Las células cultivadas han sido la fuente más popular de proteína para estudios proteómicos.

Ellos

se utilizan principalmente porque pueden proporcionar una gran cantidad de información que a
menudo es difícil

para obtener de tejidos y cultivos primarios. Además, los cultivos celulares son fácilmente

accesibles en grandes colecciones de células curadas, como la American Type Culture

Colección (www.atcc.org).

Otra ventaja significativa del cultivo celular sobre el material tisular es la controlabilidad

del medio ambiente y las condiciones de crecimiento, así como la posibilidad de utilizar
diferentes

estimulaciones. Además, los cultivos se obtienen generalmente de colonias individuales y

son homogéneos, lo que reduce en gran medida la complejidad del proteoma. Por otra parte, el

el crecimiento de la cultura y las condiciones de lisis también son controlables, lo que

minimizar las fluctuaciones y artefactos de lote a lote en el proteoma. Hasta la fecha, cultivos
celulares

proporcionar el entorno más controlable para realizar experimentos proteómicos.

Ácido desoxirribonucleico a ácido ribonucleico

Se puso a disposición una serie de herramientas para el análisis rápido y cuantitativo de la

expresión

niveles en ácido ribonucleico (ARN). Por ejemplo, la aparición de la matriz de ADN / ARN

La tecnología y el análisis en serie de la expresión génica (SAGE) han facilitado la adquisición

de perfiles de expresión cuantitativa para conjuntos completos o subconjuntos de ARN (Desprez

et al., 1998; Marshall y Hodgson, 1998; Ruan y otros, 1998; Servicio, 1998; Velculescu

et al., 1995; Madden y otros, 1997; Matsumura y otros, 1999, Neilson et al., 2000; Lal

et al., 1999; Stein et al., 2004; Weeraratna et al., 2004). Diferentes perfiles de expresión de ARN
se puede adquirir usando estas técnicas, y los genes que están "arriba" - o "abajo" -

regulado cuando se comparan diferentes celdas o diferentes estados de celdas también se

puede detectar.

Ya, con un paso de la secuencia genómica, una gran cantidad de información

se extrae estudiando ARN.

Está claro que estas tecnologías de detección de ADN / ARN de alto rendimiento proporcionan
una

descripción rápida y cuantitativa de los genes que se expresan diferencialmente. Da vueltas

fuera, sin embargo, que la expresión de ARN por sí misma no es suficiente para la comprensión

procesos biológicos y funciones génicas. La evidencia ha sido recolectada de diferentes

grupos de investigación (Gygi et al., 1999b; Gygi y Aebersold, 1999; Anderson y

Seilhamer, 1997; Futcher et al., 1999) que indica que la expresión de ARN tiene una

mala relación lineal con los cambios que ocurren en el nivel de proteína (Fig. 1.3) mientras

otros experimentos indican una buena correlación para proteínas de mayor abundancia (Kern

et al., 2003). Esto se debe a los numerosos mecanismos de regulación vigentes durante

expresión de proteínas y postexpresión.

Además, un reciente estudio a gran escala del genoma de la levadura ha demostrado claramente

una relación pobre entre los resultados del chip de ADN y las expresiones de proteínas (Ross-

Macdonald et al., 1999). Este estudio, realizado mediante etiquetado de transposones y gen

interrupción, se encontraron 31 genes meióticos, que se detectaron a nivel de proteína por

"inframe"

fusión lacZ y ensayo para la actividad de b-galactosidasa (b-gal). Fuera de los 31 meotic

genes, solo 17 habían sido inducidos previamente por al menos dos veces durante

esporulación. Esto se logró mediante la detección basada en la micromatriz de ADN que

representa

todos los marcos de lectura abiertos anotados (ORF) en levadura.

Por el resto del

genes meóticos, el análisis de microarrays de ADN no pudo encontrar ninguna inducción

significativa

durante la meiosis Por lo tanto, no solo la relación entre el nivel de expresión de

El ARN y el nivel de expresión de las proteínas son una cuestión compleja, pero también es
engañoso confiar únicamente en los patrones de expresión del ARN para predecir las funciones
celulares. Claramente, el

cantidad de proteína relacionada con un gen puede cambiar drásticamente sin ningún cambio en

el nivel de expresión del ARN si esto se logra a través de la regulación aguas abajo

mecanismos

Ácido ribonucleico a la proteína

Aunque se han realizado esfuerzos serios para desarrollar tecnologías genómicas eficientes,

el estudio de las proteínas no se puede evitar en la búsqueda de comprender los procesos

biológicos.

