Investigación en el comportamiento de la fermentación de seis bacterias acido lácticas dentro

del mosto de la malta de cebada revela una limitación en los aminoácidos claves

RESUMEN

Se comprendió el comportamiento de la fermentación de bacterias acido lácticas (LAB) en la

malta, siendo un controlador en la mejora del sabor de las bebidas de malta fermentadas con
ácido láctico.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo delinear las deficiencias que puede existir en la
fermentación del mosto de malta. En primer lugar, sobre la base de seis cepas de LAB, la
viabilidad celular y la vitalidad eran evaluados.

En segundo lugar, azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, valor de pH y capacidad de

amortiguación (BC) fueron monitoreados. Finalmente, la implicación de aminoácidos claves,
fructosa y mosto con capacidad de amortiguación en el crecimiento de BAL fue determinado.
También la fase de crecimiento corto junto con muerte celular rápida y una disminución en la
actividad metabólica.

El bajo contenido de BC del mosto causa una rápida caída del pH con la acumulación de ácido
láctico, que a la inversa el aumento del BC conduce a un menor cambio de pH en la última etapa
de la fermentación. El contenido de ácido láctico (3.9 g / L) fue más alto que la concentración
inhibidora reportada (1.8 g / L). Además, los azúcares todavía estaban disponibles, pero la
fructosa y los aminoácidos claves; lisina, arginina y ácido glutámico; se agotaron
considerablemente (98%).

Las suplementaciones del mosto mejoraron el crecimiento celular, así como también su
viabilidad ayuda a evitar la reducción de aminoácidos claves junto con los bajos límites de BC,
influyendo en el crecimiento de las LAB en la hierba de la malta. Entonces, un aumento adicional
en el ácido orgánico reduce la viabilidad de las LAB. Este conocimiento abre las puertas para la
optimización del proceso de fermentación de las LAB en la malta.

1. Introducción:

A pesar de sus tremendos beneficios para la salud y las posibilidades de innovación tecnológica,
las bebidas a base de cereales fermentados con presencia de ácido láctico son escasos en el
mercado. La baja aceptación del consumidor y las limitaciones en el perfil de sabor son las
deficiencias presentadas (Nsogning Dongmo et al., 2016; Yu y Bogue, 2013). Ahora se sabe que
las limitaciones en el perfil de sabor de las bebidas a base de malta fermentadas con ácido láctico
(LAFMB) no se deben a la composición del aroma sino a una concentración insuficiente de
compuestos aromáticos importantes. La cepa de BAL de fermentación tiene un impacto
significativo en la concentración de compuestos de aroma clave, el sabor y la aceptación de las
bebidas resultantes (Nsogning Dongmo et al., 2017, Salmeron et al., 2015). Sin embargo, la
cuestión de lo que causa la formación insuficiente de compuestos aromáticos por LAB durante
la fermentación del mosto de la malta es fundamental para futuros intentos que apuntan a
mejorar el perfil de sabor de LAFMB.

El problema central que podría abordarse es un rendimiento de fermentación adecuado. Para

eso, las buenas condiciones fisiológicas de las células y la disponibilidad de nutrientes son
determinantes clave. La deficiencia de nutrientes o células poco viables y vitales podrían afectar
el rendimiento de la fermentación, lo que da lugar, indudablemente, a un crecimiento corto y
un bajo rendimiento de aroma. Los fundamentos sobre cómo es el rendimiento de fermentación
de LAB en la malta se mantuvo parcialmente dilucidado. Los estudios han descrito el
comportamiento de crecimiento de LAB, cambio en azúcares fermentables, nitrógeno amino
libre, y acumulación de ácido láctico y ácido acético en la fermentación de sustratos basados en
cereales. La fase de crecimiento de LAB en sustratos basados en cereales es generalmente muy
corta, de 6 a 48 h, dependiendo del tipo de sustrato, la temperatura de fermentación, la tasa de
inoculación y la cepa LAB (Charalampopoulos et al., 2002, 2003; Peyer et al., 2015; Salmeron et
al., 2014). Además, aún no existen estudios sobre la evaluación de las limitaciones que pueden
existir en la fermentación del ácido láctico del mosto de malta. Los LAB son estrictamente
fermentativos, pero requieren azúcares fermentables, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas y
purinas para su desarrollo. Como tales, son auxótrofos a varios aminoácidos e incapaces de
crecer en un medio simple que contiene fuentes de carbono y minerales (Hebert et al., 2000).
Cualquier falta de nutrientes podría, por lo tanto, ser un verdadero desafío para el crecimiento
de LAB.

Además, los cambios en el medio de composición, como la caída del pH, también como la
consecuencia de la acumulación de ácido orgánico en la fermentación del ácido láctico,
provocan estrés ácido que también puede afectar la viabilidad de las BAL y la actividad
metabólica. Se ha descrito el efecto tóxico del ácido láctico no disociado en las células de LAB
(Adamberg et al., 2003; Pieterse et al., 2005). Para superar el estrés ácido al que están sometidos
en su ambiente de fermentación, las células LAB liberan cuatro sustancias principales: el
glutamato descarboxilasa (GAD), la lisina descarboxilasa, la arginina deiminasa (ADI) y la F1Fo
ATPasa multisubunit (Azcarate-Peril y Klaenhammer, 2010). Sin embargo, ya sea para aumentar
el pH intracelular o para intensificar la extrusión de protones desde el citoplasma, todos
dependen de proteínas o aminoácidos. Además, se sabe que los aminoácidos están fuertemente
implicados en funciones enzimáticas y como precursores de compuestos aromáticos. La falta de
algunos aminoácidos podría, por lo tanto, dar como resultado una baja resistencia ácida, muerte
celular y una actividad metabólica alterada que conducen a una formación de aroma demasiado
bajo. Por lo tanto, la composición de nutrientes del mosto de malta es de gran importancia para
el rendimiento de fermentación de células de LAB y, por consiguiente, para el rendimiento de
compuestos aromáticos. El sustrato de malta de cebada es un medio nutriente complejamente
rico, que se describió para apoyar el crecimiento de LAB y la formación de compuestos
aromáticos (Charalampopoulos et al., 2003; Nsogning Dongmo et al., 2016; Peyer et al., 2015).
Pero aún no se ha determinado si el mosto de malta es un medio óptimo para cumplir con los
requisitos nutricionales de LAB para un crecimiento eficiente y duradero de estas últimas.

