Toxicologia Lab 04

Curso de
Toxicologia Laboratorial
MÓDULO IV
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mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores
descritos na Referência Consultada.
MÓDULO IV
4 - MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICOS
A cromatografia é um método físico-químico de separação que esta inserida

em diversos métodos que auxiliam na separação de componentes semelhantes de
misturas complexas. A migração diferencial dos componentes de uma mistura, que
ocorre por diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel que pode
ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico e a fase estacionária, colocada na
coluna ou em uma superfície sólida.
Há diversas combinações entre as fases móveis e estacionárias, o que torna

a cromatografia uma técnica de muita aplicação e flexível. Os componentes da
amostra que são mais retidos na fase estacionária movem-se vagarosamente no
fluxo da fase móvel, e os componentes que se liga de forma mais fraca na fase
estacionária, movem-se mais rapidamente pela fase móvel. E estas diferenças de
mobilidade, auxiliam na análise qualitativa ou quantitativa dos componentes da
amostra que são separados em bandas ou zonas discretas.
Dentre suas aplicações a cromatografia pode ser utilizada na identificação

de compostos, por meio de comparações com padrões existentes, para a purificação
de compostos, separando as substâncias indesejadas e também na separação dos
componentes de uma mistura (Quadro 12). Os métodos cromatográficos podem ser
classificados considerando-se alguns critérios como:
• Classificação por forma física da cromatografia, que pode ser dividida

em cromatografia em coluna e planar. São vários os tipos de cromatografia em
coluna, dentre eles os mais utilizados estão: cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), gasosa (CG), enquanto que na planar estão inclusos os métodos de
cromatografia em camada delgada (CCD), em papel (CP) e eletrocromatografia.
128
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
• Classificação por fase móvel e estacionária pode ser apresentada por
três categorias: cromatografia líquida, gasosa e com fluido supercrítico.
Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida e os métodos utilizados

podem ser: líquido-líquido ou de partição onde o líquido é adsorvido em um sólido
com a partição entre os líquidos de forma imiscível; fase líquida - ligado onde as
espécies orgânicas estão ligadas a uma superfície sólida, com partição entre
líquidos e superfície ligada; líquido-sólido ou adsorção com a fase estacionário
sólido e equilibrado por adsorção; por troca iônica com a fase estacionária com
resina de troca-iônica equilibrada pela troca-iônica e por exclusão de tamanho, onde
a fase estacionária utiliza líquido em interstícios de sólido polimérico, equilibrada por
partição e ou filtração.
Quadro 12 – Classificação de métodos cromatográficos
Tipo de Cromatografia Fase Fase Processo de

Móvel Estacionária Distribuição
Cromatografia de papel L L Partilha
Cromatografia gás-líquido G L Partilha

(GLC)
Cromatografia Líquida (CL - L L Partilha

coluna)
Cromatografia de adsorção L S Adsorção

(coluna)
Cromatografia em camada L S Adsorção

fina (TLC)
129
Cromatografia gás-sólido G S Adsorção
(GSC)
Cromatografia de permuta L S Reação química

iônica reversível
Cromatografia de permeação L S Crivagem molecular

em gel
L = líquido G = gás S= sólido
Em cromatografia gasosa a fase móvel é gás e os métodos usados podem

ser: gás-líquido, com fase estacionária com líquido adsorvido em um sólido,
equilibrada por uma partição gás e líquido; fase gás-ligado com fase estacionária
com espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida e com partição entre
líquidos e superfície ligada; e gás-sólido, com fase estacionária sólida e equilibrada
por adsorção.
Na cromatografia com fluido supercrítico a fase móvel é um fluido

supercrítico com fase estacionária com espécies orgânicas ligada a uma superfície
sólida equilibrada por partição entre fluido supercrítico e superfície ligada.
Para que ocorra eluição cromatográfica em colunas, o eluente é adicionado

como fase móvel forçando o solvente que contém parte da amostra, a descer pela
coluna onde partições entre a fase móvel e porções ainda não usadas na fase
estacionária. Com adições contínuas do solvente as moléculas do soluto são
carregadas coluna abaixo entre as fases estacionária e móvel.
O isolamento das espécies separadas ocorre passando-se uma quantidade

suficiente de fase móvel pela coluna provocando o aparecimento de zonas
individuais, que ao saírem pela extremidade podem ser detectadas ou coletadas. A
diluição da amostra em geral acompanha as separações, e por isso os detectores
130
para amostras separadas devem ser sensíveis em função do processo de separação
sofrido durante a eluição 1 .
O gráfico gerado a partir da detecção do soluto, com uma série de picos é

chamado de cromatograma e é utilizado nas análises quantitativas e qualitativas. As
posições dos picos no eixo do tempo podem identificar os componentes da amostra
e as áreas abaixo dos picos dão uma medida quantitativa de cada componente da
amostra. O tempo que decorre após a injeção da amostra e que o pico do analito
demora em atingir o detector é tido como: tempo de retenção (tR).
Normalmente, a amostra ou fase móvel contém uma espécie que não fica
retida, se não houver uma dessas espécies na amostra poderá ser adicionada para
auxiliar na identificação do pico. O tempo morto (tM) é o tempo que a espécie não-
retida demora para alcançar o detector.
A velocidade relativa onde duas espécies eluem demonstram a eficiência da

coluna cromatográfica. Em medidas quantitativas de eficiência de uma coluna a
altura equivalente a um prato teórico, H e o número de pratos teóricos, N são termos
utilizados e está relacionado com a equação 4.1 onde L é o comprimento (cm) da
coluna empacotada.
N = L/H (4.1)
Portanto, a eficiência da coluna cromatográfica aumenta enquanto o número

de pratos aumenta e a altura diminui. Sendo que, a eficiência em termos de número
de pratos varia de algumas centenas a milhares e as alturas dos pratos variam entre
poucos décimos a um milésimo de centímetro. O prato teórico explica a forma
gaussiana dos picos cromatográficos e suas velocidades de movimento coluna
abaixo.
Então, a eficiência da separação cromatográfica vai depender das

velocidades relativas de eluição e dos respectivos coeficientes de partição, para que
os picos cromatográficos não se alarguem demonstrando uma diminuição da
1
Entrar no site: http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromoper.html e ver
exemplos de colunas cromatográficas, e animação sobre a separação cromatográfica.
131
eficiência de separação devido o tempo de eluição. No quadro 13 temos a descrição
de algumas variáveis que podem afetar a eficiência de uma coluna cromatográfica.
Quadros 13 – Variáveis que afetam a eficiência de uma coluna

cromatográfica
Variável Símbolo e
Unidades
Coeficiente de difusão (fase móvel) * DM (cm2.s-1)
Coeficiente de difusão (fase estacionária) * DE (cm2.s-1)
Diâmetro da partícula (fase estacionária) dP (cm)
Espessura da camada de líquido que recobre a fase dF (cm)

estacionária
Fator de retenção k’ (adimensional)
Velocidade linear (fase móvel) μ (cm.s-1)
* com o aumento da temperatura e com a diminuição da viscosidade estas variáveis podem

aumentar.
Dentre as variáveis que afetam a eficiência da coluna, algumas são

controláveis como o diâmetro das partículas da fase estacionária e o diâmetro da
coluna. Um exemplo é o das fases estacionárias líquidas, onde a espessura da
camada líquida adsorvida deve ser minimizada, pois a CE na equação 4.2 é
proporcional ao quadrado da variável df da equação de transferência de massa para
132
e da fase líquida estacionária como descrito na equação 4.3 sendo que esta
equação tem suas variáveis definidas no quadro 13.
H = A + B/u – Cu
= A + B/u + (CE + CM)u (4.2)
Onde H é a altura dos pratos em centímetros, u é a velocidade linear da fase

móvel em centímetros por segundo e as grandezas A, B e C são coeficientes
relacionados com os fenômenos de caminhos múltiplos de fluxo, difusão longitudinal
e transferência de massa entre fases.
CEu = fE (k’)d2f u (4.3)
DE
Para aumentar a resolução de uma coluna cromatográfica pode-se

incorporar na fase estacionária uma espécie que interaja com um ou mais
componentes da amostra, porém aumentar o número de pratos na coluna com
certeza melhora a resolução apesar de ter um custo alto e demandar tempo. São
diversos os números de grandezas, termos e relações que são utilizadas na
cromatografia e no quadro 14 estão relacionadas algumas dessas grandezas.
Quadro 14 – Símbolos das relações e grandezas utilizados na cromatografia
Símbolo da grandeza Denominação
CM, CE Concentração do analito nas fases móvel e estacionária
F Vazão
133
L Comprimento de coluna empacotada
(tR)A, (tR)B Tempos de retenção, espécies A e B
(t’R)A Tempo de retenção ajustado, espécie A
tM Tempo de migração, espécies não retidas
VE Volume da fase estacionária
WA, WB Larguras de pico (A e B)
A cromatografia é usada para obtenção de dados qualitativos e quantitativos,