La justificación para estudiar proteínas va incluso más allá de la falta de correlación

entre los niveles de expresión de ARN y proteínas. La presencia de postraduccional

modificación, truncamiento de proteínas postraduccional y ligando de proteína

las interacciones son algunos ejemplos que ilustran la complejidad a nivel de proteína.

El estudio de las proteínas siempre se ha hecho en una escala relativamente pequeña, en parte

debido a la falta de métodos para verificar inequívoca y fácilmente la identidad de la proteína.

Los experimentos deben llevarse a cabo con sumo cuidado para garantizar que solo la proteína

de interés fue aislado. Todo esto ha cambiado en los últimos 10 años con el desarrollo

de tecnología capaz de realizar análisis a gran escala e identificación de

proteínas (Issaq et al., 2002, Wang y Hanash, 2003). Este logro ha abierto el

puerta para estudios exhaustivos de proteínas relacionadas con un genoma (proteoma) (Wilkins
et al.

al., 1996a).
MANEJO DE PROTEOMAS EN CLASICA Y

PROTEÓMICA FUNCIONAL

La electroforesis en gel bidimensional (2D) se usa típicamente en perfiles proteómicos

estudios, y su implementación más popular es la visualización diferencial de proteínas

expresado en diferentes condiciones. Resulta que la conservación del proteoma para obtener

un patrón de gel 2D verdaderamente representativo no es trivial, y este es probablemente el

más importante

paso experimental en estudios proteómicos. Por ejemplo, se debe tener mucho cuidado

durante la extracción de células de su entorno y durante la lisis celular para reducir

la influencia del protocolo de extracción de muestra en el estado observado del proteoma.

Los errores a menudo se hacen mientras se manipula un proteoma, lo que afecta seriamente al

conclusiones de los experimentos. Por lo tanto, el historial de la muestra es un requisito previo

para evaluar la validez de una muestra.

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA

La extracción de proteína de un lisado celular es un paso crítico para establecer un establo

proteoma Es bien sabido que una vez que las células se lisan las enzimas que normalmente se
lisarían

ser compartimentado se ponen en contacto con otras proteínas y luego rápidamente

degradar el proteoma. Afortunadamente, existen conjuntos de métodos bien caracterizados

para cubrir la mayoría de las necesidades en la extracción de proteínas de las células. La cosecha
de

las proteínas solubles simplemente se realizan lisando las células y recolectando el

sobrenadante.

Diferentes métodos de lisis celular son fácilmente accesibles (ver www.expasy.ch). Es mejor

elija el enfoque más simple que sea directamente compatible con el pH inmovilizado
gradiente (IPG) isoeléctrico (es decir, contenido mínimo de sal y tensioactivo iónico).

Los protocolos actuales de extracción de proteínas no son universalmente aplicables a todos los
biológicos

muestras, y tienen limitaciones en términos de la representación de proteínas en el

Proteoma extraído. Primero, las proteínas hidrofóbicas no se extraen y representan fácilmente

en un patrón de gel 2D (Wilkins et al., 1998). La figura 1.4 muestra la cantidad de proteínas

visualizado en un gel 2D de Saccharomyces Cerevisiae versus la salsa hidrofobicidad

escala. Claramente, una porción significativa de las proteínas predichas en un proteoma es de

naturaleza hidrofóbica; sin embargo, la compilación de las proteínas que han sido identificadas
por 2D

la electroforesis en gel y la espectrometría de masas indican una falta grave de proteínas

hidrofóbicas.

Esto significa que la electroforesis en gel 2D no muestra la porción hidrofóbica

del proteoma En los últimos años, los esfuerzos significativos del grupo de Rabilloud (Adessi

et al., 1997; Blisnick et al., 1998; Chevallet et al., 1998; Goldberg y otros, 1996;

Rabillout, 1998; Rabillout et al., 1999; Santoni et al., 1999; Tastet y otros, 2003; Luche

et al., 2003) proporcionaron protocolos y productos químicos mejorados para la recuperación de

compuestos hidrofóbicos

proteínas. La extracción de proteínas hidrofóbicas, sin embargo, es todavía una considerable

desafío en proteómica. Se han publicado revisiones exhaustivas sobre la extracción

y solubilización de proteínas de muestras biológicas para electroforesis en gel 2D

(Dunn y Corbett, 1996; Rabillout, 1996, 2002; Ramagli, 1999)

Los protocolos actuales de extracción de proteínas a menudo no proporcionan un proteoma

único.