Para comprender las limitaciones que ocurren en la fermentación láctica del mosto de malta,
este estudio tiene como objetivo investigar la viabilidad, vitalidad y tasa de mortalidad de seis
cepas de BAL, cambios físicos y de medios de composición con respecto a nutrientes residuales,
ácidos orgánicos, capacidad de amortiguación y cambio de valor de pH en fermentación del
mosto de malta de cebada. Al final, se evaluó la implicación de los aminoácidos clave, la fructosa
y la capacidad de amortiguación del mosto en el crecimiento de las BAL. Este conocimiento se
orientará en la optimización de la composición del mosto de malta y el proceso de fermentación
para un mejor crecimiento de LAB y traerá nuevos métodos de comprensión sobre el bajo
rendimiento de aroma reportado de las bebidas a base de cereales fermentados con ácido
láctico también.
2. Materiales y Métodos:

2.1. Preparación del mosto, las cepas y la fermentación:

Se preparó una concentración de mosto al 14% a partir de un extracto de malta de cebada pilsen
bávara no desmenuzada al 72% de Weyermann (Bamberg, Alemania) utilizando agua destilada
y se sometió al autoclave a 110ºC durante 10 minutos. Los materiales menos resistentes a
cambios de temperatura se separaron después del enfriamiento. Seis cepas seleccionadas y
previamente identificadas de Lactobacillus plantarum Lp.758, Lp.765 y Lp.725, Lactobacillus
brevis Lb.986, y Lactobacillus amylolyticus La.TL3 y La.TL5 se obtuvieron de la colección de cepas
de Brewing and Beverage Technology (Universidad Técnica de Munich, Alemania). Los cultivos
se propagaron dos veces en caldo MRS (Sigma Aldrich, Alemania) durante 24 h a 36 h y se pre
cultivaron en mosto durante 12 h a 28 °C para L. brevis y L. plantarum y a 48 °C para L.
amylolyticus antes de su uso en los experimentos. Las células se lavaron tres veces con solución
de Ringer en un cuarto de fuerza estéril (Sigma Aldrich) a 4000 rpm, 4ºC durante 10 minutos. La
fermentación se llevó a cabo por triplicado a escala de laboratorio en 500 ml de volumen de
mosto en condiciones estáticas durante 72 h. La tasa de inoculación fue de 5.8 ± 1.1 x 10 CFU
(unidad formadora de colonias) / mL. Las muestras fermentadas se usaron inmediatamente para
la viabilidad, la vitalidad y los procedimientos de tinción, mientras que las del pH, la capacidad
de tamponamiento y las mediciones analíticas se almacenaron a 4 ° C y 20 ° C, respectivamente,
hasta el análisis.

2.2. Cinética de viabilidad y muerte:

La viabilidad celular se evaluó usando el método de conteo de placas, y la determinación de la

tasa de mortalidad se consideró usar el conteo microscópico de fluorescencia después del
marcado celular con diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) y sondas fluorescentes de yoduro
de propidio (PI).

2.2.1. Recuento de placas:

La viabilidad se midió mediante el método de recuento de unidades formadoras de colonias. Se

prepararon diluciones decimales seriadas en solución de Ringer estéril en un cuarto de fuerza y
se sembraron muestras diluidas de 0,1 ml en agar MRS por triplicado usando el procedimiento
de vertido en placa y se incubaron a 28 °C y 48 °C para L. plantarum / L. brevis y L. amylolyticus,
respectivamente, durante 48 h. Las colonias viables se contaron y registraron como el número
de UFC / ml.

2.2.2. Etiquetado de fluorescencia celular con CFDA y PI:

Se preparó una solución de CFDA (10 mM) disolviendo 4,6 mg de CFDA en 1 ml de

dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó en alícuotas de 1 ml a 20 °C en la oscuridad y se diluyó
a 1 mmol usando DMSO antes de su uso. El PI se suministró como una solución de 1 mg / ml y
se almacenó en la oscuridad en el refrigerador. Las células se lavaron tres veces con solución de
Ringer y se resuspendieron en una OD600nm de 1,2 antes de la tinción. Se añadieron 30 ml de
CFDA a 940 ml de suspensión de bacterias y se mantuvieron en la oscuridad a 30 ° C durante 10
minutos. A continuación, se añadieron 30 ml de PI y se mantuvieron en la oscuridad a 30°C
durante 10 minutos (Bunthof et al., 1999). Las células se lavaron dos veces para eliminar el
exceso de sondas y se resuspendieron en la solución de Ringer; las alícuotas se almacenaron en
hielo hasta el análisis dentro de 1 h. Las células marcadas en rojo y marcadas en verde de 10
campos visuales se contaron a un objetivo de 40x usando un microscopio de epifluorescencia
Zeiss Axioskop equipado con tres conjuntos de filtros para DAPI / PI / CFDA y una cámara (Carl
Zeiss, Alemania). Cada muestra se contó por triplicado. El porcentaje de muertes se calculó como
la relación entre las células marcadas con rojo y el total de las células marcadas con rojo y verde.

