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FACTORES QUE AFECTAN LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Practica N°03-Laboratorio de bioquímica
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de acelerar
las reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad
es afectada por diversos factores:

 Concentración de sustrato
 PH
 Concentración de enzima
 Temperatura
 Inhibidores
 Fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.

Concentración del sustrato: A mayor concentración del sustrato, a una concentración


fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima.

Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato


no tiene efecto en la velocidad de la reacción.

Concentración de la enzima: Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento


en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite.

Temperatura: Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos


límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura
se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad.

PH: El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago


cuyo pH óptimo es ácido.

Presencia de cofactores: Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean


activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen
cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración
dela enzima para obtener una actividad catalítica máxima

OBJETIVO: Establecer los factores que modifican la actividad enzimática


MARCO TEORICO
Factores que activan la actividad enzimática
Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas son
proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de
reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio.

Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y en los
compuestos (llamados sustratos) sobre los que actúan.

La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones


catalizadas por enzimas.

Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para
calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su
actividad catalítica con la de otras enzimas.

Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa el efecto de


un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.

La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por las
concentraciones de la enzima y el sustrato.

A medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a


expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos, en tanto que la
concentración de la enzima no se altere.

La actividad enzimática puede expresarse:

a) Por la desaparición del sustrato (S).

b) Por la aparición de productos (P).

c) Por modificación de cofactores (C).

El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:


Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:

1) Concentración de sustrato [S]

 El efecto de la concentración de sustrato [S], en la velocidad de una reacción


enzimática muestra dos etapas:

a) La velocidad de reacción aumenta gradualmente hasta hacerse a una velocidad


máxima.

b) La velocidad se mantiene constante pues todos los centros activos de las


moléculas de enzimas han sido ocupados por el sustrato, se puede decir que es un
comportamiento de saturación.

 La relación entre Vo y [S] para una reacción enzimáticas fue descrita por Leonor
Michaelis y Maude Menten en 1913 dando la ecuación de Michael-Menten.

 La principal desventaja de este modelo es que este modelo no cumple para todas
las enzimas.

2) Concentración de la enzima [E]

Las enzimas son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas. Además de
su importancia como catalizadores biológicos, tienen muchos usos médicos y
comerciales.

Un catalizador es una sustancia que disminuye la energía de activación de una reacción


química. Al disminuir la energía de activación, se incrementa la velocidad de la reacción.
La mayoría de las reacciones de los sistemas vivos son reversibles, es decir, que en
ellas se establece el equilibrio químico. Por lo tanto, las enzimas aceleran la formación
de equilibrio químico, pero no afectan las concentraciones finales del equilibrio.

De acuerdo a su complejidad las enzimas se clasifican como:

En las proteínas conjugadas podemos distinguir dos partes:

 Apoenzima: Es la parte polipeptídica de la enzima.


 Cofactor: Es la parte no proteica de la enzima.

La combinación de la apoenzima y el cofactor forman la holoenzima.

Clasificación de las enzimas según su actividad


3) pH del medio

Los cambios de PH alteraran considerablemente la naturaleza iónica de los enzimas se


sabe poco de las variaciones del PH en las enzimas.

4) Influencia de la temperatura

Las enzimas son inactivadas por el calor a temperaturas de 50ªC-60ªC inactivan


rápidamente la mayor parte de las enzimas. Esta inactivaron es irreversible, pues al
enfriar no se obtiene actividad otra vez. Esto explica que casi todos los organismos
resulten muertos a una exposición a temperatura elevada: Sus enzimas se inactivan y
resultan incapaces de reanudar su metabolismo.

Las Enzimas no son inactivadas por la congelación; las reacciones que producen tienen
a lugar muy lentamente a temperaturas bajas, o se detienen, pero la actividad catalítica
reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal

5) Efecto de inhibidores y activadores

TIPOS DE INHIBIDORES

Inhibidor Reversible

Inhibición Competitiva: El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al


mismo tiempo, esto ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una
enzima en el que se una el sustrato. El sustrato y el inhibidor compiten por el acceso al
sitio activo de la enzima.

Este tipo de inhibidor se puede superar con concentraciones suficientes altas del
sustrato, es decir dejando afuera el inhibidor.

