INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

LABORATORIO DE SISTEMAS DE
CONTROL DE CALIDAD

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

PRÁCTICA 3

“VERIFICACIÓN DE LA CALIBRACIÓN
SENSIBILIDAD Y LINEALIDAD DE LOS
ESPECTROFOTOMÉTROS EMPLEADOS EN EL
LABORATORIO CLÍNICO”

PROFESORES:
COLIN TOVAR MARIA DEL CARMEN MERCEDES
HERNÁNDEZ OLICÓN AURA PATRICIA
LANDIN CAUDILLO DAVID ALEJANDRO
MARTINEZ REYES CINTHYA SALIMAH

ALUMNO:

GRUPO 5QV1
SECCIÓN 04

FECHA DE ENTREGA: DE SEPTIEMBRE DE 2017

INTRODUCCIÓN

La linealidad nos habla de la respuesta del sistema de detección, y por ende el rango
de utilidad de medida del instrumento. Para este control se debe trabajar por ejemplo
con algún colorante en solución, que se sabe que cumple con la Ley de Lambert-Beer,
es decir que presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración en el
rango de trabajo utilizado.
Para realizarlo, se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones
crecientes del colorante utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de
referencia certificadas. Si el equipo cumple con el control, el gráfico de absorbancia
experimental en función de absorbancia de referencia será lineal hasta el último valor
de absorbancia experimental y éste último valor será “el máximo valor de absorbancia
aceptable” para cualquier otra medida. En el caso de que el equipo no presente
linealidad en todo el rango, se deberá informar hasta que valor de absorbancia
experimental hay linealidad. Para realizar este control, cuando no se dispone de los
valores de referencia de absorbancias pero se conocen las concentraciones de las
soluciones a medir, se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de
concentración a partir del cual también se podrá evaluar la linealidad fotométrica. A
través de éste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia,
obtenida con una solución estándar de referencia certificada medida en un equipo
calibrado, y la absorbancia de la misma solución medida en el equipo que se está
controlando. Por lo tanto el control permite analizar la veracidad de los resultados
obtenidos en el equipo.

OBJETIVOS

 Verificar la calibración, sensibilidad y linealidad de los espectrofotómetros,

utilizando una solución de cloruro de cobalto y dicromato de potasio.
 Interpretar los resultados de acuerdo a ley de Lamber-Beer.

FUNDAMENTO

Se basa en la ley de Lambert, la cual establece que la disminución del poder radiante
de un haz de luz monocromática que pasa a través de un medio absorbente, es
proporcional al poder radiante del haz, y la ley de Beer que establece que la energía
radiante de un haz de luz monocromática disminuye en proporción directa con el
incremento de la concentración de la sustancia absorbente (Ley de Lambert y Beer).
 MÉTODO

INICIO

¿Se verificara la
calibración y la SI
Obtener una celda
sensibilidad?
de lectura

NO
Adicionar agua destilada y
ajustar el aparato a cero
verificación de la
Preparar 11 tubos de
linealidad
ensaye para realizar
diluciones Colocar una solución
de cloruro de cobalto y
registrar la
absorbancia
Realizar las diluciones
Interpretación de
según el manual
resultados y
realización de
graficas Ajustar nuevamente a cero
de absorbancia con agua
Leer cada dilución a una destilada a 460 nm
longitud de onda de 510 nm

FIN Tomar lectura de la solución

Construcción de curva tipo
de cloruro de cobalto

Realización de cálculos
Repetir el paso anterior
leyendo de 460 – 550 nm
en intervalos de 10 nm
 RESULTADOS
BITÁCORA DE RESULTADOS Fecha: 19/09/2018

Tabla 1. Verificación de la calibración y sensibilidad.

Longitud
Espectrofotómetro: SP-V1000
de onda A
Marca: D-LAB
(nm)
Codificación de usuario: D-LAB 2
450 0.260 Unidades: nm
460 0.342 Tipo de celda utilizada: Volumen semireducido
470 Solución utilizada: Cloruro de cobalto al 2.2% en HCl al 1%
0.392 Ajuste del instrumento con: HCl al 1%
480 0.436 Intervalo de longitud de onda: 450-550
490 0.479 λ mínima seleccionada: 450 nm
500 λ máxima seleccionada: 510 nm
0.535
510 0.568
520 0.554
530 0.488
540 0.385
550 0.280

Solución Utilizada: Dicromato de Potasio 530mg/dL Longitud de onda: 510 nm

Ajuste del espectrofotómetro: Ajuste con agua destilada

Tabla 2. Verificación de la linealidad

Conc. Teórica Conc. Calculada
Absorbancia % Error
mg/dL mg/dL
26.5 0.120 34.80 31.22
53 0.210 60.90 14.91
106 0.365 105.85 -0.14
159 0.574 166.46 4.69
212 0.759 220.11 3.83
265 0.936 271.44 2.43
318 1.067 309.43 -2.69
371 1.230 356.70 -3.85
424 1.466 425.14 0.2688
477 1.617 468.93 -1.69
530 1.859 539.11 1.71
Solución con la que se hicieron las diluciones: Agua destilada
Factor de calibración Utilizado: 290

Fórmula para calcular las concentraciones de las diluciones:

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐ó𝑛 𝑇𝑒𝑜𝑟.
𝐹= = 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜 3
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 ( ) = 𝐹 ∗ 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐼𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙
𝑑𝐿
Cálculos realizados:
106
𝐹= = 290
0.365
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝐶𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 = (290)(0.120) = 34.80
𝑑𝐿
𝐯𝐚𝐥𝐨𝐫 𝐨𝐛𝐬𝐞𝐫𝐯𝐚𝐝𝐨 − 𝐯𝐚𝐥𝐨𝐫 𝐫𝐞𝐚𝐥
%𝑬 = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒓𝒆𝒂𝒍
𝟓𝟑𝟗. 𝟏𝟏 − 𝟓𝟑𝟎
%𝒆 = 𝑿𝟏𝟎𝟎 = 𝟏. 𝟕𝟏%
𝟓𝟑𝟎

Figura 1. Sensibilidad y calibración de un espectrofotómetro utilizando una solución de cloruro

de cobalto al 2.2% en HCl al 1%.
Bitácora Fecha:
Figura 2. Concentraciones teóricas vs absorbancia para verificar la linealidad del
espectro.