2.3. Prueba de poder de acidificación (AP) y evaluación de vitalidad:

La vitalidad se evaluó mediante la prueba de poder de acidificación, que mide la actividad

glucolítica a través de la capacidad de las células para reducir el valor de pH de la solución de
glucosa al 0.1% (Riis et al., 1995; Sigler, 2013). El método aplicado fue adaptado de una
metodología reportada previamente (Bunthof et al., 1999). Las células se lavaron tres veces
(4000 rpm, 4ºC, 10 min) y se volvieron a suspender en una solución de Ringer a un pH de 6,5 a
una DO600nm final de 1,0 ± 0,1 correspondiente a 8 ± 1x10^7 células / ml. Después de equilibrar
a 25ºC, se añadieron 200 ml de glucosa a 20 ml de suspensión celular hasta una concentración
final de 6 mM. La acidificación media se evaluó después de 10 minutos por medición del valor
de pH. La potencia de acidificación se calculó como la diferencia de pH entre el valor de pH inicial
(6,5) y el valor de pH después de 10 min. La prueba fue hecha por triplicado.

2.4. Determinaciones analíticas:

2.4.1. Análisis de Azúcar:

Los azúcares extracelulares se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC) usando un detector amperométrico pulsado (PAD) y una columna de hidratos de carbono
Dionex Carbopac PA10 (Thermo Scientific, Alemania). Se usaron compuestos de referencia
comerciales externos para la calibración.

2.4.2. Análisis de ácidos orgánicos:

Se usaron kits enzimáticos específicos (Megazyme, Irlanda) para determinar las concentraciones
de ácido L-láctico extracelular (kit k-late 07/14), ácido acético (kit k-acetrm 07/12), ácido L-
málico (kit k- lmal-58A 246 SD Nsogning y col. / Food Microbiology 73 (2018) 245e253 0914) y
ácido succínico (kit k-succ 01/14) según las instrucciones del fabricante. Antes del análisis, las
muestras se calentaron a 80 ° C durante 5 min, se centrifugaron y el sobrenadante se usó para
el análisis.

2.4.3. Aminoácidos y nitrógeno amino libre:

La cuantificación de aminoácidos libres se realizó por HPLC y el nitrógeno amino libre (FAN) se
determinó mediante un método basado en ninhidrina de acuerdo con los métodos aprobados
de MEBAK (Jakob, 2012).

2.4.4. Cambio de la capacidad de amortiguación:

La capacidad de amortiguación de las bebidas se determinó mediante titulación de 100 ml de

muestra con HCl 1 M (Charalampopoulos et al., 2002; Li et al., 2016). Se calculó la capacidad de
amortiguación que expresa la cantidad de HCl (mM) necesaria para dejar caer 1 unidad de pH
por litro de muestras usando la fórmula:

Siendo:
BC: Capacidad de Amortiguación : Volumen requerido de HCl (L)

: Concentración de HCl (M) : Volumen de muestra (L)

: Cambio en el valor de pH.

2.5. Implicación de la lisina, la arginina, el ácido glutámico o la fructosa y la capacidad de

amortiguación del mosto en el crecimiento de células de LAB:

El 14% de mosto de malta de cebada se inoculó con las correspondientes cepas de LAB y 10 ml
de cada una individualmente enriquecidas con aminoácidos, fructosa y agente tampón (20 g / l
de KH2PO4 y 0.18 g / l de NaOH) a concentraciones de 0.6 g / l, 2.5 g / L y 10,4 mmol HCl pH^-1
L^-1. La fermentación se llevó a cabo en microplacas con un volumen de 250 ml utilizando las
mismas condiciones que en la sección 2.1. El desarrollo celular se controló midiendo la DO600nm
hasta que se alcanzó la fase estacionaria usando el lector de microplacas Cytation ™ 5 (BioTek®
Instruments, Inc.); el recuento de células viables en ese período se evaluó mediante el método
de recuento de unidades formadoras de colonias.

2.6. Análisis Estadístico:

El análisis de varianza de una vía u one-way (ANOVA) se aplicó a los datos experimentales. La
prueba de Tukey se usó para la comparación de valores medios para identificar diferencias
significativas. Los resultados se consideraron significativamente diferentes en p <0,05. OriginPro
2015G (OriginLab Corporation, Northampton, EE. UU.) Se utilizó como herramienta estadística.
Los resultados se presentan como valores medios ± desviaciones estándar de repeticiones
independientes.

