PRIMER INFORME DE LABORATORIO

BIOLOGIA MOLECULAR

PROTOCOL: PURIFICATION OF TOTAL DNA FROM ANIMAL BLOOD OR CELLS (SPIN-

COLUMN PROTOCOL)

Presentado por:

Paula Andrea Castrillon Rodriguez

Lina Maria Paez

Natalia Parra Gomez

José Santiago Quiroga Trujillo

Dirigido a:

Wilson Rodrigo Cruz Flor

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES: FÍSICA, QUÍMICA Y BIOLOGÍA

FACULTAD DE EDUCACION

NEIVA- HUILA

2018
 CONTENIDO
INTRODUCCION ........................................................................................................................ 3
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 4
Objetivo General ................................................................................................................... 4
Objetivos Específico ........................................................................................................... 4
MATERIALES ......................................................................................................................... 5
PROCEDIMIENTO ................................................................................................................. 6
RESULTADOS Y ANÁLISIS .................................................................................................... 7
CONCLUSIONES..................................................................................................................... 11
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 12
 INTRODUCCION

En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y

especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores
moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan información sobre
la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004).
La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención
exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN
íntegro y puro. (Hudson 2008).

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa

en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de
nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces
fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. (Sunnucks 2000).
Por tanto, en el presente informe de laboratorio se presentaran los resultados obtenidos y el
respectivo análisis de la extracción de ADN de sangre de eritrocitos nucleada de pescado,
mediante el Protocolo: “purificación de ADN total de sangre o células animales (protocolo de
columna de centrifugación)” con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN
adecuados y así, analizar la técnica empleada.
 OBJETIVOS

Objetivo General
 Analizar la técnica de purificación de DNA total de sangre de Pescado y Humana por el
protocolo de columna de giro.

Objetivos Específico
 Conocer el protocolo de purificación de DNA para sangre de animales con eritrocitos
nucleados (Pescado) y no nucleados (Humana).
 Cuantificar la cantidad de DNA de 1μL por NanoDrop.
 METODOLOGIA

MATERIALES

Para la realización de la práctica de extracción de ADN, se utilizaron los siguientes materiales:

 Sangre de Tilapia
 Sangre Humana
 Columnas spin
 Micropipetas
 Buffers AL Lysis
 Buffer AW
 Buffer AW 1
 Buffer AW2
 Buffer AE (Base)
 Buffer PBS fosfato salino)
 Etanol al 96%
 Microcentrofuga
 Termobloque
 Vortex Mixer
 Nanodrop 2000
PROCEDIMIENTO
Se siguieron los pasos del Protocolo: Purificación de ADN total de sangre o células animales
(protocolo de columna de centrifugación), y como se utilizaron dos tipos de sangre: pescado
(nucleada) y humana (no nucleada); En nuestro caso solo se utilizó la sangre de pescado
para hacer la extracción del ADN, por tanto se siguió los siguientes pasos:
1) Se agregó 20 µL de proteinasa k, seguidamente se agregó 30 µL de la sangre de
pescado, luego se hizo un ajuste a un volumen de 220 µL de PBS y se agregó 20
µL del buffer AL. Para la Quelación (Sal, detergente, Trys, Cloruro de Sodio, sin
etanol añadido)

2) Se mezcla bien la muestra con el vortex Mixer, luego se lleva a una temperatura de
56 ° C en el termobloque por 10 minutos. El termobloque sirve para degradar lípidos,
se incuba y se rompe el núcleo y la membrana y se junta a reaccionar con otros
reactivos y formar un color oscuro en la sangre.

3) Se agrega 200 µL de etanol a la muestra, y se mezcla bien con el vortex Mixer.

4) Se pipetea la mezcla del paso anterior en una columna spin y se le adiciona 2 ml

de la muestra, luego se centrifuga a ≥ 6.000 x g (8000 rpm) durante 1 min y Se
desecha el flujo continuo y el tubo de recolección.

5) Se coloca la columna spin en un nuevo tubo de recolección de 500 ml, se agrega

500 µL Buffer AW1 y se centrifuga durante 1 minuto a ≥ 6000 x g (8000 rpm). Se
desecha el flujo continuo y el tubo de recolección.

6) Se coloca la columna spin en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, se agrega 500

µL Buffer AW2 y se centrifuga durante 3 min a ≥ 20,000 x g (14,000 rpm) para secar
la membrana. Se desecha el flujo continuo y el tubo de recolección.

7) Se coloca la columna spin en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml o 2 ml se

desecha el flujo para que no altere las reacciones posteriores, se pipetea 200 µl del
buffer AE directamente sobre la membrana de la columna para incubarla a
temperatura ambiente durante 1 minuto y se centrifuga durante 1 min a ≥ 6000 x g
(8,000 rpm) para eluir.