é uma ferramenta importante no reconhecimento da presença ou ausência de
componentes de misturas com número limitado de espécies possíveis e com
identidades conhecidas.
Para confirmação de identidade é requerida a análise espectroscópica ou

química dos compostos isolados, porém é necessário que haja a separação
preliminar cromatográfica, sendo assim, a cromatografia é fundamental nas análises
qualitativas. A análise quantitativa em coluna se baseia na comparação da altura ou
da área do pico do analito com de um ou mais padrões.
Na cromatografia planar a área coberta pela espécie separada é usado

como parâmetro analítico. O método mais usado em análises cromatográficas
quantitativas utiliza uma série de soluções-padrão de composições próximas da
solução desconhecida, o que pode acarretar o erro na análise por incertezas no
volume da amostra, por exemplo.
Portanto, para obtenção de uma maior precisão em cromatografia

quantitativa a utilização de padrões internos, é uma maneira de evitar as incertezas
introduzidas na injeção da amostra. Na utilização do padrão interno, uma pequena
quantidade da amostra padrão é introduzida na amostra a ser analisada e em cada
134
padrão, e a razão entre as áreas do pico analito e do pico do padrão interno é tido
como parâmetro analítico. A largura do pico representa uma boa medida da
eficiência da coluna o que permite uma comparação entre colunas. Na figura 22 são
descritos os vários tipos de cromatografia, com seus critérios de classificação mais
usuais.
4.1 - Cromatografia Gasosa
Na cromatografia gasosa (CG) que foi inicialmente chamada de

cromatografia gás-líquido (CGL), a amostra é transportada por uma corrente de gás
por meio de uma coluna empacotada com um sólido inerte recoberta com uma
película de um líquido.
Por ser relativamente simples, ser sensível e efetivo para separar os

componentes de misturas, a cromatografia gasosa é uma das ferramentas mais
importantes em química. É amplamente usada em análises quantitativas e
qualitativas de espécies químicas e para determinar constantes termoquímicas tais
como calores de solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de
atividade.
A cromatografia gasosa também é utilizada para monitorar diversos

processos industriais de forma automática: analisando as correntes de gás em
períodos predeterminados e realizando reações de forma manual ou automática
para compensar variações não desejadas.
Há dois tipos de cromatografia gasosa: cromatografia Gás - Sólido (CGS) e

cromatografia Gás - Líquida (CGL). A cromatografia CGS se baseia na base sólida
estacionária, onde a retenção das substâncias analisáveis é a consequência da
absorção física. A cromatografia CGL é útil para separar íons ou moléculas
dissolvidas em um solvente.
135
CROMATOGRAFIA
Analítica: 2-5mm
Forma
Física
Planar Coluna Preparativa: 5- 30mm

Microdiâmetro: <2mm
Líquido Fluido
Gás Supercrítico Líquido
Móvel
Fase
Sólido Fase
Fase Ligada
Fase Ligada
Fase Ligada
Ligada
Estacionária
Líquido
Líquido
Líquido
Sólido
Sólido
Sólido
Bio Afinidade
Troca Iônica
Exclusão
Fase
cromatografia
CCD CCD CP CGFL CGS CGL CSFL CSS CLL CLS CE CLFL CTI CB
Tipo de
(HPTLC) (TLC) (GC) (SFC) HPLC - Fase normal HPLC

HPLC
Fase Normal Fase reversa
Figura 22 – Tipos mais usuais de cromatografia.
Onde: CCD = Cromatografia de cada delgada (HPTLC= Cromatografia de

alta performance de camada fina/ TLC= Cromatografia de capa fina); CP=
cromatografia em papel; CGFL= cromatografia gasosa de fase ligada; CGS=
cromatografia gás-sólido; CGL= cromatografia gás-líquido; CSFL= cromatografia
líquida de fluido supercrítico; CSS= cromatografia sólida de fluido supercrítico; CLL=
cromatografia líquido-líquido; CLS= cromatografia líquido-sólido; CE= cromatografia
eletroforese capilar; CLFL= cromatografia líquida com fase ligada; CTI=
cromatografia de troca iônica e CB= cromatografia de bioafinidade.
136
Quando a solução da amostra estiver em contato com um segundo sólido ou
fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em diferentes graus,
de acordo com as diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou
tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem
usando estas diferenças para determinar o tempo de retenção dos solutos por meio
da coluna.
Diversas análises de rotina são realizadas em um curto espaço de tempo

utilizando a cromatografia gasosa, como: na análise de contaminantes do ar, álcool
no sangue, óleos essenciais e produtos alimentícios e em exames sanguíneos, é
possível detectar com uma pequena amostra porcentagens de oxigênio, monóxido
de carbono entre outros.
Este método consiste primeiramente na introdução da amostra em uma

corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio, que
atuarão como gás de arraste. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção
no gás de arraste. O fluxo de gás passa pela coluna empacotada por onde os
componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de
interação de cada componente com a fase estacionária não volátil.
As substâncias que têm a maior interação com a fase estacionária são

retidas por mais tempo e, portanto, separadas daquelas de menor interação. À
medida que as substâncias eluem da coluna podem ser quantificadas por um
detector, por exemplo, ou então podem ser re-analisadas.
4.1.1 – Gás de Arraste
A escolha do gás de arraste depende do tipo de detector que é utilizado e

dos componentes que serão determinados. Os gases de arraste devem ser de alta
pureza e quimicamente inertes, por exemplo, hélio (He), argônio (Ar), nitrogênio (N2)
e hidrogênio (H2). O sistema do gás de arraste pode conter um filtro molecular para a
remoção de água e outras impurezas.
137
Os sistemas de injeção mais comuns para a introdução de amostras de gás
são válvulas para amostragem e seringa. As amostras gasosas e líquidas podem ser
injetadas com uma seringa. Na forma mais usual a amostra é injetada primeiro em
uma câmara aquecida, onde se evapora antes de ser transferida para a coluna.
Quando são utilizadas colunas empacotadas, a primeira parte da coluna, em

geral, serve como câmara de injeção, aquecida separadamente a uma temperatura
adequada. No caso de se usar colunas capilares utiliza-se uma câmara de injeção
separada onde somente uma pequena parte da amostra vaporizada/gasosa é
transferida à coluna, este método é conhecido como split-injection. E é necessário
para que a coluna não seja sobrecarregada com o volume de amostra.
As vazões em geral, são controladas por um regulador de pressão de dois

estágios no cilindro de gás e por algum tipo de regulador de pressão ou de fluxo
montado no cromatógrafo. Um rotâmetro no topo da coluna pode estabilizar as
vazões, porém este dispositivo não é tão preciso quanto um medidor de bolhas de
sabão simples localizado no final da coluna. Em um medidor de bolhas de sabão, um
filme de sabão é formado no caminho do gás quando um bulbo de borracha onde
tem uma solução aquosa de sabão é espremido.
O tempo para que este filme se mova é medido e convertido em vazão

volumétrica e nos equipamentos atuais, pode ser medido por equipamentos
eletrônicos de vazão controlados por computador (Figura 23).
138
Medidor de bolhas
de sabão
Controlador
Injetor
de vazão
Analisador
de dados
coluna
Gás Forno da coluna
Figura 23 – Esquema de um cromatógrafo a gás.
Ao encontrar traços da amostra, a injeção chamada on-column-injection

pode ser usada para CG capilar, nesse método a amostra líquida é injetada
diretamente na coluna com uma seringa. O solvente é evaporado para produzir a
concentração dos componentes da amostra. Quando a amostra é gasosa, a
concentração é efetuada por meio do método criogênico.
Nesse método os componentes da amostra se concentram e separam da

matriz por condensação em uma câmara de esfriamento antes da separação
cromatográfica. Porém, a injeção com válvulas de amostragem e Loop muitas vezes
é a forma escolhida para o controle de processos, onde as amostras gasosas ou
líquidas fluem continuamente por meio de uma espiral.
A espiral da amostra enche em posição off-line com uma seringa ou uma

bomba automática. Portanto, o loop é conectado em série com a coluna e a amostra
é transferida ao gás de arraste. Para usar este método é necessário concentrar a
amostra, em alguns casos.
139
4.1.2 – Detector por ionização de chama
Um detector de ionização de chama DIC (FID – flame ionization detector) é

composto por uma chama de hidrogênio (H2) e ar, e um prato coletor. O efluente
passa da coluna do CG por meio da chama, a qual divide em moléculas orgânicas e
produz íons. Um eletrodo negativo recolhe os íons e produzem um sinal elétrico. A
sensibilidade do detector de ionização de chama é alta e com uma faixa dinâmica
grande. Sua desvantagem principal é que destrói a amostra. Os detectores por
ionização de chama são usados para detectar hidrocarbonetos (HC) como o etano
(C2H6), metano (CH4), entre outros.
Para ser analisada a amostra mistura-se com hidrogênio (H2), hidrogênio

mais hélio (He) ou hidrogênio mais nitrogênio (N2). Os íons e elétrons que se
formaram na chama ficam presos em um eletrodo coletor permitindo que uma
corrente flua no circuito externo. A corrente é proporcional aos íons formados, o que
depende da concentração de hidrocarbonetos nos gases sendo então, detectada por
um eletrômetro e apresentado na saída análoga. O DIC oferece uma leitura rápida,
precisa e contínua da concentração total de hidrocarbonetos para níveis tão baixos
como ppb (parte por bilhão).
Este tipo de detector responde ao número de átomos de carbono que entram

no detector por unidade de tempo e por isso é sensível à massa e não concentração
da mesma. É utilizado para análises de diversas amostras orgânicas, na detecção
de poluentes em amostras de águas naturais, tendo uma alta sensibilidade, um largo
intervalo de resposta linear e um baixo nível de ruído.
4.1.3 - Detector fotométrico de chama
O detector fotométrico de chama (FPD) permite medições sensíveis e

seletivas de enxofre volátil e de compostos de fósforo. Por meio da formação de
140
espécies de enxofre excitado (S2*) 2 em uma chama, ocorre o princípio de detecção.
Um tubo fotomultiplicador é usado para medir a emissão de quimiluminescência
característica dessas espécies.
O filtro óptico pode ser trocado para possibilitar ao fotomultiplicador

visualizar luz de 394 nm para a medição de enxofre ou 526 nm para fósforo. A
resposta do detector ao fósforo é linear, e a resposta ao enxofre depende da
concentração. São empregados filtros para isolar as bandas e as intensidades que
são registradas fotometricamente.
Tem sido utilizado para análises de produtos da hidrogenação de carvão,

