fungi Animalia Échantillon
Culture pure
Morphologie
Métabolisme/Physiologie
Protista
Monera
@purificacion lopez-garcia Identification/Classification
“... the ultimate scientific goal of biological

classification cannot be achieved in the case Une révolution en marche…
of bacteria” (Roger Y. Stanier, 1963)
Bactéries sulfureuses
(Thiobacillus) 1955 : Séquençage de l’insuline - Sanger
Similarité
Similarité
morphologique
Premières phylogénies moléculaires (Eucaryotes)
physiologique
1965 : “ Molecules as Documents of Evolutionary History ”
Oxydent - Zuckerkandl et Pauling
Bactéries pourpres
des Bactéries sulfureuses
non sulfureuses
composés non pigmentées
(Athiorhodaceae)
1977 : Catalogues d'oligonucléotides d’ARNr – Carl Woese
soufrés
1977 : Séquençage rapide de l’ADN - Sanger
Même
Granules de soufre
pigmentation
intracellulaires
Bactéries pourpres (Rhodobacteria)
(Thiobacteria)
sulfureuses
(Thiorhodaceae)
Echec de l’application du principe de subordination des caractères pour

l’établissement d’une classification évolutive des microorganismes
La biodiversité des organismes actuels

définit trois grands domaines
L’accès au patrimoine génétique des (Sogin, 1991)
(Fox, 1977)
organismes a radicalement changé notre
connaissance de l’histoire de la vie
Archaea
La diversité génétique ne reflète pas la Tous les êtres vivants descendent d’un
diversité morphologique même ancêtre commun: LUCA
Plantae Fungi Animalia
Protista
Monera
(Sogin, 1991)
(Fox, 1977)
L’arbre universel du vivant représente une La biodiversité actuelle ne représente qu’une

infime partie de l’histoire de la vie fraction de la biodiversité ayant existé
Aujourd’hui
Arbre universel du vivant
LUCA
Première cellule
Troisième âge : Monde cellulaire post-luca

Origine(s) de la vie
Second âge : Monde cellulaire pré-luca
Premier âge : Monde pré-cellulaire (Forterre et al. Medecine Science 2005) (http://web.uconn.edu/gogarten/)
Qui était LUCA? Très peu de gènes sont communs à tous

les organismes actuels
« Dis moi quels sont tes gènes et je te dirai qui tu es » LUCA possédait une ARN polymérase, des
ribosomes & le code génétique universel
Identifier les gènes présents dans le génome de LUCA Protéines universelles
⇒ Comparer les gènes présents dans les génomes des représentants
actuels des trois domaines
⇒ Identifier les gènes communs aux trois domaines hérités de LUCA
LUCA était un organisme cellulaire
LUCA
LUCA avait un génome à ???

Hérédité verticale
Le répertoire n’est pas compatible avec une vie

(Forterre et al. MS 2005) cellulaire (ex. Pas de métabolisme…)
Limites de la génomique comparée LUCA avait un génome de taille comparable

aux génomes des actuels
LUCA LUCA +++++
Hérédité verticale Transfert horizontal de gène -------
LUCA LUCA LUCA

~320->1000/2000 gènes
⇒LUCA avait un génome relativement
large
⇒Free living
Trop grande divergence Perte de gène Remplacement non homologue

Brochier-Armanet C. “Minimal cell: the biologist point of view” Origin of life (Cambridge University Press – 2010)
Début des années 90: L’histoire de la vie est

presque totalement résolue
Questions ouvertes & Grands enjeux des

prochaines années (4) Irrésolution des (4) Irrésolution des
relations de parenté relations de parenté
entre la plupart des entre la plupart des
phyla bactériens phyla eucaryotes
(3) Émergence basale des

protistes amitochondriaux
(3) Émergence basale des

bactéries hyperthermophiles
(1) Enracinement dans la

branche bactérienne (2) LUCA hyperthermophile
(Woese 1994 Microbiol Rev)
Quelles sont les relations de parenté entre

les trois domaines?
Archaea Eucarya Bacteria Présent
prochaines années
3
LECA
Les relations de parenté entre les trois LACA 1

LBCA
domaines
LUCA Temps
Trois scénarios possibles Une approche naïve Comparer les

Archaea
caractères de chaque domaine Eucarya
Eucarya
Bacteria Archaea Bacteria

Archaea
Archaea
Bacteria Eucarya Archaea
Bacteria Eucarya
Archaea Archaea Archaea
Archaea
Bacteria
+ Eucarya Bacteria Bacteria Bacteria
Eucarya
Bacteria Eucarya Eucarya Eucarya
Eucarya
Archaea Eucarya
Racine
Archaea Archaea
Bacteria
Bacteria Eucarya Bacteria
Archaea Archaea
D Racine dans la
Eucarya branche archée Implications évolutives d’une racine dans la
Bacteria Eucarya
D
Archaea branche bactérienne
Bacteria Eucarya Bacteria Eucarya Eucarya Bacteria
Phylogénie non racinée Phylogénie non racinée Bacteria
du paralogue 1 du paralogue 2 Archaea Archaea
=
O C — O — CH2
=
C — O — CH2 C—O C H O-
—
=
CH2 —— O — P — O-
O
C—O C H O-
—
=
—
Linear fatty acids O-
CH2 —— O — P — O- Ester
Archaea Archaea
O
—
Racine dans la Linear fatty acids D - glycerol
Ester O-
Glycerol-3-phosphate (G3P)
D - glycerol
D Archaea
branche eucaryote
Bacteria Archaea
Eucarya
D Archaea
Bacteria Eucarya Bacteria Eucarya Bacteria
Bacteria
Phylogénie non racinée Phylogénie non racinée
du paralogue 1 du paralogue 2 Eucarya Eucarya
Lipides
d’archées
Racine dans la
Archaea Archaea Eucarya branche bactérienne
D Archaea Eucarya
O
=
C — O — CH2
Enracinement dans la C—O C H O-
—
=
Bacteria CH2 —— O — P — O-
O
—
Linear fatty acids O-
Ester
D branche bactérienne D - glycerol

Eucarya Archaea
Archaea - EF1α/EF2 (Iwabe et al. 1989)
Bacteria Eucarya Bacteria Eucarya - SRP54/SRα (Gribaldo et Cammarano 1998)
Bacteria Bacteria
Phylogénie non racinée Phylogénie non racinée - ATPase F1-a/F1-b (Iwabe et al. 1989, Gogarten et al. 1989)
du paralogue 1 du paralogue 2 - Aminoacyl-tRNA synthetases (ILE/VAL/LEU) (Brown & Doolittle 1995)
Cet enracinement est-il fiable? S1

S2
S3
S4
S5
S6 Questions ouvertes & Grands enjeux des
S1 prochaines années
S4
S6
S2
S3
S5
Attraction des longues branches (Felsenstein 1978)
B (Philippe et Forterre. 1999)
Artefact causé par les substitutions multiples Replacer les virus par rapport à l’arbre
B
Racine de la vie
B B
B B
A E A A A A A
E E E E E
ATPase Tyr-RS SRP EF-1α Ile-RS rRNA
Les virus: Un quatrième domaine du vivant ? Ces gènes ont été acquis par transfert à
partir de leur hôte
(Raoult, Science 2005) Fusion de 7 protéines universelles (Moreira et Lopez-Garcia, Science 2005)
… ou parasites de l’hôte (concept de Questions relatives aux virus?

réservoir évolutif)
Les virus ont-ils une ou plusieurs origines
(groupe monophylétique ou polyphylétique)?
Les virus dérivent-ils de cellules?
L’origine des virus est-elle plus ancienne ou

plus récente que LUCA?
(Moreira & Brochier, BMC Evol Biol 2008)
La question de l’origine des eucaryotes
Archaea Eucarya Bacteria Présent

prochaines années
3
LECA
La question de l’origine des eucaryotes LACA 1

LBCA
LUCA Temps
Deux hypothèses sont en compétition Une question au cœur du débat scientifique

« La majorité des biologistes font dériver l’organisation
plus complexe de la cellule eucaryote d’une
organisation plus simple de type procaryote…»
(Martin W. Current Opinion in Microbiology 2005)
Implique l’existence de Implique l’existence de 2 domaines

3 domaines primaires primaires et d’1 domaine secondaire
…mais une absence de consensus