3. Resultados y Discusiones:

3.1. Viabilidad de las células de LAB, tasa de mortalidad y vitalidad:

La viabilidad celular y la vitalidad son parámetros importantes para la actividad fisiológica de las
células y la calidad del producto. Como se muestra en la Fig. 1-a), se observaron fases de
crecimiento corto e inicio rápido de la fase de muerte para las seis cepas de BAL en la
fermentación de mosto de malta. La fase de crecimiento en sí tomó alrededor de 24 a 48 h
dependiendo de la variedad. Esto es consistente con estudios previos, que informaron una fase
de crecimiento de 10 a 40 h en sustratos de cereales y mosto de malta (Charalampopoulos et
al., 2002; Peyer et al., 2015; Rathore et al., 2012; Rozada Sánchez y otros, 2008). Se observó una
disminución rápida en el recuento viable en las cepas Lp.765 de L. amylolyticus y L. plantarum,
mientras que L. plantarum Lp.758, Lp.725 y L. brevis Lb.986 proporcionaron el mayor recuento
viable y un mayor tiempo de crecimiento. Si la disminución del recuento viable se debía a la
muerte celular se determinó mediante marcaje celular con sondas fluorescentes y
monitorización del porcentaje de muerte celular durante la fermentación (Fig. 1-b). Se observó
un aumento rápido en la tasa de mortalidad a partir de la fase de crecimiento exponencial. En
la fase de muerte, hasta 80% de las células estaban muertas, dependiendo de las cepas de LAB.
Se sabe que el ácido láctico producido por LAB es un fuerte inhibidor de su crecimiento y
viabilidad (Pieterse et al., 2005). Uno de los efectos inhibidores de la acumulación de ácido
láctico sobre las cepas de BAL es la disipación del potencial de membrana. Se observó una
inhibición completa del crecimiento de L. plantarum Lp.758 a una concentración de ácido láctico
de 1,7 g / l (datos no mostrados). De forma similar, se informó la inhibición del crecimiento de
L. lactis a partir de una concentración de ácido láctico de 1.8 g / l, que dio como resultado una
degradación significativa del potencial de membrana (Magni et al., 1999).
Solo las células de membrana dañadas, incluida la muerte y las células viables pero no cultivables
(VNC), pueden absorber la sonda PI. Sin embargo, VNC puede recuperarse en condiciones
favorables, como se observó con células marcadas con PI-red de L. plantarum en cultivo líquido
a pH 6,5 (Ingham et al., 2008). Además, se observó una recuperación muy rápida de VNC en el
laboratorio de vino a partir de la disponibilidad de oxígeno (Millet y Lonvaud-Funel, 2000).
Además, se informó que las VNC LAB dañadas y sometidas a actividades enzimáticas observadas
con la capacidad de descomposición de VNC L. lindneri en cerveza (Suzuki et al., 2006) y la
actividad lactato deshidrogenasa de L. plantarum en queso (Gobbetti et al., 2015) ) Por lo tanto,
se sugirió que VNC aún podría hidrolizar los ésteres fluorescentes para contar como viables con
la técnica de fluorescencia, aunque no pueden formar colonias en agar MRS (Millet y Lonvaud-
Funel, 2000). De forma similar, no se detectaron VNC de L. lindneri y L. paracollinoides en agar
MRS, mientras que se contaron hasta 460 células viables mediante la técnica de fluorescencia
en cerveza (Suzuki et al., 2006). En consecuencia, causa inconsistencias en los recuentos de BAL
por epifluorescencia y UFC como se reporta en casos de elaboración de vino (Millet y Lonvaud-
Funel, 2000). Por lo tanto, se explica la discrepancia en los resultados de UFC y la tasa de
mortalidad observada en este estudio. Además, como la tasa de mortalidad se expresa en
porcentaje, esta considera y evalúa el número de células de muerte contra el recuento total de
células en cada momento en el medio, mientras que la UFC solo mide el recuento de células
viables restantes en ese mismo período. El aumento continuo de la tasa de mortalidad lleva a
sugerir que durante la fermentación de ácido láctico de mosto de malta, a medida que las células
viables se multiplicaban, una proporción de esas (células no resistentes) murieron
continuamente y se acumularon reduciendo el número real de células viables en cada momento
pero aumentando el número de células muertas. Esto explica aún más la discrepancia
observada, pero también el aumento exponencial en la tasa de mortalidad.

La actividad metabólica celular evaluada a través de la prueba de vitalidad representa la

capacidad de las células para metabolizar la glucosa y transportar activamente los iones de
hidrógeno a través de su membrana intacta al medio. Solo las células viables con membrana
intacta y metabólicamente activas pueden lograr eso (Bunthof et al., 1999). La figura 1-c muestra
que la vitalidad celular disminuyó drásticamente durante toda la fermentación para alcanzar
valores muy bajos. Las cepas de L. plantarum Lp.758 y Lp.725 con el recuento viable de extremo
superior y la tasa de mortalidad más baja también tuvieron valores de vitalidad más altos a las
72 h. de fermentación. El bajo poder de acidificación (AP) de L. brevis Lb.986 no refleja
absolutamente una baja actividad metabólica ya que es un heterolactico obligado que produce
menos ácido que sus contrapartidas homolácticas. Además, la prueba AP mide la actividad
metabólica con respecto al recuento total de células. Eso significa que el alto porcentaje de
células muertas observado, por lo tanto, han contribuido a la disminución de la actividad
metabólica total.

Cuando se hace referencia a estudios previos que mencionan el bajo rendimiento de aroma en
las bebidas a base de malta fermentada con ácido láctico, es crucial tener células vivas y
metabólicamente activas para una alta formación de metabolitos. Sin embargo, encontramos
una fase de crecimiento corta y una iniciación rápida de la fase de muerte,ocurre un aumento
continuo de la muerte celular con una reducción significativa en la actividad metabólica de las
células LAB en la malta. Esto constituye limitaciones importantes que pueden explicar el bajo
rendimiento en compuestos aromáticos reportados en bebidas a base de malta (Nsogning
Dongmo et al., 2017).