Inhibición Mixta

El sustrato en el inhibidor afecta la unión del sustito y viceversa; este tipo de inhibidor
se puede reducir pero no se puede superar al aumentar la concentración del sustrato
aunque si se dan las cosas que se unan el sitio activo.

Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixta se unen al sitio activo (efecto
alosterico)

Donde el inhibidor se une a otro sitio activo que no es el sitio activo de la enzima todo
esto es un sitio alosterico cambia con la formación da la afinidad del sustrato por el sitito
activo reducido.

Inhibición No Competitiva

Es una forma de una inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce
su actividad pero no acepta la unión del sustrato. El grado de inhibición depende de su
concentración.

Inhibidor Irreversible:

La inhibición irreversible es diferente de la in activación enzimático reversible. Los


inhibidores irreversibles son generalmente específicos para un tipo de enzima y no
inactivan todas las proteínas.
No funcionan destruyendo la estructura proteínica, sino alterando específicamente la
estructura tridimensional del sitio activo inhabilitándola.

Los inhibidores irreversibles dan lugar a una inhibición dependiente del tiempo y por ello
su potencia no puede ser caracterizada mediante la determinación del valor. Esto se
debe a la cantidad de enzima activa a la concentración dada de inhibidor irreversible
será diferente dependiendo del tiempo de pre incubación del inhibidor con la enzima.

En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad


enzimática de la amilasa salival sobre el almidón.

La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en


componentes más pequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es producida por
el páncreas exocrino y las glándulas salivales para ayudar a digerir el almidón.

La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa” por su capacidad para romper los


enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los puntos de ramificación
no se alteran.

El producto final de la acción de la alfa-amilasa sobre el almidón es la formación de


dextrinas, maltosas y algunas moléculas de glucosa. El pH óptimo al cual actúa es 6.9
a 7 y se requiere cloro para su activación.

En la práctica la actividad enzimática se medirá por la desaparición del sustrato


(disminución de la turbidez en los tubos que contienen almidón), la cual se determinará
en el espectrofotómetro a 650 nm.
PROCESO EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO A

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DEL


ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

2) Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37°C, durante 5 minutos. El tubo VI


servirá de comparación para ver el efecto de la temperatura sobre la acción
enzimática por lo que se deja a temperatura ambiente.
3) Agregar la solución de enzima:

4) Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20 minutos, el


tubo VI se mantiene a temperatura ambiente.
5) Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la siguiente
manera:

6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.

7) Leer las absorbancia al espectrofotómetro a 650 nm.

8) La diferencia de las absorbancia entre los tubos nos indicará la actividad enzimática
para cada tubo.
9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimática en el eje Y vs concentración de
la enzima [E] en el eje X.
EXPERIMENTO B

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA


AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos: Tubos

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con todos los cinco
tubos de la misma manera que se hizo en el experimento anterior y leer las
absorbancia de dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancia se tomarán como
lecturas iniciales.
3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el baño de
agua a 37°C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las lecturas
de absorbancia se tomarán ahora como lecturas finales.
5) Hacer la diferencia:

Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura final

El resultado de esta diferencia se considerará como actividad enzimática.

6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de una gráfica


de actividad enzimática contra [S] (Ecuación de MichaelisMenten) y una gráfica de
dobles inversas: 1/actividad enzimática contra 1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk).
Graficar en papel milimetrado.
EXPERIMENTO C

EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

2) Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.


3) Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).
4) Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.
5) Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución yodada, como
en el experimento anterior.

6) Realizar el estudio crítico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.


7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimática vs pH.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué las enzimas reducen la energía de activación en una reacción
química?

La energía de activación se define como la energía de choque mínima


necesaria que se produce antes de la formación de los nuevos enlaces
químicos en los productos. La relación que existe entre esta energía y la
velocidad de la reacción es inversamente proporcional, por lo que una alta
energía de activación significa una velocidad baja, y una baja energía de
activación significa una velocidad alta. Por ello, un catalizador, como una
enzima, disminuye la energía de activación para incrementar de esta
manera la velocidad de la reacción (Holum, 2004). Las enzimas tienen la
capacidad de transformar, una a una, hasta un millón de moléculas de
sustrato, en tan solo un segundo, esta eficiencia catalítica se da debido a
que las enzimas al ser catalizadoras se van a combinar de forma
transitoria con los sustratos esto permite alcanzar un estado de transición
de menor energía de activación, aumentando así la velocidad de la
reacción (Plou, 2016).