8) Se coloca la muestra en el NANODROP 2000 para mirar cuanto DNA y cuantos µL

hay en la muestra.
 RESULTADOS Y ANÁLISIS

Los kit DNeasy Blood & Tissue están diseñados para la rápida purificación total del ADN
(genéticas, mitocondriales, y patógenos), a partir de una gran variedad de fuentes de muestras de
tejido animal, celular, sangre o bacteria, sea fresca o congelada. Es por ello que se aplicó el kit, para
la extracción y purificación de ADN en tilapia, sangre nucleada (pescado). Posterior a la extracción,
se hizo la prueba de PCR (amplificación de un fragmento de ADN) para conocer los niveles de
calidad y pureza del ADN, en donde se obtuvo los siguientes resultados:

Figura N.1-Longuitud de onda del ADN pescado por NanoDrop

Figura N.2- Datos de pureza de ADN por NanoDrop.

 En los datos obtenido de la PCR, se observa unos niveles bajos en la A260 y A280, los
cuales son indicativos de que hubo una contaminación, puesto que los niveles de ADN obtenidos
son bajos; por tanto se asume que la muestra tomado pudo estar contaminada, o que se contaminó
durante el proceso, o que tal vez tenga proteínas o solventes orgánicos que lo contaminaron, y que
a razón ser, se debió a que su nivel de pureza haya sido baja.

Existe una gran variedad de condiciones y aspectos que influyen en la contaminación y bajo
rendimiento de la muestra de ADN (degradación). Partiendo no más por el tiempo y la condición en
la que se encontraba la muestra, fuese fresca, congelada o fijada, aspecto que es importante porque
da un indicativo de la viabilidad, pureza y calidad de la misma; debido a que al trabajar con una ya
fijada o previamente congelada, se estaría trabajando con una muestra degradada y que
posiblemente ya estuviera contaminada; como ejemplo se puede tomar la muestra de sangre de la
compañera Astrid, que se encontraba fresca y que tenía no más de 1 semana de haber sido extraída
y que por sus resultados, los cuales fueron óptimos por encontrarse en los rangos pertinentes, cabe
aclarar que esa muestra era sangre no nucleada, en comparación con la del pescado que era
nucleada. (Figura N.3)

Figura N.3- Resultados de la muestra de sangre no nucleada (Sangre de Astrid)

La contaminación o bajo rendimiento de pureza también pudo darse por factores

microbiológicas como la humedad, los cambios de temperatura, de forma química por productos o
sustancias que dificultan los procesos del análisis genético durante la extracción o por transferencia
de indicios biológicos debido al traslado de la muestra dando lugar a su contaminación.(Karina, 2010)
 Según Agues “a veces pipetear los reagentes es más difícil de lo que se piensa; en biología
molecular no se puede poner un poquito más o un poquito menos, debe de ser la cantidad exacta
puesto que a veces poner un poquito más tiene influencia en el resultado final o quizás el rendimiento
fue bajo porque no pusieron cantidad suficiente de proteinasa K” [Tha18 \l 9226]

Para el control de calidad del ADN se debe tener en cuenta el valor de la absorbancia
obtenida en el espectrofotómetro y así poder evaluar la pureza del ADN, “Se realizó la medida de la
Absorbancia a dos longitudes de onda: UV 260 nm. y 280 nm.; debido a que las bases purinas y
piridiminas absorben a 260 nm., y las proteínas a 280 nm.

La concentración de DNA se calculó de la siguiente manera: Abs. 260 nm. x factor de dilución
x 50 mg/ml. = mg/ml. DNA

Haciendo el cociente entre la Absorbancia a 260 nm. y, la Absorbancia a 280 nm., se obtiene
un valor que refleja el estado de pureza del DNA. Si este valor se encuentra entre 1.8 – 2.0, el DNA
obtenido se encuentra libre de contaminantes celulares. Valores por debajo de 1.8, indican
contaminación con proteínas, fracciones de membranas o fenol.”[Bru00 \l 9226]

Con respecto a lo anterior, se evidencia con la figura N. 2 que para la longitud de onda de
la muestra de tilapia de pescado dio 1,65 lo que indica que están por debajo de los valores promedio
por tanto hay contaminación en la muestra.