Nécessité de
développer d’autres
approches
prochaines années
Retracer les grandes étapes de la

diversification de chacun des trois
domaines du vivant
Elucider les grandes étapes de la Phylogénies basées sur l’ARNr16S (90)

s/
diversification des trois domaines nop
ile
s
no flag
ellé
Cham é Di xés
pign m és/
Archaea Eucarya Bacteria Présent ons
St
ra Cili ple uges
Anim i com ro lds
aux Ap ues u
Alg e mo eba
Eucarya Slim Entamo
Plan
te s Am es
ib
s
Kinetoplastide
Euglena
Trichomonads
LECA Diplomonads
Endosymbiose Microsporidia
LACA mitochondriale
LBCA Archezoa
5 6
LUCA Temps Archaea
(Bacteria (Sogin, 1991)
Découverte de gènes d’origine Lien entre Microsporidia & Fungi

mitochondriale chez les Archezoa
Trichomonas Diplomonads
Gènes d’origine
mitochondriale
Sutak, PNAS, 2004, 101:13068-10373
Tovar, Nature, 2003, 426:173-176
Trichomonas vaginalis 1 Trichomonads (localisation
Trichomonas vaginalis 2 dans les hydrogénosomes)
Trachipleistophora
Signature fungi, metazoa,

Giardia intestinalis Diplomonads (localisation Homo WFGGWKVTRKDGNASGTTLL
dans les mitosomes) Saccharomyces WYGGWEKETKAGVVKGKTLL hominis
Glugea WFKGWKPVSGAGDSI-FTLE
microsporidia
EF-1α
α
Arabidopsis WYKG PTLL

Trypanosoma WYKG PILV
Proteobacteria Plasmodium WYKG RTLI
Giardia WYEG PCLI
Sulfolobus WYNG PTLE
IscS, formation des clusters FeS et réparation des protéines FeS E. coli WEAK LELA
Tachezy, MBE, 2001, 18:1919-1928
Fin de l’hypothèse Archezoa (fin 90s) Nouvelles méthodes d’analyse (XXIème)
s
ds
nad
ona
o
lom
hom
s (Delsuc et al. Nat Rev Micro 2005)
ile
Dip
op
Tric
Ciliés/Dinoflagellés/ én ges
rt a
m s rou s
Apicomplexés
A lg
u e uld
S
e mo ba
Cham Sl im moe
Micro- pigno Enta
ns
sporidia Amibes
Anim Kinetoplastides
aux Euglena
Endosymbiose
Plan
tes ? Archezoa
a-proteobacteria
⇒ Mitochondries Perte ou transformation des
⇒ Hydrogénosomes mitochondries en liaison avec
⇒ Autres organelles ? un mode de vie parasitaire
La phylogénie des eucaryotes revisitée Et pout les autres domaines?
(Delsuc et al. Nat Rev Micro 2005)

(Baldauf SL 2003 Science; Simpson and Roger 2002 Current Biology)
Notre connaissance de la biodiversité

actuelle est encore très lacunaire
BACTERIA
Questions ouvertes & Grands enjeux des ARCHAEA
prochaines années
Explorer la diversité biologique

existante…
(Forterre et al. TPB 2002) (Lopez-Garcia et al. 2002)
La naissance de l’écologie moléculaire (90s) La diversité microbienne révélée

ARN (7) Analyses Au sein de groupes déjà connus (ex. Planctomycetales)
phylogénétiques
Par la découverte de nouvelles lignées (ex. Thaumarchaeota,
(1) Extraction de l’ADN
Korarchaeota)
RT - PCR
(6) Interrogation des
banques de données
(amorces choisies
(2) Amplification PCR
Ex ARNr 16S)
(5) Séquençage
(3) Clonage
(4) Sélection des clones positifs &
Vérification de la taille des inserts,
profils des fragments (ARDRA, RFLP)
Analyse phylogénétique des séquences amplifiées => Aperçu « non biaisé » de la (Brochier 2001 unpublished)
(Schleper Nat Rev Micro 2005)
diversité en microorganismes présents dans un milieu @purificacion lopez-garcia
Cerner la diversité virale, un enjeu de taille Genome Encyclopedia of Bacteria and