3.2. Cambios medios de composición:

3.2.1. Fermentación de azúcar:

De aquí en adelante, era importante determinar si los azúcares pueden haber estado limitados
durante la fermentación para causar la muerte celular. Los principales azúcares fermentables en
el mosto de malta eran glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa. El 14% de la malta de
cebada utilizada en este estudio tenía 11.9 g / L, 1.8 g / L, 5.2 g / L, 63.2 g / L y 15.9 g / L de
glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa, respectivamente. La glucosa, la fructosa y la
sacarosa fueron los principales azúcares utilizados; se degradaron simultánea y continuamente
durante la fermentación, dependiendo de la fermentación de la cepa LAB (Fig. 2). El 52-83% de
glucosa permaneció en el medio correspondiente a 6,2-9,9 g / l (figura 2-a). Hasta donde
sabemos, no existen datos sobre la concentración mínima de glucosa requerida por las BAL para
el crecimiento, pero su concentración en el medio puede influir en su absorción y actividad
glucolítica (Papagianni et al., 2007). Además, en nuestro trabajo no publicado se observó el
crecimiento de LAB en un 6% de mosto de malta de cebada (5 g / l de contenido de glucosa). Por
lo tanto, la glucosa no era limitante en el medio y más probable que no hayan sido la causa de
la muerte celular. La fructosa se agotó rápidamente en todos los casos excepto en las cepas de
L. amylolyticus (figura 2-b). Vale la pena mencionar que la concentración de fructosa en el mosto
de malta es menor que la glucosa en una relación molar de 1: 6. Sin embargo, aún no se ha
informado sobre la fructosa como azúcar esencial para el crecimiento de LAB, aunque se
especula que su metabolismo aumenta la actividad metabólica de LAB y la tasa de crecimiento
(Zaunmüller et al., 2006). La utilización de fructosa como aceptador de electrones proporciona
a las células LAB una ganancia extra de ATP sin gasto de ATP mediante la conversión de acetil-P
en acetato (Zaunmüller et al., 2006). En este caso, la limitación en la fructosa puede afectar el
crecimiento y la viabilidad de las BAL. La sacarosa se mantuvo a 46 - 98% (Fig. 2-c) en el medio
de fermentación. No parece ser un azúcar fermentable importante para las cepas consideradas
de BAL. El metabolismo de sacarosa por levansucrasa o bglucosidasa para fructosa y glucosa se
informó tanto en homólogas como en LAB heterolacticas (Bonestroo et al., 1992; Tung-Hai,
2003). El mayor contenido de fructosa en la última etapa de la fermentación puede estar
relacionado con la acción de las enzimas liberadas desde el citoplasma después de la muerte
celular, que pueden haber convertido la sacarosa en fructosa. Además, es previsible que el
contenido de sacarosa es de forma significativa para la disminución en el mismo período (Fig.
2c), donde una gran proporción de las células habían muerto (Fig. 1a) para ambas cepas / T5
La.T3 L. amylolyticus.

La maltosa es el principal azúcar en el mosto de malta y permaneció en el medio a 96 - 99% (Fig.

2-d) para un consumo total de 0.5 - 2.6 g / l. Es, por lo tanto, el azúcar menos consumido durante
la fermentación del mosto de malta por LAB. La maltosa es la azúcar preferida de los aglutinantes
heterolácticos de masa fermentada porque se ahorra el gasto de 1 mol de ATP necesario para la
conversión de glucosa en glucosa-6-fosfato. Es consistente con el mayor porcentaje de
utilización de maltosa por L. brevis heterolactica observada en este estudio. El metabolismo de
la maltosa en LAB se produce a través de la maltosa fosforilasa intracelular y la escisión de 6-
fosfo-a-glucosidasa para heterolácticos y homólosicos obligados, respectivamente (Ehrmann y
Vogel, 1998; Ganzle et al., 2007 €). Por el contrario, no pudimos encontrar una utilización
explícita de maltotriosa por ninguna de las seis cepas consideradas en este estudio (datos no
mostrados). La utilización total de azúcar aumentó significativamente en la fase de crecimiento
constante para hibernar en la fase de crecimiento estacionario, aunque las concentraciones
fueron diferentes entre las cepas (figura 2-e). El consumo continuo de azúcar en la última etapa
de la fermentación, donde las células comenzaron a morir, puede estar relacionado con el
metabolismo de células vivas resistentes o con la actividad glicolítica no relacionada con el
crecimiento. Del mismo modo, ya se informó la actividad glucolítica en células de L. plantarum
dañadas que no crecen (Gobbetti et al., 2015). El aumento en la producción de ácido láctico en
el mismo período apoya esta afirmación. En total, solo se consumieron 5.3 - 8.2% de azúcar
(Tabla 1). Todavía había suficiente azúcar en el medio de fermentación para apoyar el
crecimiento continuo de LAB. Sin embargo, el posible impacto indirecto de la fructosa se seguirá
investigando en este estudio.

3.2.2. Cambio en la concentración de ácido orgánico durante la fermentación del mosto de la

malta:

Como se informó que el ácido láctico, el ácido acético y el ácido succínico inhiben el crecimiento
de BAL (Li et al., 2010; Magni et al., 1999), nos interesamos en la concentración de ácidos
orgánicos durante la fermentación del mosto como posible causa de muerte rápida de las células
de LAB. Se observaron los mismos patrones en la acumulación de ácido láctico, acético y
succínico, pero las concentraciones dependían en gran medida de las cepas de BAL (figura 3).
Allí, la vía fermentativa de las cepas de BAL es determinante porque las homólogas producen 2
moles de ácido láctico por mol de hexosa consumida, mientras que los heterolácticos producen
1 mol de ácido láctico (Pessione, 2012). Se observó una acumulación de hasta 3,9 ± 0,4 g / l de
ácido láctico (figura 3-a) con un rendimiento de 0,11 - 0,49 g / g de azúcar consumido (tabla 1).
Las concentraciones fueron mucho más altas que la concentración de ácido láctico inicial
informada de 1,8 g / l, lo que inhibió el crecimiento de Lactococcus lactis (Magni et al., 1999).
De manera similar, en nuestro trabajo no publicado se observó la inhibición del crecimiento de
las cepas de BAL consideradas en este estudio, dentro del mosto de la malta a una concentración
inicial de ácido láctico de 1.7 g / l. La sensibilidad al ácido láctico puede variar entre las cepas y
la concentración inhibitoria en la fermentación en curso puede ser mayor que la que se produce
en condiciones de estrés por choque. La acumulación de ácido láctico puede haber contribuido,
por lo tanto, a la muerte de las células de LAB durante la fermentación. Las concentraciones de
ácido acético de 0.7 - 0.2 g / L (Fig. 3-b) con un rendimiento de 0.009 - 0.029 g / g de azúcar
(Tabla 1) obtenidas fueron bastante inferiores a las de 1.2 g / L y 3.6 g / L, que redujo,
respectivamente a la tasa de crecimiento y al rendimiento de biomasa de Lactococcus lactis
(Magni et al., 1999). El ácido acético por sí solo tiene poca probabilidad de obstaculizar el
crecimiento de BAL, pero en combinación con el ácido láctico, puede tener lugar a una
inhibición. Las concentraciones más altas en la fermentación tardía pueden explicarse por el
mecanismo de células vivas resistentes para superar el estrés del ácido láctico por la
sobreexpresión de enzimas metabólicas de piruvato para redirigir la conversión de piruvato a
acetil-CoA y acetil-P para la producción de ácido acético a expensas del ácido láctico (Gobbetti
et al., 2015; Pedersen et al., 2012).