2. ¿Explique la gráfica de los dobles recíprocos en función a la ecuación de


Michaelis - Menten?

La gráfica de los dobles recíprocos (Figura 1) o también conocida como


la gráfica de Lineweaver-Burk. Según Lira E. y Chávez R. (2013) es el
método más utilizado como una herramienta gráfica para calcular los
parámetros cinéticos de una enzima, cuyo reciproco es 1/v=Km/ (Vmax [S])
+1/ Vmax, donde v es la velocidad de reacción, Km es la constante de
Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración
de sustrato. Además, la gráfica es una forma efectiva de evaluar KM y
VMAX, representando los datos cinéticos en forma de inversos, de manera
que la pendiente sea una línea recta. Estos provienen de la ecuación de
Michealis y Menten, que determina la velocidad de la actividad enzimática
en función a la saturación y concentración de soluto (Armstrong et al,
1982). Esta gráfica se usa para determinar la actividad enzimática vs
concentración de sustrato. Para ello se calcula el recíproco de la ecuación
de M-M (Kennelly et al 2012).

Figura 1. Gráfico de Dobles recíprocos. Fuente: Lira, E. y Chávez, R.


(2013)
3. El 50% del azúcar libre del maíz, se convierte en almidón de 24 a 48hrs
después de la cosecha, perdiendo su sabor dulce y característico. Sin
embargo, el sabor se podría mantener, si las mazorcas se sumergen en
agua hirviendo, para luego enfriarse en agua fría. Explique el mecanismo
bioquímico de este proceso.

Existe una relación entre la pérdida de azúcar y la temperatura a la que


se encuentra el maíz, el concepto de unidades de calor nos explica esta
relación y además sirve para poder clasificar la madurez y adaptabilidad
a zonas particulares del maíz. Cuando existe un cambio radical de
temperatura las moléculas tienden a juntarse rápidamente de esta manera
se evita la transpiración y la pérdida de azúcar (Luchsinger et al, 2008).
Además, en el maíz dulce, la forma arrugada de su semilla y fruto se debe
a la baja concentración de almidón, la variación de la temperatura es lo
suficientemente rápida como para no causar cambios en la concentración
de azúcar de las mazorcas (Alfaro et al ,2001)
CONCLUSION
 Diferentes factores ambientales como la variación de pH, temperatura o presencia
de inhibidores pueden afectar a la actividad enzimática.

 Las enzimas son los catalizadores biológicos muy importantes ya que casi todos los
procesos en las células los necesitan para que ocurran a unas tasas significativas.

 Las enzimas suelen ser tan específicas que son incapaces de actuar sobre las
sustancias estrechamente relacionadas.
 Las enzimas vienen a ser las proteínas catalíticas que aceleran la velocidad de las
reacciones celulares al bajar la energía de activación y estabilizar las
intermediaciones del estado de transición.

 El sitio activo de la enzima comprende dos partes adicionales una región de unión
de sustrato y la otra catalítica.

 En el centro activo encontramos restos de aminoácidos constituyentes funcionales


para la catálisis del sustrato, estos utilizan las llamadas coenzimas que son
moléculas orgánicas que sufren modificaciones durante la reacción enzimático para
ayudar a la modificación final del sustrato.

BIBLIOGRAFIA
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enzimtica
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 Luchsinger, A. & Camilo, F. 2008. Sweet corn cultivars and their behavior with
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 Lexmarck P. Enzimas Catalizadoras. 2da ed. Barcelona: Atlanta; 1989.

 http://es.scribd.com/doc/78418338/Practica-de-Bioquimica-Factores-que-alteran-la-
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 Armstrong, B. Y Bennet, T. 1982. Bioquímica. Editorial: Editorial Reverte
 Kennelly, P., Rodwell, V. 2012. Harper Bioquímica ilustrada. Enzimas:
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 Lira, E. Chávez, R. 2013. Comparación de los diferentes métodos de análisis


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 http://www.blogdebiologia.com/factores-que-afectan-la-actividad-enzimatica.html