Hits Connus Connus Archaea Séquencer au moins un représentant de

Objets biologiques les plus genbank (278) (304)
chaque groupe taxonomique connu
courants dans les océans
(Estimation des populations Inconnus Combler les biais dans notre connaissance
Inconnus
~1012 particules virales/200L, 104 (783) * des fonctions présentes au sein du monde
(569) * vivant
types viraux différents)
Rôles majeurs dans les cycles * *
biogéochimiques, la diversité
microbienne, échanges
génétiques
Peu d’études de leur diversité
(isolation difficile, hôtes souvent
non cultivables, pas d’éléments Groupes biologiques
génétiques conservés)
La majorité des fragments
génomiques viraux ne ressemble
à rien de connu
95/105 71/95
(Breitbart et al. 2002 PNAS) Familles de phages

prochaines années
Explorer la diversité biologique

existante… et comprendre le
fonctionnement des écosystèmes…
FISH, Chromosome painting… Accéder aux fonctions biologiques

Exploration des répertoires géniques des micro-organismes au sein des
Utilisation de sondes oligonucléotidiques avec un marquage
écosystèmes
fluorescent dirigées contre l’ARNr (1989)
⇒ Séquençage de larges fragments d’ADN
Permet l’identification de cellules individuelles et de la SEQUENCAGE D’INSERTS (plusieurs Mb)
Échantillon
structure/organisation des communautés * Structure du génome
- Distribution, densité des gènes, Introns, opérons…
* Analyse des gènes présents
Extraction - Analyse phylogénétiques (Diversité)
de l’ADN - Détection des transferts horizontaux (Evolution)
- Gènes du métabolisme (Culture, écologie)
EXPRESSION DE GENES D’INTERETS
Banque Séquençage + étude
génomique Sous-clonage
Clonage direct (BACs, Amélioration de l’expression
Cosmides, Fosmides) CRIBLAGE Applications biotechnologiques
Activité spécifiques
(@purificacion lopez-garcia)
Gènes spécifiques
Découverte de nouveaux métabolismes: un

nouveau type de phototrophie dans la mer
Béjà et al. Science (2000)
7 segments
γ-proteobacteria
transmembranaires
Fonctionne comme
une pompe à H+
Halorhodopsines Bacteriorhodopsines
(Pompe ions Cl-, (Pompe H+, Halophiles)
Halophiles)
Bactérie proche
du groupe SAR86
Coloration rouge des E. coli exprimant le gène.
Ajout de retinal => pic d’absorption détecté à
Récepteurs photosensibles, Halophiles 520 nm
Découverte d’archaea nitrifiantes (2005) Séquençage & assemblage de génomes

complets directement à partir de
l’environnement
Archaea (AmoA) A. Biofilm rose dans la mine de

Richmond mine
B. FISH : Sonde: verte = bactéries, bleu
= archébactéries, rouge = genre
BetaP Leptospirillum. (recouvrement vert +
(AmoA) rouge = jaune => dominance des
(Schleper & Nicols 2010) cellules de Leptospirillum)
AlphaP
GammaP (PmoA) C. Abondance relative basée sur le FISH
(PmoA)
GammaP
(AmoA/PmoA)
Verrucomicrobia
(PmoA)
(Schleper AEM 2005) (Tyson et al., Nature, 2004)
Analyse de la diversité & dynamique des Analyse fonctionnelle des écosystèmes

populations de Ferroplasma
A. Biofilm rose dans la mine de
Richmond mine
B. FISH : Sonde: verte = bactéries,
bleu = archébactéries, rouge =
genre Leptospirillum.
(recouvrement vert + rouge =
jaune => dominance des cellules
de Leptospirillum)
C. Abondance relative basée sur le
FISH
(Tyson et al., Nature, 2004)

(Tyson et al., Nature, 2004)
Single cell genome sequencing

prochaines années
Replacer l’histoire de la vie dans un

contexte temporal absolu
Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet

Temps
2011) Phylogénie et diversité des microorganismes (Céline Brochier-Armanet 2011)
(109 années)
Replacer l’histoire de la vie dans un CENOZOIC
MESOZOIC
0
contexte chronologique Explosion cambrienne

(Faune d’EDIACARA -0.52)
PALEOZOIC
0.5
Eucaryotes
PROTEROZOIC
multicellulaires (-1) 1.0

Lectures conseillées
1.5
Plus anciens
fossiles eucaryotes
(-1.8/-1.5) 2.0
PRECAMBRIAN
Oxygénéisation de
l’atmosphère (-2.3)
2.5
Plus anciennes traces de
vie non ambiguës (-2.7) Forterre, Gribaldo, Brochier Medecine Science 2005
+ Hopanes (Cyano) et Bertrand JC, Brochier C, Gouy M, Westall F. “Pendant trois milliards d'années les micro-
organismes sont les seuls habitants de la terre” Ecologie Microbienne : Microbiologie des
ARCHAEAN
stéranes (Euca) 3.0 Milieux Naturels et Anthropisés. (Presses universitaires de Pau, Eds Bertrand JC,
Traces de vie ambigües
Caumette P, Lebaron P, Normand P) 2011 (à paraître)

Brochier-Armanet C. “ Minimal cell: the biologist point of view” Origin of life (Cambridge
University Press, Eds Gargaud M, Lopez-Garcia P, Martin H) 2010;26-46
3.5 Forterre P, Gribaldo S, Brochier C. “LUCA: the last universal common ancestor” Med Sci
Plus vieilles roches (Paris). 2005;21(10):860-865
terrestres (-4.0) Thomas, Lefèvre, Raymond "Biologie évolutive" Editions de boeck (2010)
4.0
HADEAN
Bombardement
tardif (-4.1/-3.8) 4.5
(Gargaud et al. From sun to life Springer 2006) Formation de la terre

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Plantae Protista Animalia

Phylogénie et diversité des Découverts au milieu du

Place des microorganismes au sein du Est-il possible d’établir une classification

“... the ultimate scientific goal of biological

Echec de l’application du principe de subordination des caractères pour

La biodiversité des organismes actuels

L’arbre universel du vivant représente une La biodiversité actuelle ne représente qu’une

Troisième âge : Monde cellulaire post-luca

Qui était LUCA? Très peu de gènes sont communs à tous

LUCA était un organisme cellulaire

LUCA avait un génome à ???

Le répertoire n’est pas compatible avec une vie

Limites de la génomique comparée LUCA avait un génome de taille comparable

Hérédité verticale Transfert horizontal de gène -------

LUCA LUCA LUCA

Trop grande divergence Perte de gène Remplacement non homologue

Début des années 90: L’histoire de la vie est

Questions ouvertes & Grands enjeux des

(3) Émergence basale des

(3) Émergence basale des

(1) Enracinement dans la

(Woese 1994 Microbiol Rev)

Quelles sont les relations de parenté entre

Les relations de parenté entre les trois LACA 1

Trois scénarios possibles Une approche naïve Comparer les

Bacteria Archaea Bacteria

Enracinement dans la C—O C H O-

D branche bactérienne D - glycerol

Cet enracinement est-il fiable? S1

… ou parasites de l’hôte (concept de Questions relatives aux virus?

Les virus dérivent-ils de cellules?

L’origine des virus est-elle plus ancienne ou

(Moreira & Brochier, BMC Evol Biol 2008)

La question de l’origine des eucaryotes

Archaea Eucarya Bacteria Présent

La question de l’origine des eucaryotes LACA 1

Deux hypothèses sont en compétition Une question au cœur du débat scientifique

Implique l’existence de Implique l’existence de 2 domaines

…mais une absence de consensus

Retracer les grandes étapes de la

Elucider les grandes étapes de la Phylogénies basées sur l’ARNr16S (90)

(Bacteria (Sogin, 1991)

Découverte de gènes d’origine Lien entre Microsporidia & Fungi

Signature fungi, metazoa,

Arabidopsis WYKG PTLL

Fin de l’hypothèse Archezoa (fin 90s) Nouvelles méthodes d’analyse (XXIème)

La phylogénie des eucaryotes revisitée Et pout les autres domaines?

(Delsuc et al. Nat Rev Micro 2005)

Notre connaissance de la biodiversité

Explorer la diversité biologique

(Forterre et al. TPB 2002) (Lopez-Garcia et al. 2002)

La naissance de l’écologie moléculaire (90s) La diversité microbienne révélée

Cerner la diversité virale, un enjeu de taille Genome Encyclopedia of Bacteria and

Questions ouvertes & Grands enjeux des

Explorer la diversité biologique

FISH, Chromosome painting… Accéder aux fonctions biologiques

Découverte de nouveaux métabolismes: un

Découverte d’archaea nitrifiantes (2005) Séquençage & assemblage de génomes

Archaea (AmoA) A. Biofilm rose dans la mine de

Analyse de la diversité & dynamique des Analyse fonctionnelle des écosystèmes

(Tyson et al., Nature, 2004)

Single cell genome sequencing

Questions ouvertes & Grands enjeux des