Todas las seis cepas de LAB generaron ácido succínico durante la fermentación del mosto hasta
0.8 g / L (Fig. 3-c). Por lo tanto, prevaleció el ácido succínico ante el ácido acético (0,2 g / l). Se
describió que el metabolismo de citrato a ácido succínico u otros ácidos es utilizado por
Lactococcus lactis para superar el efecto inhibidor del lactato (Magni et al., 1999). Sin embargo,
es improbable que el ácido succínico haya afectado la viabilidad de las BAL, aunque no se debe
descuidar un efecto en combinación con el ácido láctico. Por lo tanto, se debe prestar más
atención al ácido succínico como un ácido importante en la fermentación del ácido láctico del
mosto de malta. Se encontró ácido málico en el mosto de la malta a una concentración muy baja
de 0,4 g / l (figura 3-d) en comparación con el mosto (6 g / l) (Knoll et al., 2012). Se formó durante
el proceso de malteado por microorganismos endógenos (Li y Fang Liu, 2015). En este estudio,
se observó la degradación del ácido málico en todas las cepas de LAB consideradas, donde la
extensión fue mayor por L. plantarum y L. brevis. Las actividades malolácticas ya se informaron
en varias cepas de L. plantarum y L. brevis (Bravo Ferra et al., 2013; Iorizzo et al., 2016; Zhang y
Lovitt, 2006). Como tal, la fermentación maloláctica ya se informó en la fermentación de zumos
y sidra (Costantini et al., 2008; Sanchez et al., 2014). Quizás se pueda encontrar en la
fermentación de mosto de malta también. En resumen, el ácido láctico prevaleció en
concentraciones mucho más altas que la concentración inhibidora informada y, por lo tanto,
puede haber contribuido a la muerte celular de BAL durante la fermentación. Se están realizando
investigaciones adicionales sobre los efectos inhibidores combinados de los ácidos orgánicos en
el crecimiento de BAL y la muerte en la malta. Se investigó más a fondo en este estudio si fue la
única causa de la muerte celular.

3.2.3. Cambio del valor pH en el mosto de la malta y capacidad de amortiguación durante la

fermentación:

La capacidad de amortiguación (BC) es de gran importancia en la fermentación de ácido láctico

debido a la disminución del pH que se produce como consecuencia de la acumulación de ácido
y su impacto negativo sobre el crecimiento y la viabilidad de las BAL. La alta BC retrasará la caída
rápida de pH a valores por debajo del óptimo para el crecimiento y la viabilidad de LAB. La rápida
disminución en los valores de pH fue consistente con la producción de ácido orgánico (Fig. 4-a).
El cambio de pH total fue de 1.4 a 1.9 para valores de pH final de 3.6 y 3.1, respectivamente. Sin
embargo, el valor de ph rondo entre 3.5, la disminución fue lenta, aunque los ácidos orgánicos
todavía se produjeron significativamente en el medio. Para comprender el bajo cambio del valor
del pH en esa etapa de fermentación, a continuación, se evaluó la capacidad del mosto de malta
para resistir el cambio de pH durante la fermentación del ácido láctico (figura 4-b).

Se obtuvo un aumento típico no lineal del mosto de malta respecto a su BC con caída de pH
durante la fermentación. El valor inicial de 4.5 mmol HCl pH 1 L 1 fue bajo, lo que causó una
rápida caída de pH en la etapa inicial de la fermentación. A partir de entonces, aumentó
lentamente para alcanzar un aumento exponencial a un valor de pH de alrededor de 3.5. En esa
fase, el valor del pH apenas cambió, aunque los ácidos orgánicos se acumularon continuamente.
Se obtuvieron valores más altos (hasta 31,3 mmol HCl pH 1 L 1) en la fermentación a última hora
y el aumento fue proporcional a las concentraciones de ácido. Se notificó un valor de BC de 8.5
mmol HCl pH 1 L 1 en medio de malta (Charalampopoulos et al., 2002). La diferencia con
nuestros resultados puede deberse a un proceso de preparación diferente.

La capacidad de amortiguación del mosto de malta se atribuyó a sustancias anfóteras como

aminoácidos, proteínas, peptonas e iones inorgánicos (Lewis y Bamforth, 2007; Yuldasheva et
al., 2013). El efecto amortiguador de la adición de ácido láctico al mosto se describió en un
estudio previo (Li et al., 2016). El ácido láctico (CH3CH (OH) CO2H), con un valor pKa de 3.85,
está en equilibrio con su forma ionizada (CH3CH (OH) CO2-) cuando el pH del medio es igual a
su pKa. Cuando hay una cantidad significativa de ambos, se crea el buffer y la capacidad es
proporcional a la concentración de ambos agentes. Como tal, los valores de BC fueron más altos
en el rango de pH cerca del valor de pKa de ácido láctico (3,86 ± 0,5). Luego, sugerimos que el
ácido láctico y su base conjugada son los principales agentes reguladores del pH que causan un
aumento del amortiguacion en la última etapa de la fermentación de la malta. En resumen, la
acumulación de ácido láctico disminuyó rápidamente el valor del pH en la etapa inicial de la
fermentación, lo que a la inversa favorece la formación de ácido láctico / amortiguación
importante de lactato que conduce a un mayor aumento en el CB en la última etapa de la
fermentación. Por lo tanto, el valor de pH constante en la última etapa de la fermentación no
significa necesariamente la ausencia de producción de ácido. Además, la ionización de ácidos
lácticos para crear la amortiguación puede reducir la disponibilidad de ácido láctico no ionizado
que es tóxico para las células de LAB. En consecuencia, el bajo BC en el mosto puede dificultar
el crecimiento de las células LAB a través de la consiguiente caída rápida del pH, ya que los bajos
valores de pH son perjudiciales para el crecimiento y la viabilidad de las BAL.