Figura 3. Linealidad ajustada por medio de las concentraciones calculadas.

Figura 4. Errores individuales calculados para cada concentración calculada.

Figura 5. Linealidad ajustada por medio de las concentraciones calculadas

Tabla 3. Resultados de la determinación de calibración, sensibilidad y linealidad de
distintos espectrofotometros utilizando una solución de cloruro de cobalto al 2.2% en HCl
al 1%.

Equipo Número Marca Λ Si/No A máx ¿Sensible? r rcorregida Intervalo

de máx ¿Calibrado? lineal
espectro
1 Biomedica 510 Si 0.543 No 0.9956 0.9997 ---
1 Único 510 Si 0.508 Si 0.9859 0.9999 ---
(1.6%)
10 Spectronic 510 Si 0.559 No 0.9994 1.00 ---
11 Spectronic 510 Si 0.566 No 0.9984 1.0000 ---
2 Biomedica 510 Si 0.538 No 0.9992 0.9999 0.185-
1.413
2 Único 510 Si 0.540 No 0.9968 1.0000 ---
D-LAB 2 D-LAB 510 Si 0.568 No 0.9990 1.0000 0.574 -
(13.6%) 0.936
2 D-LAB 510 Si 0.473 No 0.9994 1.0000 1.251-
1.428

DISCUSIÓN

Para determinar si el espectrofotómetro se encuentra calibrado, se realizó un espectro

de absorción de (450-550) con cloruro de cobalto (CoCl2), la absorbancia máxima fue
de 0.568 a 510 nm (figura 1). Con base a los valores de referencia del cloruro de
cobalto nos dice que este tiene una absorbancia de 0.5 a 510 nm. Dado que la longitud
de onda donde se encontró el máximo es la misma que en el valor de referencia nos
indica que el espectrofotómetro esta calibrado. Sin embargo la absorbancia obtenida de
la solución supera el intervalo de 5% permitido con un valor de 13.6%, por lo que no se
considera sensible. Esto puede deberse a un desgaste en la fuente de luz, errores en la
preparación de la solución, interferencia por polvo en el detector incluso poder hablar de
luz parasita que atraviesa hasta el detector haciendo que exista una señal de menor
transmitancia en el detector y por ende arrojar una mayor lectura en cuanto a
absorbancia.
En la figura 2 y 3 se observa que se cumple la ley de Beer la cual nos dice que existe
una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la
concentración de la sustancia. La concentración de a sustancia puede ser deducida a
partir de la cantidad de luz transmitida. Para determinar la linealidad se realizaron una
serie de diluciones con el fin de generar una curva tipo donde se tiene un coeficiente de
correlación de (r= 0.9990) (figura 2), aunque este resultado no habla mucho de la
dispersión de los puntos, se realizó una segunda curva tipo ajustando la concentración
real, en donde se corrigió dicha dispersión, y se obtuvo un coeficiente de correlación
(r=1.0000) (Figura 3).

Para confirmar este punto se realizó un gráfico de comparación entre la concentración

calculada y la concentración teórica (Figura 5), en donde teóricamente se esperaba una
pendiente de 1, obteniendo un resultado de pendiente de 0.9798. Sin embargo en la
figura 4 no se encontró un intervalo lineal de más de cinco puntos para construir el
grafico de verificación lineal, por lo anterior este grafico se obtuvo con todos los puntos,
presentaran o no linealidad en el gráfico de porciento de error.

En cuanto a los resultados obtenidos por ambas secciones, se aprecia que todos los
equipos espectrofotométricos se encuentran calibrados al tener como longitud máxima
de absorción de una solución de cloruro de cobalto al 2.2% en HCl al 1%, la cual
corresponde a 510 nm siendo la misma de onda que se esperaba obtener de manera
teórica. Mientras que los resultados en la sensibilidad de los espectrofotómetros indican
que solo 1 instrumento es sensible debido a que su %Error tiene un valor 1.6% el cual
es menor al valor del error permitido que corresponde a 5%. Finalmente todos los
espectrofotómetros utilizados a excepción de Biomedica 1 presentan linealidad debido a
que su coeficiente de correlación (rcorregida) es mayor o igual al valor permitido de
0.9998

CONCLUSIÓN
 Se verificó que el espectrofotómetro D-LAB SP-V1000 está calibrado.
 Se encontró un intervalo lineal, en la gráfica de % de error el cual corresponde a
0.574 - 0.936 de absorbancia.
 El espectro no cuenta con la sensibilidad apropiada.
 Si se cumple la ley de Beer.

REFERENCIAS
 Copyright Equipos y Laboratorio de Colombia S.A.S., ¨MANTENIMIENTO Y
CALIBRACION DE ESPECTROFOTOMETROS¨, (2015), Disponible en:
http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=2514 consulta (09/2018)
 Alva-Estrada S.I., Benito-Mercadé C., et. Al., Programa de evaluación de la calidad de
laboratorios. I. Diagnóstico del funcionamiento de espectrofotómetros. 1991:17-19.