poluentes do ar e água, e de pesticidas.
4.1.4 – Outros detectores
Os detectores de condutividade térmica DCT (TCD – thermal conductivity

detector) foram um dos primeiros detectores usados na cromatografia gasosa, se
baseia na variação de condutividade térmica de uma corrente gasosa que transporta
as moléculas do analito.
O elemento aquecido pode ser um fio fino de platina, tungstênio ou um

termistor semicondutor, a resistência desse fio irá fornecer uma medida de
condutividade do gás.
A vantagem deste tipo de detector esta na simplicidade, um grande faixa

dinâmica linear, uma resposta geral tanto a espécies orgânicas como inorgânicas e
por não destruir a amostra, o que permite que após a detecção haja coleta dos
solutos. Porém é menos sensível o que impede seu uso em colunas capilares por
terem amostras muito pequenas acomodadas neste tipo de coluna.
O detector de captura de elétrons DCE (ECD – electron-capture detector) é

muito utilizado para análises de amostras ambientais, pois é capaz de detectar
2
*N2 como gás de fase móvel.
141
seletivamente halogênios contidos em compostos como pesticidas e bifenilas
policloradas. É seletivo na resposta, sendo muito sensível a moléculas que
contenham grupos funcionais eletronegativos como peróxidos, quinonas, entre
outros. Não é sensível a grupos funcionais como aminas, álcoois e hidrocarbonetos.
Há também o detector de emissão atômica DEA (AED – atomic emission

detector), onde o eluente é introduzido em um plasma de hélio energizado por
microondas que fica acoplado a um espectrômetro de emissão ótica com um
conjunto de diodos.
E ainda, os detectores termoiônicos que são seletivos com relação a

compostos orgânicos que contenham fósforo e nitrogênio. O que faz com que seja
útil para detecção e determinação de muitos pesticidas fosforados.
4.1.5 – Colunas para cromatografia gasosa
As colunas podem ser do tipo tubulares abertas ou capilares, e

empacotadas. As tubulares podem ser abertas com parede revestida que são tubos
capilares recobertos com uma fina camada de fase estacionária, ou aberta com
suporte recoberto com a superfície interna do capilar coberta por um filme fino de um
material suporte. No tipo empacotada, os tubos são empacotados com fase
estacionária de material uniforme, finamente dividida ou, com suporte sólido
recoberto com uma fina camada de fase líquida estacionária. O suporte sólido de
uma coluna empacotada tem como papel manter a fase estacionária líquida no lugar
para que uma área suficientemente grande seja exposta à fase móvel.
A fase líquida imobilizada em uma coluna de cromatografia gás-líquido

precisa abranger as propriedades como: baixa volatilidade; estabilidade térmica;
inércia química e características de solvente dos solutos. Isto é, o líquido imobilizado
deve gerar constantes de distribuição diferentes para os solutos diferentes, precisam
mostrar algum grau de solubilidade com a fase estacionária, e polaridades entre
soluto e líquido imobilizado. Os álcoois, ácidos e aminas são solutos polares,
142
enquanto que, hidrocarbonetos saturados são apolares e, os éteres, cetonas e
aldeídos são solutos de polaridade média. A polaridade da fase estacionária deve
combinar com a dos componentes da amostra a ser analisada (Quadro 15). Diversas
colunas comerciais já vêm com fases estacionárias com espessura variando entre
0,1 a 5 μm. O caráter e a capacidade de retenção de uma coluna estão ligados a
espessura do filme da fase estacionária.
Na cromatografia gasosa existe um grande número de fases estacionárias

líquidas e sólidas disponíveis comercialmente, e por isso a natureza da fase
estacionária é a variável mais importante na otimização da seletividade. As fases
estacionárias líquidas são as mais empregadas em cromatografia gasosa. Contudo,
as fases sólidas (carvão ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são
aplicadas para separação de gases e compostos de baixo peso da massa molar.
Quadro 15 – Exemplos de fases estacionárias em cromatografia gás-

líquido
Fase estacionária Temperatura Aplicações

Máxima °C
Polidimetil-siloxano 350 Fase não-polar: aromáticos

polinucleares, drogas; esteroides;
hidrocarbonetos; PCBs
Poli (fenilmetil)-siloxano 250 Drogas; esteroides, glicóis e

(50% em fenil) pesticidas
Poli (dicianoalildimetil)- 240 Ácidos graxos insaturados, ácidos

siloxano livres, álcoois e resinas ácidas
Poli (trifluorproprildimetil)- 200 Aromáticos clorados, benzenos,

siloxano nitroaromáticos
143
Em colunas empacotadas, o desempenho pode ser afetado pelo diâmetro e
uniformidade de partículas do recheio e pela carga da fase estacionária. Enquanto
que, nas colunas capilares, o diâmetro interno da coluna e a espessura do filme da
fase estacionária são importantes. Pois, quanto menor a espessura da coluna, mais
eficiente ela será. Porém, as colunas muito estreitas suportam pouca fase
estacionária, o que diminui a sua seletividade. As fases estacionárias são as
mesmas usadas para colunas empacotadas.
Geralmente, visando minimizar as perdas de fase por volatilização durante o

uso, a fase estacionária é fixada às paredes do tubo. É possível polimerizar em parte
a fase imobilizada após a deposição ou então ligá-la quimicamente às paredes (fase
ligada). A capacidade de processamento de amostra das colunas capilares é menor
que em colunas empacotadas.
4.1.6 – Aplicações da cromatografia gasosa
A cromatografia gasosa é uma técnica usada principalmente para análises

quantitativas. Tendo em vista o princípio básico da quantificação que é a área dos
picos registrados no cromatograma como proporcional à massa do composto
injetado. Desse modo, é importante para que a análise seja confiável que a área dos
picos seja medida da maneira mais exata e reprodutível possível. Existem diversas
maneiras de se medir a área de um pico cromatográfico como:
• Técnicas manuais: a partir da coleta do cromatograma por um

registrador analógico, onde a área dos picos é medida manualmente. Em geral
emprega-se o procedimento baseando na suposição do pico cromatográfico se
assemelhar a um triângulo isósceles.
• Integradores eletrônicos: são dispositivos baseados em

microprocessadores que ao coletar o sinal cromatográfico, o digitalizam, detectam a
presença de picos e calculam a sua área. Integradores costumam ser muito mais
precisos e rápidos que qualquer método manual de medida.
144
• Computadores: pode se substituir o integrador por um computador,
desde que este tenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que
possam ser armazenados em memória, e também é necessário dispor de programas
para fazer a análise do cromatograma digitalizado.
Todavia, independente do modo usado para medir a área dos picos, o

procedimento geral de uma análise quantitativa por cromatografia gasosa envolve a
obtenção do cromatograma da amostra, a medida da área dos picos de interesse e o
cálculo da massa correspondente a cada um dos picos. A curva de calibração deve
ser usada para se efetuar o cálculo da massa do composto. Por ser difícil conseguir
uma boa reprodutibilidade entre injeções diferentes, este cálculo fica muitas vezes
sujeito à grande imprecisão e inexatidão.
A padronização interna é usada para contornar este problema, onde a cada

injeção de solução, adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um composto
que seja separável dos componentes da amostra, e que não exista nela, como uma
amostra de padrão interno. Portanto para todas as soluções, tanto das amostras
como dos padrões existirá a mesma massa do padrão interno, e nesse caso, a área
do seu pico deverá ser a mesma. Assim, o pico pode ser usado para corrigir a área
dos picos dos constituintes da amostra e dos padrões, eliminando-se, em parte,
muitas deficiências da injeção.
Dentre as aplicações em análises de orgânicos e inorgânicos, duas

aplicações são as que dão a base para todos os tipos de análises possíveis na
cromatografia gasosa como a realização de separações, que tem uma excelente
aplicação em sistemas bioquímicos, complexos organometálicos ou orgânicos, com
espécies voláteis ou de espécies que possam reagir formando produtos voláteis.
A segunda aplicação é a função de proporcionar os meios para que seja

realizada uma análise completa, com os tempos e volumes de retenção sendo
empregados na identificação qualitativa e, as alturas ou áreas de picos fornecendo
informações quantitativas.
Os equipamentos de cromatografia gasosa podem ser usados acoplados a

espectrômetros de massa do setor magnético e de quadrupolos. Quando usados em
145
conjuntos, o equipamento de CG/MS é útil para identificar centenas de componentes
que constituem sistemas naturais e biológicos. Por exemplo, podem caracterizar
componentes que dão sabor aos alimentos, identificar poluentes na água,
diagnósticos médicos baseados em compostos do ar expirado, entre outros.
Quando os equipamentos de cromatografia gasosa são acoplados a

espectrometria no infravermelho com transformada de Fourier, um meio eficiente de
separar e identificar os componentes de misturas complexas é habilitado. Os dados
espectroscópicos são digitalizados, armazenados em um computador para posterior
impressão. Os espectros gasosos têm estrutura rotacional fina, ausentes em
espectros de sólidos e líquidos, fornecendo aspectos diferentes, entre espectros de
fase gasosa e de fase líquida.
Os equipamentos de cromatografia gás-sólido se baseiam na adsorção de

substâncias gasosas sobre superfícies sólidas, sendo útil para a separação de
espécies que não ficam retidas por coluna de gás - líquido, como componentes do
ar, sulfeto de hidrogênio, monóxido de carbono, entre outros.
4.2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A cromatografia líquida de alta eficiência é nos dias de hoje, a técnica

analítica de separação mais utilizada, por ser um método muito sensível capaz de
determinações quantitativas, adequado para separações de espécies não-voláteis,
espécies termicamente frágeis e por ser aplicável a diversas substâncias de
interesse para a indústria, medicina, ciência, entre outros. Os materiais que podem
ser analisados por este método são diversos, e entre estes estão: as proteínas,
ácidos nucleicos, hidrocarbonetos, drogas, pesticidas, antibióticos, várias
substâncias inorgânicas.
A eficiência da coluna em cromatografia líquida de alta eficiência esta

relacionada com as variáveis descritas no quadro 13, e os efeitos do tamanho de
uma partícula da fase estacionária e o alargamento de banda extracoluna são itens
146
específicos na cromatografia líquida de alta eficiência que podem acarretar uma
menor eficiência nas análises realizadas por esse método.
Desse modo, sabe-se que o tamanho da partícula que faz parte da fase
estacionária é muito importante, pois a eficiência de uma coluna de CLAE aumenta
conforme o tamanho da partícula diminui. O alargamento de banda extracoluna
ocorre enquanto o soluto é carregado por meio de tubos abertos como os do sistema
de injeção, da região do detector e da tubulação de conexão dos vários
componentes do sistema. Este alargamento ocorre a partir da diferença de
velocidade do fluido entre as camadas de líquido junto à parede e as camadas do
centro do tubo.
Com isso, a parte central de uma banda do soluto se move com mais
rapidez do que a parte periférica e devido à difusão em líquidos, ser mais lenta, este
tipo de alargamento acaba sendo observável. Para que este problema seja
minimizado, costuma-se diminuir o raio dos componentes extracoluna para 2,5 mm
ou menos.
Na cromatografia líquida de alta eficiência se requer pressões de

bombeamento de vários milhares de libras por polegada quadrada (psi), e por esse
motivo, o equipamento necessário para CLAE é mais sofisticado e caro do que os
utilizados em outros tipos de cromatografia. Na figura 24 temos um esquema dos
componentes importantes em um equipamento de cromatografia líquida de alta
eficiência.
147
interface
detector
Coluna
Solvente
Injetor Fase móvel bomba
seringa
Figura 24 – Componentes de um equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência.
4.2.1 – Equipamentos importantes na cromatografia líquida de alta

eficiência
Os equipamentos atuais de cromatografia líquida de alta eficiência têm como

um de seus dispositivos reservatórios de vidro ou aço inoxidável, de 200 a 1.000 mL
de solvente. São equipados com um meio de remoção dos gases dissolvidos
(oxigênio e nitrogênio) que interferem formando bolhas na coluna e nos sistemas de
detecção. Os solventes utilizados para cromatografia líquida devem ser de alta
pureza, pois, influenciam na separação cromatográfica. Podem ser utilizados na
técnica, solventes aquosos ou orgânicos bastando, que estes tenham os seguintes
requisitos:
148
• Ser compatível com o detector que se deseja operar.
• Ter capacidade de solubilizar a amostra totalmente.
• Possuir baixa viscosidade, pois, trabalhará em alta pressão.
• Não alterar as características de separação da fase estacionária da

coluna.
• Ser seguro para manuseá-lo e viável.
• Não ser muito volátil, possuir um ponto de ebulição adequado para se

trabalhar.
• Ter elevado grau de pureza, pois, a detecção de um componente

poderá ser afetada.
• Não decompor a fase estacionária.
• Possuir polaridade adequada para permitir a separação dos

componentes da amostra.
A mistura de solventes deve ser feita com líquidos que sejam miscíveis. Um
teste, com uma pequena quantidade da mistura, deverá ser realizado, para evitar o
desperdício. A compressibilidade afeta a exatidão absoluta das bombas e os seus
níveis de pulsação. A preparação da fase móvel é muito importante. O volume de
cada solvente deve ser medido numa proveta, separadamente. Devem ser
adicionados no frasco lentamente para evitar que a quantidade de gases dissolvidos
seja maior e assim, causa problemas no bombeamento. Todo o solvente utilizado na
cromatografia líquida deve ser filtrado com membranas de 0,2 a 0,45 μm de
porosidade, para evitar que obstrua o sistema e o danifique.
No frasco reservatório do solvente deve-se utilizar um filtro poroso de 10 μm.

Uma medida usada para aumentar a reprodutibilidade e a estabilidade do detector, é
desgasificar a fase móvel por meio do borbulhamento com o gás hélio ou de um
sistema a vácuo. Por vezes, os sistemas também contêm um meio de filtrar poeiras
e material particulado dos solventes, evitando assim que ocorram danos aos
sistemas de bombeamento e de injeção. Nem sempre é preciso que exista um
149
sistema para resolver esse problema, pois o solvente pode ser tratado antes de ir
para o reservatório, passando-os por um filtro sob vácuo, por exemplo.
Aditivos, como antioxidantes, também são usados para a preservação da

fase móvel, por exemplo, pode ser usada uma pequena quantidade de BHT (di-terc-
butil metil fenol) no tetrahidrofurano, para evitar a formação de peróxidos. Quando é
empregado um único solvente de composição constante, a separação é chamada de
eluição isocrática.
A limitação deste sistema, é que em algumas amostras mais complexas, não

é possível separar todos os seus componentes devido à polaridade do solvente da
fase móvel também permanecer constante. A resolução neste caso é pequena, e os
picos eluem muito rápido.
Quando se almeja que a eficiência da separação seja aumentada pela

eluição do gradiente, são utilizados dois ou três sistemas de solventes, que diferem
entre si em polaridade. O solvente usado para fase reversa tem polaridade maior
que a fase estacionária e na fase normal, a polaridade da fase estacionária é maior
que a do solvente. A composição da fase móvel varia ao longo de toda análise. É
muito útil para a separação de amostras complexas ou quando as polaridades dos
compostos, a separar são muito diferentes.
A polaridade modificada, devido à força do solvente, faz com que a coluna

seja limpa durante a corrida. A vazão do solvente é muito importante na
cromatografia líquida, pois esta deverá ser muito estável, para não afetar a
separação dos componentes na coluna. Normalmente esta vazão é de 1 mL/min.
O sistema de bombeamento deve seguir requisitos como: geração de

pressões de até 6.000 psi; saída com ausência de pulsos; velocidades de fluxo
variando de 0,1 a 10 mL/min; controle de fluxo; componentes resistentes à corrosão
(aço inoxidável ou teflon). Existem três tipos de bombas atualmente, as recíprocas,
as do tipo deslocamento ou de seringa e bombas de pressão constantes ou
pneumáticas. As mais utilizadas são as recíprocas que são compostas por uma
pequena câmara onde o solvente é bombeado por meio de um movimento para trás
e para frente de um pistão controlado por um motor. Onde duas válvulas de esfera
150
se abrem e fecham de forma alternada, controlando o fluxo de solvente para dentro
e fora de um cilindro.
A desvantagem deste tipo de bomba reside no fato de que produz um fluxo

pulsado que deve ser amortecido, pois, apresenta-se como um ruído de fundo, na
linha de base do cromatograma. Porém, por terem um volume interno pequeno e
gerarem altas pressões de saída (até 10.000 psi), aliado a fácil adaptabilidade à
eluição com gradiente e vazões constantes, que são independentes da pressão de
retorno da coluna e da viscosidade do solvente, são as mais utilizadas em CLAE.
Alguns sistemas de bombeamento possuem dispositivos controlados por

computador para a medida de vazão com a determinação da queda de pressão por
meio de um restritor que fica na saída da bomba, sendo possível alterar a velocidade
do motor da bomba, quando ocorre uma diferença no sinal comparado a um valor
preestabelecido.
A maneira como a amostra é injetada no sistema de injeção do equipamento

é um fator limitante na precisão das medidas em cromatografia líquida de alta
eficiência, pois nem sempre a reprodutibilidade de uma amostra introduzida na
coluna é possível. O meio mais simples de introdução da amostra é a injeção com
seringa por meio de um septo de elastômero auto-selante. As seringas usadas para
este fim são projetadas para suportar pressões de até 1.500 psi.
O método mais utilizado para introduzir amostras em cromatografia líquida

de alta eficiência se baseia em alças (loop) de amostragem, que em geral fazem
parte dos equipamentos de cromatografia líquida, com alças intercambiáveis
possibilitando a escolha de tamanhos de 5 a 500 μL.
A coluna cromatográfica é a responsável pela separação dos componentes

de uma amostra. É um tubo de aço com um diâmetro interno, que varia de 4 a 10
mm e de comprimento com 10 a 30 cm, podendo ser menores de 3 a 7,5 cm. As
colunas possuem filtros nas suas duas extremidades para protegê-la de substâncias
que possam danificá-las, e uma seta que indica qual deverá ser o sentido do fluxo
de operação do solvente ao instalá-la.
151
Costumam ter cerca de 100.000 pratos/metro e apresentam a vantagem de
serem velozes com um consumo mínimo de solvente. Normalmente usam-se
colunas menores, pré-colunas, para reter partículas grandes que danificariam a
coluna. A composição química da amostra é que determina que tipo de fase
estacionária deva ser usado. O volume de amostra injetada na coluna dependerá da
quantidade do componente que se deseja analisar e da sensibilidade do detector em
uso.
Em alguns casos, utiliza-se mais de uma coluna em série. O diâmetro das

partículas de empacotamento das colunas é muito importante na separação dos
componentes de uma amostra, o mais usual é o de 5 μm. Quando uma pré-coluna é
utilizada antes da coluna analítica, obtêm-se uma durabilidade por remoção do
material particulado e de contaminantes do solvente. Na cromatografia líquido-
líquido, a pré-coluna auxilia na saturação da fase móvel com a fase estacionária
minimizando as perdas desse solvente.
As fases estacionárias (material que preenche as colunas) são compostas

por dois tipos na cromatografia líquida, que são: pelicular ou de partícula porosa. A
pelicular é composta por leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com
diâmetros da ordem de 30 a 40 μm. Uma camada fina e porosa de sílica, alumina,
resina sintética de poliestireno-divinil-benzeno ou resina trocadora de íons é
depositada sobre a superfície desses leitos.
Em algumas aplicações, é adicionada uma fase líquida estacionária mantida

no local por adsorção, ou os leitos podem ser tratados quimicamente para obter uma
camada superficial orgânica. As fases estacionárias peliculares são mais utilizadas
em pré-colunas.
No caso da fase estacionária de partícula porosa típica para cromatografia

líquida é composta por micropartículas porosas com diâmetros entre 3 a 10 μm, que
é constituída por sílica, alumina, resina sintética de poliestireno-divinil-benzeno ou de
resina de troca iônica. As partículas de sílica são preparadas aglomerando partículas
submicrométricas em condições que levam a partículas maiores com diâmetros
152
uniformes que são recobertas com filmes orgânicos que são química ou fisicamente
ligados à superfície.
Os detectores são os responsáveis pela detecção dos componentes de uma

amostra durante a sua eluição. Eles medem e indicam a variação da composição da
fase móvel ao sair da coluna cromatográfica, por meio de um sinal elétrico. Os
detectores de cromatografia líquida são de dois tipos básicos: detectores de
propriedades universais ou globais e os detectores de propriedade do soluto. A
escolha do detector é importante e depende das características do material a ser
analisado como: sensibilidade, repetibilidade, forma do pico, vazão, temperatura
entre outros.
Os detectores de Índice de Refração são considerados detectores

universais, respondem à maioria dos solutos, são confiáveis e não são afetados pela
vazão. Porém, são muito sensíveis à temperatura, devendo ser mantidos a uma
temperatura constante. Não se recomenda usá-los com operação de gradientes,
porque a variação da composição da fase móvel causa a variação do índice de
refração.
Vários detectores de absorbância são dispositivos de feixe duplo onde um

feixe passa por meio da cela do eluente e o outro por meio de um filtro que reduz a
sua intensidade. Detectores fotoelétricos germinados são usados para comparar a
intensidade dos dois feixes. Os detectores de absorbância no ultravioleta com filtros
mais simples são fotômetros com uma lâmpada de mercúrio como fonte, onde a
linha intensa em 254 nm é isolada por filtros, porém em alguns equipamentos podem
absorver em 250, 313, 334 e 365 nm.
Este tipo de detector limita seu uso a solutos que absorvam num
comprimento de onda, dentro dos que são possíveis. Quando o equipamento está
equipado com discos contendo vários filtros, estes podem detectar várias espécies,
enquanto eluem. Muitos equipamentos de CLAE vêm com detectores compostos por
um espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, onde vários modos de
operação podem ser escolhidos. Os detectores espectrofotométricos ultravioleta de
153
maior alcance são os equipamentos com arranjo de diodos, pois permitem a coleta
de dados de um espectro em apenas um segundo.
Os detectores de fluorescência são similares aos fluorímetros e

espectrofluorímetros, pois os detectores mais simples nesta modalidade empregam
uma fonte de excitação de mercúrio e um ou mais filtros para isolar a banda de
emissão de radiação. É um método sensível, e tem seu uso principalmente em
produtos que fluorescem como os materiais farmacêuticos, amostras clínicas,
produtos de petróleo, entre outros.
Os detectores eletroquímicos se baseiam na amperometria, polarografia,

coulometria e condutometria. São muito sensíveis, de simples operação e com alta
aplicabilidade, pois podem detectar inúmeros grupos funcionais, como:
hidrocarbonetos, ésteres, aldeídos, aminas, hidroxilas aromáticas,
halogênios, entre outros. Nesse tipo de detecção é possível ter uma configuração
onde o eluente flui num primeiro momento sobre um eletrodo e depois sobre um
segundo eletrodo, requerendo assim que o analito sofra uma oxidação (ou redução)
reversível no primeiro eletrodo. E nesse caso, o segundo eletrodo opera como um
cátodo (ou um ânodo) para determinar o produto de oxidação (ou redução), e por
isso, a seletividade desse sistema é muito alta.
Os detectores de espectrometria de massa mais utilizados atualmente usam

uma interface chamada termospray, que é um termonebulizador que atua como
interface, onde o efluente total da coluna é introduzido no detector de forma direta. E
dessa forma, o líquido é vaporizado à medida que passa por um tubo capilar
aquecido de aço inoxidável, formando um jato de aerossol de moléculas do solvente
e do analito. Este analito é ionizado por um mecanismo de troca de carga com um
sal que é incorporado ao eluente.
Portanto, o termonebulizador é ao mesmo tempo uma interface e uma fonte

de ionização. Há equipamentos com interface onde é possível a obtenção de
espectros por ionização química ou por impacto de elétrons e nesse dispositivo, a
nebulização térmica e a dessolvatação ocorrem ao mesmo tempo produzindo uma
mistura de moléculas de soluto particulado e de moléculas da fase móvel gasosa.
154
Este aerossol é acelerado por um esguicho para a região do vácuo onde as
moléculas da fase móvel são bombeadas para fora. O computador armazena os
dados gerados por esse tipo de detector e os cromatogramas podem ser obtidos
tanto no momento da análise ou após a mesma.
4.2.2 – Outros tipos de cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia de partição é utilizada para os quatro tipos de técnicas da

cromatografia líquida e pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e de
fase ligada. As colunas para cromatografia de partição de fase ligada têm os
suportes preparados com sílica rígida ou com composições baseadas em sílica. Os
empacotamentos para fase ligada são classificados como sendo de fase reversa
quando a cobertura ligada tem caráter não polar, e como fase normal quando o
recobrimento contém grupos funcionais polares.
Em diversas aplicações da cromatografia em fase reversa, que tem sido a

mais utilizada na cromatografia líquida de alta eficiência, a eluição é feita com fase
móvel altamente polar, como uma solução aquosa contendo várias concentrações
de solventes, como acetonitrila e tetrahidrofurano. Nesse caso é preciso evitar
valores de pH maiores que 7,5 para que não ocorra a hidrólise dos siloxanos, que
leva à degradação ou destruição da fase estacionária.
É preciso que haja um equilíbrio entre as forças intermoleculares 3 e os três

participantes no processo de separação que são o soluto, a fase móvel e a fase
estacionária, para que a cromatografia seja realizada com sucesso. Portanto, as
polaridades do soluto, da fase móvel e da fase estacionária devem ser combinadas
para que boas separações cromatográficas sejam obtidas e em tempo razoável.
Alguns solventes são chamados de “fortes” por interagirem com os solutos. Diversos
índices foram definidos para descrever quantativamente a polaridade dos solventes,
3
Leitura adicional sobre forças intermoleculares disponível em:
http:www.qmc.ufsc.br/química/pages/especiais/revista_especiais_forcas_intermoleculares.html
155
onde o índice de polaridade é uma medida numérica da polaridade relativa dos
solventes. O quadro 16 descreve os índices de polaridade, refração, ponto de
ebulição de alguns solventes. E pode-se observar que a água tem um índice de
polaridade superior a de outros solventes.
Quadro 16 – Exemplos de fase móvel em cromatografia
Solvente Força do Índice de Polaridade Índice de

eluente Refração*
Água Grande 10,2 1,333
Acetonitrila 0,65 5,8 1,341
Clorofórmio 0,40 4,1 1,443
Etanol 0,88 4,3 1,359
Metanol 0,95 5,1 1,326
Tetrahidrofurano 0,57 4,0 1,405
*temperatura em 25 °C.
A cromatografia de partição é aplicada em diversos campos como:

bioquímico (aminoácidos, proteínas, lipídios); clínica médica (ácido de bílis,
metabólitos de drogas, estrógenos); farmacêutico (antibióticos, esteroides); produtos
alimentícios (antioxidantes, aditivos); produtos químicos (corantes industriais,
surfactantes); poluentes (pesticidas, herbicidas) e química forense (drogas tóxicas,
venenos, narcóticos). Ao utilizar esse tipo de cromatografia é por vezes,
recomendável converter os componentes de uma amostra a um derivado antes da
156
análise ou dependendo do caso, após a separação cromatográfica. Este tratamento
é recomendado quando se deseja reduzir a polaridade das espécies para que seja
possível usar a partição em vez da adsorção ou colunas de troca iônica, para
aumentar a resposta do detector, a sensibilidade e ainda, aumentar a resposta
seletiva do detector a certos componentes da amostra.
Se a cromatografia de par iônico for a escolhida para a separação

cromatográfica, a fase móvel é composta por um tampão aquoso com um solvente
orgânico (metanol ou acetonitrila) e um composto iônico que contêm um contra íon
de carga oposta à do analito. O contra íon é um íon que se combina com o íon do
analito para formar um par iônico, espécie neutra que é retida na coluna de fase
reversa. A eluição dos pares iônicos é então acompanhada com uma solução
aquosa de metanol ou de outro solvente orgânico solúvel em água.
A cromatografia de pares iônicos é o método de escolha para análises de

surfactantes (tensoativos), principalmente por terem alta afinidade por trocadores de
íons, o que dificulta sua eluição.
A cromatografia de adsorção ou líquido-sólido utiliza como fases

estacionárias a sílica e alumina. Variações enormes na resolução e nos tempos de
retenção acompanham as variações no sistema de solvente e muito raramente não
se obtêm uma fase móvel apropriada. Esse tipo de cromatografia é mais adequado
para amostras solúveis em solventes aquosos como os usados na fase reversa e
uma vantagem deste método é sua habilidade em diferenciar componentes de
misturas isoméricas.
Os métodos que separam e determinam íons com base em resinas

trocadoras de íons são também denominados de cromatografia de troca iônica. Os
processos de troca iônica se baseiam no equilíbrio da troca entre íon em solução e
íon de mesmo sinal na superfície de um sólido insolúvel com alto peso molecular. As
argilas e zeólitas são trocadores de íons naturais e são muito utilizadas. Também
foram desenvolvidas resinas trocadoras sintéticas para amolecer água, deionização
da água e para purificações de soluções. A fase móvel usada na cromatografia de
troca iônica deve ter as mesmas propriedades requeridas nos outros tipos de
157
cromatografia, podendo conter quantidades menores de metanol ou outro solvente
miscível em água.
Também são compostas por espécies iônicas, em geral um tampão. O tipo e

a concentração desses ingredientes determinarão a força e seletividade do solvente
escolhido. Sendo que, geralmente os íons da fase móvel competem com os íons do
analito pelos sítios ativos da fase estacionária de troca iônica. A aplicação deste tipo
de cromatografia abrange vários sistemas orgânicos e bioquímicos, incluindo drogas,
conservantes de alimentos, açucares, entre outros.
A cromatografia de exclusão de íons mesmo sendo neutra, emprega colunas

de troca iônica para realizar as separações cromatográficas. É amplamente utilizada
na identificação e determinação de espécies ácidas como café, leite e vinho. Sais de
ácidos fracos também podem ser analisados, pois, são convertidos ao ácido
correspondente por íons hidrogênio no trocador.
Quando o método é o de cromatografia de exclusão por tamanho (ou

cromatografia por permeação em gel ou ainda, filtração em gel), aplicável a espécies
de alto peso molecular. Dois tipos de empacotamento da coluna são descritos como:
leitos de polímeros e partículas à base de sílica, ambos com diâmetros de 5 a 10
μm. As colunas empacotadas por partículas à base de sílica oferecem vantagens por
serem mais rígidas, empacotar mais facilmente e com pressões maiores, com mais
estabilidade, permitindo seu uso com diversos solventes, incluindo água, e também
por possuir uma maior rapidez para atingir o equilíbrio com novos solventes e por ser
estável em altas temperaturas.
Como desvantagem, as partículas de sílica podem reter solutos por

adsorção e tem potencial para catalisar a degradação de moléculas do soluto. Além
de separar moléculas de produtos naturais de alta massa molecular e sais, também
é possível por meio da permeação por gel separar homólogos e oligômeros, e com
rapidez na determinação da massa molecular ou da distribuição de massa molecular
de polímeros maiores ou de produtos naturais.
A cromatografia planar é baseada em técnicas de camada delgada, por ser

mais rápida, com melhor resolução, e ser mais sensível que a correspondente em
158
papel. Todavia, estão inclusos na cromatografia em camada delgada (CCD),
cromatografia de papel (CP) e eletrocromatografia. Cada uma utiliza uma camada
fina e plana de material que é auto-suportado ou que reveste uma superfície vítrea,
plástica ou metálica. O deslocamento da fase móvel pela fase estacionária ocorre
por ação da capilaridade, em alguns casos, auxiliado por potencial elétrico ou
gravitacional.
É utilizada com propriedade na indústria de produtos químicos para

determinações importantes de pureza, tem sido usada também em estudos de
bioquímica e biologia. Serve como guia para o estabelecimento de condições ótimas
para a realização de separações por cromatografia líquida em coluna.
4.3 - Eletroforese Capilar e Eletrocromatografia Capilar
Este método de separação que pode ser definido como sendo a migração de
espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas
ou suspensas em um eletrólito, por meio do qual uma corrente elétrica é aplicada. É
empregada para separações analíticas complexas como em ânions, aminoácidos,
drogas, proteínas, e diversas outras espécies. É uma técnica muito eficiente para
separar macromoléculas o que é de interesse da indústria biotecnológica, e para a
biologia e bioquímica.
Para uma separação eletroforética ocorrer uma pequena quantidade de

amostra é injetada numa solução tampão aquosa contida em um tubo estreito ou em
um suporte poroso e plano, como papel ou gel semi-sólido. Aplica-se então, um alto
potencial de corrente contínua ao longo do comprimento do tampão por meio de um
par de eletrodos localizados nas extremidades.
A aplicação desse potencial faz com que os íons da amostra migrem em

direção a um ou a outro eletrodo. As separações são baseadas nas diferenças das
relações carga/ tamanho dos analitos da amostra. Se um potencial alto for aplicado
159
por meio de um tubo capilar contendo solução tampão, ocorre um fluxo
eletroosmótico, onde o solvente migra em direção ao catado ou ao ânodo.
Para introduzir uma amostra normalmente utiliza-se a injeção eletrocinética

ou a injeção por pressão. Quando for aplicar a amostra com a injeção eletrocinética,
uma extremidade do capilar e seu eletrodo são removidos do compartimento do
tampão e colocados onde contém a amostra. Aplica-se um potencial por um tempo
determinado, para que a amostra penetre no capilar por meio da migração iônica e
fluxo eletroosmótico.
Então, o eletrodo e o terminal do capilar são colocados novamente na

solução tampão pelo tempo de separação. Se for utilizar a injeção por pressão, a
extremidade do capilar usada na introdução da amostra é colocada em um recipiente
com a amostra e uma diferença de pressão é usada para dirigir a solução da
amostra para o capilar.
4.4 - Miscelânea de Métodos
Neste tópico serão descritos alguns protocolos para serem usados em

métodos para análises utilizando cromatografia líquida de alta eficiência e/ou
espectrometria de massas. Para que os métodos sejam executados de maneira
correta alguns cuidados precisam ser observados como:
• Todo espécime biológico, fresco ou fixado, só deve ser manipulado

com cuidado e com luvas nas mãos, bem como os produtos químicos, que não
devem ser inalados e nem descartados em qualquer pia.
• As superfícies como bancadas, devem ser descontaminadas pelo

menos uma vez ao dia, a limpeza e higiene do laboratório devem ser mantidas e de
preferência que seja livre de materiais que não esteja relacionado com os
experimentos.
160
Cuidados como estes e muitos outros que fazem parte das boas práticas
laboratoriais devem ser observados rigorosamente, se é pretendido executar um
trabalho com eficiência e reprodutibilidade.
4.4.1 - Método para extração de DNA de fígado de camundongos da

linhagem C57Bl/6J
Este método é utilizado para a análise de adutos de DNA induzidos por

tetrahidrofurano em fígado de camundongos da linhagem C57BI/6J.
No primeiro dia:
- homogeneizar o órgão em 20 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M/ e

EDTA 5 mM pH 7,4.
- para obter aproximadamente 500 mg de tecido, acrescentar: 5 mL de

Tampão A; homogeneizar novamente e, centrifugar em 1500g por dez minutos.
- coletar o pellet [descartar o sobrenadante], ressuspender em 5 mL de

Tampão A 4 , homogeneizar novamente e centrifugar em 1500g por dez minutos.
- coletar o pellet [descartar o sobrenadante], ressuspender em 6 mL de

Tampão B, adicionar 350 μL SDS 10%.
- agitar bem, adicionar 30 μL RNAse A, 4 μL RNAse T1 e incubar a 37 °C por

uma hora.
- adicionar após este tempo 300 μL de Proteinase K [20 mg/mL], incubar a

37 °C por uma hora.
- colocar as amostras em tubo corex (de vidro ou plástico resistente) e

centrifugar a 5000g por quinze minutos.
4
Os tampões e soluções citados neste método estão descritos no Anexo A.
161
- coletar desta vez o sobrenadante, adicionar 4 mL solução NaL, adicionar
8mL isopropanol 100% e inverter os tubos para precipitar o DNA guardando no
freezer até o dia seguinte.
No segundo dia:
- centrifugar a 5000g por quinze minutos, descartar o sobrenadante.
- adicionar 10 mL de isopropanol 60%, e centrifugar a 5000g por quinze

minutos.
- lavar o DNA com 10 mL de etanol 70%, centrifugar a 5000g por quinze

minutos.
- descartar o sobrenadante, adicionar 300 uL de desferroxamina [0,1mM],

agitar [para dissolver DNA] e deixar na geladeira para dissolver até o dia seguinte.
No terceiro dia:
- medir absorbância a 260nm e 280nm e fazer extração da amostra com

clorofórmio [mesma quantidade da amostra].
- centrifugar por cinco minutos a 5000 rpm, coletar o sobrenadante.
Após estas etapas, a amostra deverá ser hidrolisada para ser posteriormente
analisada em HPLC/detecção eletroquímica, para se obter as curvas de calibração
para quantificação das amostras.
Na hidrólise de DNA utilizando DNAse I e PDEI (fosfodiesterase I)

substituindo a Nuclease P1, é necessário acrescentar em cada 100 µg de DNA:
0,031U (U=unidade) de PDE1 e 1,25U de DNAse1 (não se deve agitar a DNAse1
fortemente).
Para iniciar a hidrólise:
- colocar em 200µg de DNA (em 100 µL de água), 10 µL de Tris 200 mM, 10

µL MgCl2 2 M, 10 µL DNAse I (2,5 U) e incubar por 1,5h a 37oC.
162
- depois acrescentar: 10 µL glicina-acetato (0,2 M) pH 10, 40 µL PDE I
(0,062 U) e incubar por mais 1,5h a 37oC.
- após este tempo acrescentar: 50 µL tampão Tris-HCl + MgCl2 - 200 mM pH

7,4; 4 µL de fosfatase alcalina (6U).
- incubar por mais 1h a 37oC.
Terminada a hidrólise as amostras estão prontas para serem analisadas por

HPLC e por espectrometria de massa (Hermida, 2007).
4.4.2 - Protocolo de dosagem de proteína pelo método de Bradford
O método se baseia na observação de que o azul brilhante de coomassie G-

250 se converte da cor vermelha para azul após ligação à proteína. O complexo é
formado rapidamente (2 minutos), permanece disperso em solução por um tempo
relativamente longo, uma hora, e tem um alto coeficiente de extinção, o que permite
grande sensibilidade na dosagem das proteínas (Bradford, 1976).
As soluções usadas neste método são:
• Solução A: NaCl 0.15 M;
• Solução de proteína (albumina bovina) 1 mg/mL;
• Solução de dosagem;
Os reagentes para solução de dosagem:
• 100 mg de azul de coomassie G-250, dissolvido em 50 mL de etanol

100%;
• 100 mL de ácido fosfórico 85%;
• Água miliQ qsp 1000 mL;
163
Para preparação precisa: dissolver o azul de coomassie em etanol 100%, e
após dissolver, adicionar o ácido fosfórico 85%, homogeneizar bem (por mais ou
menos 5 minutos). Depois acertar o volume com água miliQ.
A curva padrão para dosagem de proteínas é construída utilizando-se

albumina de soro bovino (10 -100 μg de albumina em 100 μL de solução A).
Observação importante: todas as diluições das amostras de proteínas

(albumina) e amostra a ser analisada (exemplo: microssomos) devem ser
preparadas em solução A, para depois adicionar a solução de dosagem em todas ao
mesmo tempo.
Exemplo: Proteína (Albumina bovina) de 20 a 100 μg/ 100mL em solução A,

divididas em amostras para construção da curva de calibração como:
20 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 80 μL de solução A + 5 mL de solução de

dosagem;

dosagem;

dosagem;

dosagem;
100 μL de Albumina (1 μg/ μL) + 5 mL de solução de dosagem.
Para preparar a amostra e o branco para medir a absorbância:
• Amostra: 5 μL do homogenato de microssomos + 95 μL de solução A +

5 mL de solução de dosagem;
• Branco: 100 μL da solução A e 5 mL da solução para dosagem.
Exemplo de medida de Absorbância em 595 nm: em 20 µg de proteína a

absorbância medida foi de: 0,011. Para determinar a concentração de proteína em
cada diluição: 20 μg/5100 μL, é feita uma conta usando a regra de três:
164
Ex: 20 μg .................5100 μL
x..........................................1 μL → x = 0,00392 μg/ μL
Seguindo este exemplo, para construir uma curva de calibração temos:
µg/μL de proteína Absorbância Correspondendo a μg de albumina
0,00392 0,011 20
0,00784 0,188 40
0,01176 0,367 60
0,01568 0,575 80
0,01960 0,818 100
Amostra do exemplo para curva de calibração = 0,614 µg/μL
Curva padrâo para d

proteína
0,9
0,8
m0,7
n0,6
5
90,5
50,4
0,614 = 41,266x - 0,0616
-41,266x = - 0,0616 - 0,614
x = -0,6756/ -(41,266)
x = 0,01637 µg/µL
165
Para saber a quantidade de microssomos na amostra:
0,01637µg………………....….….1 µL
x.................................………5100 µL
x = 83,48 µg/µL de microssomos
Sendo que o volume total de diluição da amostra é: 5 μL de microssomos +

95 μL solução A + 5000 μL solução dosagem (Borges, 2007).
4.4.3 - Protocolo de extração de microssomos
Para fazer extração de microssomos é preciso alguns equipamentos e

materiais como: Centrífuga; Ultracentrífuga; Tubo de ultracentrífuga; Frasco 200 mL;
Eppendorfes 2 mL; Homogeneizador manual. Sais e solventes; Fosfato de potássio;
EDTA; Água miliQ.
O procedimento para esta extração consta das seguintes etapas:
• Homogeneizar o fígado (500 mg) em 20 mL de tampão fosfato de

potássio 0.1 M/ EDTA 5 mM pH 7.4;
• Centrifugar o homogenato a 16.900g por 15 minutos 4 °C (descartar o

precipitado);
• Centrifugar o sobrenadante a 105.000g por 95 minutos, 4 °C.

(descartar o sobrenadante);
• Ressuspender o precipitado em 7 mL de tampão fosfato de potássio

0.1M/ EDTA 5 mM pH 7.4;
• Centrifugar 105.000g por 95 minutos (Descartar o sobrenadante);
166
• Ressuspender o precipitado em tampão fosfato 0.1M/ EDTA 5 mM pH
7.4
• Separar em alíquotas e armazenar em freezer –80 °C.
Estas amostras poderão ser analisadas posteriormente, juntando-se a DNA

para análises de adutos, por exemplo, ou em análises que sejam necessárias as
avaliações de microssomos em HPLC .
4.4.4 – Métodos térmicos
Os métodos térmicos são técnicas de multicomponentes e incluem

termogravimetria, análise diferencial térmica e calorimetria diferencial de varrido.
Estes métodos são largamente utilizados em controle da qualidade e em aplicações
de investigação sobre produtos industriais como polímeros, farmacêuticos, metais e
ligas.
Em termogravimetria (TG) a análise da massa da amostra em uma

atmosfera controlada é medida como uma função de temperatura ou de tempo. E
pode ser usada para monitorar qualquer reação que envolve uma fase de gás como
a oxidação ou desidratação e também em processos físicos como vaporização,
sublimação e dessorção. Os instrumentos de termogravimetria são compostos por
uma balança analítica sensível, um forno, um sistema de gás de purga e um sistema
de manejo de dados.
A análise térmica diferencial (DTA) é um método onde a diferença na

temperatura entre uma substância e um material usado como referência é medida
em função da temperatura, e a substância e o material de referência são medidos
por um gradiente de temperatura controlada. Normalmente, a câmara da amostra e
da referência dos dispositivos térmicos diferenciais é projetada para que seja
possível a circulação de um gás inerte, como o nitrogênio, ou então por um gás
reativo como o oxigênio.
167
Esse método é muito utilizado na determinação do comportamento e na
composição de produtos manufaturados e também nos naturais.
O método de calorimetria exploratória diferencial (DSC), se baseia na

medida das diferenças no fluxo de calor na substância e referências como uma
função da temperatura da amostra, sendo que essas duas variáveis estão
submetidas a um programa de temperatura controlada.
Em geral, os estudos de calorimetria exploratória diferencial são realizados

em modo de varredura de temperatura. Tem aplicações na indústria farmacêutica,
em testes de pureza de fármacos, por exemplo.
4.5 - Métodos de Análise Automatizados
Um método automatizado é providencial em laboratórios que tem uma

demanda muito grande, pois seu custo é alto e não é fácil de ser posto em
operação. Além da velocidade podendo viabilizar a monitoração da composição de
produtos enquanto são produzidos. São muito úteis na medicina por oferecer
resultados analíticos rapidamente, podendo auxiliar na determinação das condições
apresentadas pela resposta do paciente a uma terapia.
São divididos em dois sistemas analíticos os analisadores discretos e

analisadores de fluxo contínuo, podendo ser combinados em alguns casos. Os
equipamentos do sistema discreto operam com recipientes individuais, eliminando o
problema de contaminação entre amostras, o que às vezes, pode ser um
complicador em sistemas contínuos, pois à medida que a velocidade da injeção
aumenta as interações entre as amostras podem aumentar também.
A detecção nos procedimentos de injeção em fluxo pode ser feita por

absorção e emissão atômica, fluorômetros, sistemas eletroquímicos,
espectrofotômetros e fotômetros. A separação por diálise, por extração líquido/
líquido e por difusão gasosa, pode ser realizada automaticamente com este sistema.
168
Na preparação de sólidos, definição e dissolução da amostra, operações
unitárias como a moagem se fazem necessárias e este procedimento pode ser
automatizado e realizado por pequenos robôs de laboratório. O sistema robótico é
controlado por um microprocessador que pode ser programado pelo usuário. Nessa
programação o robô pode ser instruído a trazer pequenas amostras ao laboratório
central para serem diluídas, filtradas, tratadas com reagentes, entre outros.
A instrução também pode ser para que as amostras sejam aquecidas, para
que sejam injetadas em uma coluna cromatográfica e também para coleta de frações
de uma coluna. Estes métodos auxiliam e agilizam os procedimentos com grande
demanda, principalmente nas rotinas onde diversas tarefas repetitivas são
necessárias.
4.6 – Questões para estudo
1 – Que métodos podem ser utilizados na cromatografia líquida?
2 – Quais as variáveis que podem afetar a eficiência de uma coluna

cromatográfica?
3 – As soluções padrões são usadas com que propósito nas análises

cromatográficas quantitativas?
4 – Que detector se baseia na condutividade térmica e que espécies o

mesmo detecta?
5 – Quais os tipos de colunas para cromatografia gasosa? Descreva cada

tipo.
6 – Ao acoplar um equipamento de cromatografia gasosa a um

espectrômetro, quais são as vantagens obtidas?
7 – Em que tipo de cromatografia a mistura de solventes deve ser realizada

para líquidos miscíveis?
169
8 – Qual a importância do sistema de bombeamento de cromatografia líquida
de alta eficiência?
9 – Na cromatografia líquida de alta eficiência as fases estacionárias são

compostas por que tipo de material?
10 – Em que se baseiam os detectores eletroquímicos?
11 – Descreva a importância de um termonebulizador.
12 – Quais as aplicações da cromatografia de partição?
13 – Em que método as separações são baseadas nas diferenças das

relações carga/ tamanho dos analitos da amostra?
14 – Que métodos são utilizados em controle de qualidade?
15 – Quais os sistemas que compõem os métodos de análises

automatizadas?
16- Dê exemplos de atividades que podem ser realizadas por robôs em um

laboratório.
170
4.7 - Anexo A – Soluções e Tampões
Tampão A (tópico 4.4.1), é necessário calcular a quantidade para pesar os

componentes do tampão. Como da sacarose que tem peso molecular de 342,3g.
Sacarose (conta=regra de três)
1M 342,3g 1.000 mL
0,32M x 1.000 mL
x = 109,54g 1.000 mL
Mg Cl2 (conta=regra de três)
1M 203,3g 1.000 mL
0,005M x 1.000 mL
x = 1,0165g 1.000 mL
Tris (conta=regra de três)
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
Desferroxamina (conta=regra de três)
1M 656,8g 1.000 mL
0,0001M x 1.000 mL
171
x = 0,06568g 1.000 mL
Triton X100 (conta=regra de três)
5g em 500 mL
Tampão B
Tris (conta=regra de três)
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
EDTA – Na2 (conta=regra de três)
1M 372,2g 1.000 mL
0,005M x 1.000 mL
x = 1,861g 1.000 mL
Desferroxamina (conta=regra de três)
1M 656,8g 1.000 mL
0,00015M x 1.000 mL
x = 0,09852g 1.000 mL
RNAse (livre de DNAse) – 10 mg/mL = 0,01g
172
RNAse em 1 mL de tampão acetato de sódio 10 mM em pH 5,2. Aquecer a
100 °C durante 15 minutos.
Tampão acetato 1M (diluição)
1M . vi = 10.10-3M . 100 mL
vi= 1mL + 99 mL de H20
Para fazer a solução de NaI:
Solução de NaI (7,6M) (conta=regra de três)
1M 149,89g 1.000 mL
7,6 M x 1.000 mL
x = 1139,164g 1.000 mL
40 mM Tris (conta=regra de três)
1M 121,1g 1.000 mL
0,04 M x 1.000 mL
x = 4,844g 1.000 mL
EDTA – Na2 20 mM (conta=regra de três)
1M 372,2g 1.000 mL
0,02M x 1.000 mL
x = 7,444g 1.000 mL
173
Desferroxamina 0,3 mM (conta=regra de três)
1M 656,8g 1.000 mL
0,0003M x 1.000 mL
x = 0,197g 1.000 mL
Tampão C, usado para diluição de RNAse T1 com 10 mM de Tris-HCl; 1 mM

EDTA; 2,5 mM Desferroxamina em pH 7,4.
Tris 10mM (conta=regra de três)
1M 1211g 1.000 mL
0,010M x 1.000 mL
x = 1,211g 1.000 mL
EDTA – Na2 1mM (conta=regra de três)
1M 372,2g 1.000 mL
0,001M x 1.000 mL
x = 0,372g 1.000 mL
Desferroxamina 2,5 mM (conta=regra de três)
1M 656,8g 1.000 mL
0,0025M x 1.000 mL
x = 1,642g 1.000 mL
Este tampão é para fazer a diluição de 100 μL de RNAse T1.
-------------FIM DO MÓDULO IV-----------
174
4.8 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BONATO, P.S. Cromatografia Gasosa in: Collins, C.H.; Bonato, P.S; Braga, G.L.
“Introdução a Métodos Cromatográficos”. 6ª edição, Editora Unicamp, Campinas,
1995.
BORGES, D.L.G., CURTIUS, A.J., WELZ, B., HEITMANN, U. Fundamentos da

espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua
Revista Analytica, nº18, Agosto/Setembro 2005.
BORGES, J. M. P. Investigação da citotoxicidade e genotoxicidade dos

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos indeno [1,2,3-cd] pireno, trifenileno e
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Toxicológicas Dissertação, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade
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BRADFORD, M. M. “A rapid and sensitive method for the quantitation of

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BRASIL, Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Guia para Validação de

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CASSARETT & DOULL, Toxicology – The basic Science of Poisons, 6a. edição,
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HERMIDA, S. A. S., Possari, E.P.M., Souza, D.B., Campos, I P A, Gomes, O F, Di

Mascio, P, Medeiros, M H G, Loureiro, A.P.M. 2’-Deoxyguanosine, 2’-deoxycytidine
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DNA bases. Chemical Research in Toxicology, v.19, 927 - 936, 2006.
HERMIDA, S. A. S., Possari, E.P.M., Souza, D.B., Campos, I P A, Gomes, O F, Di

Mascio, P, Medeiros, M H G, Loureiro, A.P.M. 2’-Deoxyguanosine, 2’-deoxycytidine
175
and 2’-deoxyadenosine adducts resulting from the reaction of tetrahydrofuran with
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HERMIDA, S.A.S. Adutos de 2’-Deoxiadenosina e 2’-Deoxicitidina induzidos por

Tetraidrofurano: caracterização estrutural e detecção em DNA. Dissertação de
Mestrado apresentada ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas –
Farmácia da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 2007.
IMBENOTTE, M.; AZAROUAL, M. N.; CARTIGNY, B.; VERMEERSCH, G.;

LHERMITTE M. Identification and quantitation of xenobiotics by 1H NMR
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MCNAIR, H.M.; MILLER, J.M. “Basic Gas Chromatography”. John Wiley & Sons,
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MENDHAM, J.; DENNEY, R. C.; THOMAS, M. Análise Química Quantitativa. 6°

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OGA, S. (Ed.) - Fundamentos de Toxicologia. Atheneu: São Paulo, 2a. edição,

2003.
ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS, PROGRAMA INTERNACIONAL DE

SEGURANÇA QUÍMICA, Segurança Química, Fundamentos de Toxicologia
Aplicada e Características dos Riscos Causados por Agentes Químicos, 1994.
Pimenta, A.M.C. Os desafios do Proteoma, Ciência Hoje, vol. 32, nº 192, 2003.
RIBEIRO, L.R., SALVADORI, D.M.F., MARQUES, E.K. Mutagênese Ambiental. Ed.

Ulbra, Canoas, 2003.
176
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental.
5ª. edição, Ed. Artmed, Porto Alegre – RS, 2002.
STERNER, J. H., AND HODGE, H. C. (1949). Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 10, 93–96.
TAVARES, M. F. M, "Mecanismos de Separação em Eletroforese Capilar",

Química Nova, 20: 493-511, 1997.
TOLSTOY, V.P., CHERNYSHOVA, I. V., SKRYSHEVSKY, V. A. “Handbook of

infrared spectroscopy of ultrathin films”, by John Wiley & Sons, Inc., 2003.
WHO, Principles and Methods for Evaluating the Toxicity of Chemicals, 1978.
-----------FIM DO CURSO!-----------
177

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4 - MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICOS

A cromatografia é um método físico-químico de separação que esta inserida

Há diversas combinações entre as fases móveis e estacionárias, o que torna

Dentre suas aplicações a cromatografia pode ser utilizada na identificação

• Classificação por forma física da cromatografia, que pode ser dividida

Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida e os métodos utilizados

Quadro 12 – Classificação de métodos cromatográficos

Tipo de Cromatografia Fase Fase Processo de

Cromatografia de papel L L Partilha

Cromatografia gás-líquido G L Partilha

Cromatografia Líquida (CL - L L Partilha

Cromatografia de adsorção L S Adsorção

Cromatografia em camada L S Adsorção

Cromatografia de permuta L S Reação química

Cromatografia de permeação L S Crivagem molecular

L = líquido G = gás S= sólido

Em cromatografia gasosa a fase móvel é gás e os métodos usados podem

Na cromatografia com fluido supercrítico a fase móvel é um fluido

Para que ocorra eluição cromatográfica em colunas, o eluente é adicionado

O isolamento das espécies separadas ocorre passando-se uma quantidade

O gráfico gerado a partir da detecção do soluto, com uma série de picos é

A velocidade relativa onde duas espécies eluem demonstram a eficiência da

Portanto, a eficiência da coluna cromatográfica aumenta enquanto o número

Então, a eficiência da separação cromatográfica vai depender das

Quadros 13 – Variáveis que afetam a eficiência de uma coluna

Coeficiente de difusão (fase móvel) * DM (cm2.s-1)

Coeficiente de difusão (fase estacionária) * DE (cm2.s-1)

Diâmetro da partícula (fase estacionária) dP (cm)

Espessura da camada de líquido que recobre a fase dF (cm)

Fator de retenção k’ (adimensional)

Velocidade linear (fase móvel) μ (cm.s-1)

* com o aumento da temperatura e com a diminuição da viscosidade estas variáveis podem

Dentre as variáveis que afetam a eficiência da coluna, algumas são

= A + B/u + (CE + CM)u (4.2)

Onde H é a altura dos pratos em centímetros, u é a velocidade linear da fase

CEu = fE (k’)d2f u (4.3)

Para aumentar a resolução de uma coluna cromatográfica pode-se

Quadro 14 – Símbolos das relações e grandezas utilizados na cromatografia

Símbolo da grandeza Denominação

CM, CE Concentração do analito nas fases móvel e estacionária

(tR)A, (tR)B Tempos de retenção, espécies A e B

(t’R)A Tempo de retenção ajustado, espécie A

tM Tempo de migração, espécies não retidas

VE Volume da fase estacionária

WA, WB Larguras de pico (A e B)

A cromatografia é usada para obtenção de dados qualitativos e quantitativos,

Para confirmação de identidade é requerida a análise espectroscópica ou

Na cromatografia planar a área coberta pela espécie separada é usado

Portanto, para obtenção de uma maior precisão em cromatografia

4.1 - Cromatografia Gasosa

Na cromatografia gasosa (CG) que foi inicialmente chamada de

Por ser relativamente simples, ser sensível e efetivo para separar os

A cromatografia gasosa também é utilizada para monitorar diversos

Há dois tipos de cromatografia gasosa: cromatografia Gás - Sólido (CGS) e

Planar Coluna Preparativa: 5- 30mm

(HPTLC) (TLC) (GC) (SFC) HPLC - Fase normal HPLC

Figura 22 – Tipos mais usuais de cromatografia.

Onde: CCD = Cromatografia de cada delgada (HPTLC= Cromatografia de

Diversas análises de rotina são realizadas em um curto espaço de tempo

Este método consiste primeiramente na introdução da amostra em uma

As substâncias que têm a maior interação com a fase estacionária são

4.1.1 – Gás de Arraste

A escolha do gás de arraste depende do tipo de detector que é utilizado e