3.2.4. Aminoácidos residuales y nitrógeno amino libre:

Se sabe que las LAB son auxótrofos a una amplia gama de aminoácidos esenciales. Esto aumentó
nuestro interés en el contenido de aminoácidos en la fermentación del mosto por LAB. De
acuerdo con la Fig. 5, el mosto de malta contenía 0.58 ± 0.02 g / L y 4.60 ± 0.03 g / L de nitrógeno
amino libre y aminoácidos totales, respectivamente. La lisina, el ácido glutámico, la arginina, la
leucina, la fenilalanina y la alanina fueron los aminoácidos predominantes y constituyeron el
58.8% del total de aminoácidos. No hubo diferencias significativas en los aminoácidos residuales
entre las cepas de L. plantarum, pero se observaron diferencias significativas con otras cepas
(datos no mostrados). Los aminoácidos fueron importantes para el crecimiento de BAL, se
usaron hasta el 76% del total de aminoácidos y el 77% del nitrógeno amino libre total (Fig. 5). Se
organizaron tentativamente en 4 grupos de acuerdo con su grado de utilización, lo que fue
consistente con su prevalencia en la malta. La lisina, la arginina y el ácido glutámico, que
constituyen el grupo A, fueron los más importantes, consumiéndose la lisina hasta que
permaneció menos del 2%. Del mismo modo, la lisina y la arginina fueron consumidas
significativamente por una cepa de L. plantarum, en comparación con otros aminoácidos, en la
fermentación MRS (Lee et al., 2014) mientras que el ácido glutámico se encontró esencial para
docenas de cepas de BAL (Costello et al ., 2015; Terrade y Mira de Orduna, 2009 ~). Los
aminoácidos no solo son necesarios como fuente de nitrógeno para el crecimiento celular, sino
también para responder al estrés ácido a través de su descarboxilación. La descarboxilación de
lisina y glutamato facilita el aumento del pH intracelular. La formación de ATP en el catabolismo
de arginina constituye una fuente alternativa de energía para LAB, mientras que el amoníaco,
generado a partir de la desaminación, aumenta el valor de pH del medio (Azcarate-Peril y
Klaenhammer, 2010; Pessione, 2012).

Por lo tanto, la falta de aminoácidos puede no solo causar inhibición del crecimiento relacionada
con los nutrientes sino también reducir la resistencia al estrés ácido. Sin embargo, todos los
aminoácidos medidos mostraron una concentración residual en la última etapa de la
fermentación. Se informó que la expresión de genes implicados en la captación de aminoácidos
disminuye significativamente bajo estrés por ácido láctico (Pieterse et al., 2005) y la absorción
de aminoácidos por LAB es baja (Vermeulen et al., 2006). Por lo tanto, el potencial de absorción
de aminoácidos de LAB se redujo probablemente demasiado bajo en la última etapa de la
fermentación. Dependiendo de la cepa de LAB, los aminoácidos podrían haberse agotado entre
las 24 y 48 h de fermentación del mosto de malta. Además, la medición de aminoácidos en cada
etapa de fermentación definirá el tiempo de agotamiento de aminoácidos en la fermentación
del mosto de malta. Nuestros resultados revelan una limitación en los aminoácidos clave
durante la fermentación del ácido láctico del mosto de malta. Esto puede haber contribuido al
cese del crecimiento y la muerte celular. Por lo tanto, fue de gran importancia determinar su
implicación en el comportamiento de crecimiento de LAB en la malta.

3.2.5. Implicación de la lisina, la arginina, el ácido glutámico o la fructosa y la capacidad de

amortiguación del mosto en el comportamiento de crecimiento de LAB en hierba de malta:

Las principales limitaciones para el crecimiento de las células de LAB en el mosto de la malta en
este estudio son aminoácidos clave, fructosa y BC, además del efecto inhibidor especulado del
ácido láctico. Para eso, se hicieron más investigaciones para resaltar sus implicaciones en el
comportamiento de crecimiento de LAB. Se encontró que la adición de arginina y lisina al mosto
aumentó significativamente el crecimiento celular (Fig. 6). La duplicación en la adición de su
contenido condujo a un aumento en el recuento de células (Fig. 7). Su importancia para el
crecimiento de BAL se informó anteriormente (Lee et al., 2014). Son aminoácidos básicos y su
adición a la malta provocó un aumento en el valor inicial del pH. Por esta razón, la histidina, un
aminoácido básico que también se informó que utilizaba LAB para luchar contra el estrés ácido,
se consideraba un control, aunque su contenido en la malta era bajo. El comparable
comportamiento de crecimiento con arginina y lisina se observó. Además, el aumento del valor
del pH debido a su adición no fue responsable del mayor desarrollo celular; un experimento
paralelo con mosto a diferentes valores de pH mostró que un valor de pH alto aumenta el
crecimiento celular pero el efecto fue menor que con la adición de aminoácidos (datos no
mostrados). No pudimos establecer una conclusión clara sobre el impacto del ácido glutámico
porque, como aminoácido ácido, su adición disminuyó significativamente el valor del pH del
mosto. Luego, se concluyó que el agotamiento de arginina y lisina en el mosto de malta limitaba
el crecimiento de células de LAB.

La adición de fructosa mejoró el desarrollo celular cuando el mosto fue fermentado por L. brevis
Lb.986, mientras que no tuvo un impacto significativo cuando se usaron L. plantarum Lp.758 y
L. amylolyticus, el efecto fue menor que el de los aminoácidos. La contribución puede estar
relacionada con una ganancia de ATP en la utilización de fructosa como aceptador de electrones
(ver sección 3.2.1), que compensa la baja ganancia de ATP por heterolácticos en el metabolismo
de la glucosa (Ganzle et al., 2007 €). Por lo tanto, el efecto de la fructosa en la muerte celular de
LAB se consideró como no apreciable.

El almacenamiento de amortiguación del mosto incrementó el crecimiento celular, pero fue

menor que la adición de aminoácidos, a excepción de la cepa L. amylolyticus, donde el efecto
fue significativamente mayor que el de la adición de aminoácidos (Fig. 6). Esta cepa, como
homoláctica obligada, produjo más ácido láctico que sus homólogos (ver Fig. 3a). La
amortiguación puede haber evitado una rápida caída del pH, permitiendo un mayor crecimiento
celular pero el aumento resultante en el contenido de ácido láctico, y la limitación clave de
aminoácidos puede haber causado el cese del crecimiento. Este resultado presenta no solo la
contribución de la baja capacidad de amortiguación del mosto sino también la de la reducción
de aminoácidos y la acumulación de ácido láctico en la muerte de LAB en la malta del mosto. El
efecto de la amortiguación de los aminoácidos, la fructosa y el mosto en el cambio del valor del
pH (Fig. 7) reveló que la adición de aminoácidos condujo a un mayor cambio de pH durante la
fermentación. La explicación puede ser una mayor producción de ácido como resultado de un
mayor desarrollo celular en combinación con una baja capacidad de amortiguación del mosto.
El almacenamiento en buffer del mosto condujo a una reducción significativa en el cambio total
de pH. Como tal, la combinación de aminoácidos y amortiguación aumentó aún más el recuento
de células, pero el cambio de pH permaneció menos. Sin embargo, duplicar la suplementación
de aminoácidos condujo a un aumento adicional del recuento de células y el cambio de pH
permaneció menor que cuando no se produjo ninguna adición.

Según la viabilidad de LAB, la Fig. 8 muestra que la adición de aminoácidos aumentó

significativamente el recuento viable total en la fase estacionaria siendo la arginina la más
importante. Sin embargo, el almacenamiento de amortiguación del mosto solo condujo a una
reducción significativa del recuento viable. Cuando se combinaba con la administración de
suplementos de aminoácidos, el recuento de células viables era más alto, pero aún menor que
cuando solo se complementaba el aminoácido. Estos resultados mostraron que el contenido de
mosto de malta en estos aminoácidos juega un gran papel en la viabilidad de las BAL durante la
fermentación. Son utilizados por LAB como un nutriente de crecimiento esencial, pero también
para resistir y, por lo tanto, sobrevivir al estrés ácido (Azcarate-Peril y Klaenhammer, 2010;
Pessione, 2012). El almacenamiento en amortiguación de mosto puede haber permitido que se
produzca más ácido láctico, lo que causa la muerte de las células de LAB adicionales. Esto explica
el bajo recuento viable incluso cuando se combina con aminoácidos, en comparación con el alto
recuento viable cuando solo se añadieron aminoácidos. Esto corrobora aún más con la extrema
baja viabilidad de la cepa L. amylolyticus, que produjo la mayor cantidad de ácido láctico, incluso
en condiciones de aumento de aminoácidos. Estos resultados mostraron que el agotamiento de
aminoácidos, que se produce en la fermentación del mosto de malta, contribuyó
significativamente a la muerte inmediata de LAB como se informó en la sección 3.1; la
acumulación de ácidos orgánicos también es de gran contribución. Si el crecimiento de LAB
mejorado y la viabilidad consecuente a la suplementación de aminoácidos, puede aumentar el
contenido en compuestos aromáticos, merece la pena ser investigado.

4. Conclusiones:

El objetivo de este estudio fue dilucidar el rendimiento de la fermentación de LAB en la

fermentación del mosto de la malta de cebada para delinear las limitaciones que puedan existir.
Encontramos que la fermentación de LAB en mosto de malta se abrevia con un rápido logro de
la fase de muerte acoplado a un rápido aumento en la tasa de muerte celular y una rápida
degradación de la actividad metabólica celular. La acumulación de ácido láctico, baja capacidad
de amortiguación del mosto, agotamiento de la fructosa y aminoácidos clave lisina, arginina y
agotamiento del ácido glutámico se sugirieron como los principales factores limitantes.

La suplementación de mosto de malta con aminoácidos y agentes amortiguadores llevó a la

conclusión de que el agotamiento de aminoácidos clave (arginina, lisina y ácido glutámico)
durante la fermentación causó el cese del crecimiento de BAL y la muerte celular durante la
fermentación del mosto. El almacenamiento en buffer del mosto fue una contribución al
crecimiento y la viabilidad de las BAL solo en combinación con la disponibilidad de aminoácidos.
Por lo tanto, se debe prestar más atención al contenido de estos aminoácidos en la malta.
Además, hemos especulado sobre la contribución significativa de la acumulación de ácido láctico
a la muerte celular de LAB. Sin embargo, la buena viabilidad celular durante la fermentación,
principalmente en la fase estacionaria, donde las condiciones de estrés están disponibles, es de
gran ventaja para la formación de metabolitos. Otros estudios que valen la pena son sobre la
implicación del crecimiento y la viabilidad de LAB mejorados, a través del aumento de la
capacidad de amortiguación y aminoácidos en el rendimiento de aroma. Además, la
suplementación con mosto no mejoró la duración de la fermentación. Por lo tanto, el manejo
del proceso de maceración de la actividad de la proteasa, es de gran necesidad para optimizar
la composición del mosto de malta. Otro ejemplo son las consideraciones de los pseudocereales
o su mezcla, que son valiosos. Además, también es importante desarrollar un proceso de
fermentación que atenúe el efecto inhibidor del ácido láctico para tener una viabilidad
extendida para un perfil de sabor mejorado.