Esto es particularmente un problema cuando se trata de tejidos que se componen de muchos

diferentes células en diferentes etapas y cada una tiene su propio proteoma. Clásico

las técnicas de extracción de proteínas lisarían todo el tejido o la fracción de tejido que genera

un proteoma revuelto compuesto de todos los proteomas originales. Estudios proteómicos

recientes

han indicado claramente que la diversidad celular dentro de una muestra biológica, y la

la localización de proteínas dentro de las células tiene un gran impacto en la conclusión de un

estudio proteómico.

Se presentan los desafíos actuales relacionados con el nivel de complejidad de masa celular

abajo

Otra fuente de muestras

Los proteomas también se han analizado a partir de muestras más complejas, como la clínica

muestras, plantas y animales (Ostergaard et al., 1997; Wimmer et al., 1996; Lubec et al.

al., 2003; Aebersold y Mann, 2003). Las conclusiones, sin embargo, que se pueden alcanzar

de tales muestras a menudo se ven afectados por muchos parámetros que no son fácilmente
controlables.

Por lo general, es necesario estudiar un gran número de muestras para encontrar alguna
esperanza de encontrar

las proteínas relevantes. Muchos factores aumentan la complejidad del análisis

El primer factor es la metodología utilizada para extraer y almacenar las muestras clínicas. El
fracaso de

las muestras clínicas en proteómica a menudo se remontan al primer paso en el estudio, es decir,

la extracción y el almacenamiento de las muestras clínicas. El proteoma a menudo puede ser

serio

cambiado debido a un almacenamiento prolongado a temperatura ambiente. Aunque grandes

colecciones

de muestras clínicas se han establecido, a menudo tienen un valor limitado para proteómica

estudios porque no se almacenaron adecuadamente poco después de su extracción. Proteómica

los estudios a menudo requieren la revisión de la metodología para muestras clínicas y de otro
tipo.

Una vez que las metodologías apropiadas están en su lugar para limitar los efectos del
aislamiento de la muestra

en el proteoma, otros factores aún pueden dificultar el estudio. Las muestras de tejido son

de naturaleza heterogénea (es decir, compuesta por diferentes tipos de células, volúmenes y
proporción de células)

composiciones). Esto puede causar grandes variaciones en los contenidos de proteína dentro del
mismo

tejidos y tejidos de diferentes fuentes. En realidad, las muestras de tejido se componen de

muchos proteomas diferentes La lisis de estas muestras genera una mezcla mezclada

de proteomas. Por lo tanto, se deben realizar múltiples experimentos para extraer

las proteínas relevantes, o de lo contrario la lucha de proteomas sombreará la importante

proteínas, lo que hace imposible interpretar los resultados.

Hay ejemplos disponibles que demuestran la viabilidad de extraer información valiosa

de proteomas revueltos. En un estudio proteómico del cáncer de vejiga, Ostergaard

y colaboradores (Ostergaard et al., 1997; Wimmer et al., 1996; Celis et al., 1999) tienen

demostrado que los nuevos marcadores de enfermedad asociados con las diferentes etapas del
cáncer pueden

ser determinado. Procesaron cientos de cáncer de vejiga bien conservado. Al aplicar

un enfoque proteómico, encontraron un puñado de proteínas que eran diferencialmente

expresado durante las diferentes etapas de progresión de la enfermedad. Los anticuerpos fueron
levantados

contra estos marcadores proteicos (principalmente marcadores de queratinocitos) y luego se

usaron como

herramienta de diagnóstico para determinar las diferentes etapas del cáncer dentro de las
secciones de criostato de

biopsias de cistectomías vesicales Aunque el estudio fue exitoso, el identificado

los marcadores de enfermedad en realidad eran proteínas de alta abundancia y sus cambios en
la expresión

sería notable en proteomas codificados. En cualquier caso, hubiera sido

significativamente más difícil de identificar las proteínas de baja a media abundancia

involucradas en

la enfermedad.

Bidimensional