Debido a que la muestra tuvo un rendimiento bajo, se proponer que se pudo haber
implementado un reactivo que permitiese mantener la calidad de la muestra como ocurre en la
extracción del ADN en tejido vegetal donde utilizan el NaCl en altas concentraciones (5 M) para
prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo
inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción; la
base para la separación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en
presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas
centrifugas.
 En el laboratorio se trabajó con sangre de eritrocitos nucleados y no nucleados, muestras
que en el momento de realizar la extracción de ADN, se tuvo que trabajar bajo concentraciones
diferentes, puesto que la sangre de Eritrocitos nucleados (pescado) posee una mayor cantidad de
glóbulos rojos debido a que en el medio en el que se encuentran es rico en oxígeno, en comparación
con la sangre de eritrocitos no nucleados ( sangre humana), que se en cuenta en un medio donde
aparte de obtener oxígeno, obtiene otro tipo de elementos y sustancias que influyen en los niveles y
la producción de glóbulos rojos. Además, la sangre humana posee una cantidad de sustancias que
conforman los glóbulos rojos, cuya función principal es transportar hemoglobina, por consiguiente se
puede deducir que la cantidad de ADN es poca y debido a forma su biconvexa, que no la posee la
sangre no nucleada, puede transportar una mayor concentración de ADN y es por ello que su carga
genética es mucho mayor a la anterior; es por ello que cuando se añadió sangre de pescado en el
tubo de microcentrifuga, se usó apenas 30μl, en comparación de la sangre humana, donde se tuvo
que usar 150μl para poder tener una buena extracción de ADN, no es cuestión de pureza sino de
cantidad. Es decir, que la sangre con eritrocitos nucleados posee mayor cantidad de ADN que los
eritrocitos no nucleados.

Para finalizar, el kit DNeasy Blood & Tissue no es el único que se puede usar para la
extracción y purificación de ADN, en el comercio existen otros tipos de kits como lo es el método
Salting out, donde utilizan un buffer que contiene Proteinasa K, la cual destruye las membranas
nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos para luego proceder a la precipitación de los
mismos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio
(AcONa) puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones. También se
encuentra el kit Extracción de DNA de sangre periférica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB),
el cual posee una similitud al kit anterior, solo que en este proceso se utiliza una homogeinizacion
(CTAB, NaCl, β-mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5) que funcionan como jabones invertidos,
donde hay un ion positivo y no negativo. Luego se realiza la precipitación los ácidos nucleicos con
cloroformo para después proceder a la precipitación del ADN con etanol; Sin embargo, el uso de
estos kits podría generar un daño un tanto negativo puesto que trabaja con soluciones que atentarían
contra la pureza del ADN, como sucedería si se usa el Cloroformo, que incide en la degradación y
daño del material genético. (Brusés, Bettina L.-Lucero, Horacio-Aguirre, MaríaV.-Gorodner, Jorge O.,
2000)
 CONCLUSIONES

Al hacer uso del kit para la extracción de ADN, Se pudo determinar que la utilización de
este fue bastante sencilla, solo que hay que tener muy en cuenta la buena utilización del material y
el ajuste de volúmenes correcto, para obtener una extracción exitosa.

A través de esta práctica de laboratorio pudimos reconocer las acciones químicas que
permiten la liberación del DNA que se encuentra en el interior de los eritrocitos de la sangre animal
ya sea nucleados o no, su función liberadora por medio de degradación y polarización; permiten la
máxima extracción del ácido ribonucleico.
 BIBLIOGRAFIA

Brusés, Bettina L.-Lucero, Horacio-Aguirre, MaríaV.-Gorodner, Jorge O.- Comparacion tecnicas de

extraccion de ADN para la deteccion de Trypanosoma Cruzi mediante la tecnica de PCR.-
Universidad Nacional Nordeste., Comunicaciones y tecnologicas.-2000.
http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/cyt/2000/3_medicas/m_pdf/m_011.pdf
Dundass N., N. K. Leos, M. Mitui, P. Revell y B. B. Rogers. 2008. Comparison of automated nucleic
acid extraction methods with manual extraction. Journal of Molecular Diagnostics 10: 311-
316.

Guinn G. 1966. Extraction of nucleic acids from lyophilized plant material. Plant Physiology 41: 689-
695.

https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/dneasy-blood-and-tissue-
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http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
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EE.UU

Karina.,2010.- https://www.slideshare.net/marcia_karina/extraccion-adn
Nasón A. 1965. Biología. Ed. Limusa, México.

Qiagen. 2005. BioSprint DNA Plant Handbook. www.qiagen.com/hb/biosprintplantdnakit. Consultado

en agosto de 2010.

Sambrook J., E. F. Fritsch y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU.

Schlötterer, C. 2004. The evolution of molecular markers –just a matter of fashion? Nature Reviews
5: 63-69. Tomado de la página web:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
Sinden R. R. 1994. DNA Structure and Function. Academic Press, EE.UU.

Sunnucks, P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. Trends in Ecology and Evolution
15:199-201. Tomado de la página web:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf