Laboratorio Enzimología

Práctica No. 2.- Determinación de proteínas mediante la técnica

de Bradford.
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
Instituto de ciencias biomédicas.
Lic. Químico Farmacéutico Biólogo.

Introducción. proteínas con sulfato de cobre que absorbe la

La cuantificación de proteínas es una parte luz a una determinada longitud de onda, ente
esencial de cualquier trabajo de laboratorio que otros métodos (Santiago, S., 2005).
involucre extracción, purificación o análisis de Un método rápido y preciso para la estimación
proteínas. La cuantificación de proteínas es a de la concentración de las proteínas es un
veces necesaria para el aislamiento, separación ensayo originalmente descrito por Bradford,
y análisis por cromatografía o técnicas este método se basa en la unión de un tinte a la
inmunoquímicas y electroforéticas. proteína. Este método cuenta con un alto
Dependiendo de la precisión requerida y del coeficiente de extinción molar, lo que se traduce
porcentaje de pureza de la proteína de interés, en que la sustancia absorbe la luz de una forma
diferentes métodos serán apropiados para muy eficiente a la longitud de onda adecuada
determinar la concentración de la proteína (Walker, J., 2002).
(Hayworth, D., 2010). Debido a que las proteínas difieren en su
En general para la cuantificación de proteínas composición de aminoácidos cada una
se pueden emplear numerosos métodos. Es responde de manera diferente a cada tipo de
necesario decir que la selección del método método de cuantificación. Para lograr una alta
debe ser cuidadosa ya que en muchas eficiencia en la estimación de la concentración
ocasiones la presencia de sustancias que total de alguna proteína en muestras
interfieren genera un ruido al momento de la desconocidas es esencial incluir una curva de
cuantificación. Entre los distintos métodos se calibración la cual indicará en cierto margen de
pueden nombrar los siguientes: métodos correlación una concentración a partir de esta
espectrométricos, métodos químicos como la curva fabricada a partir de estándares de
técnica de Kjeldahl mediante el cual se concentraciones conocidas (Hayworth, D.,
determina el contenido de nitrógeno o el método 2010).
de Biuret que se basa en la reacción de las Objetivo.
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Realizar y comprender el fundamento de una la curva de calibración se tomó de cada una 100
técnica de cuantificación de proteínas µL y se le adicionó 1 mL de reactivo de Bradford
(Bradford) y calcular la concentración de una y se incubo por 5 minutos a temperatura
muestra problema. ambiente, este último proceso se repitió solo
Metodología. que en lugar de los 100 µL de solución, se
Se inició el procedimiento con la realización de añadió esta cantidad de agua destilada, esto
una curva de calibración a concentraciones de para usar como blanco. Después se leyó en el
0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL en 1 mL, esta curva fue espectrofotómetro a una absorbancia de 595
a partir de una solución con una concentración nm.
de 4 mg/mL. Una vez hechas las soluciones de
Resultados.
A continuación se muestra la tabla No. 1 en la cual se observan los resultados obtenidos, los cuales
incluyen la absorbancia dada en cada concentración de la muestra, así como su promedio.
En la gráfica No. 1 se muestra la curva de calibración con los promedios de absorbancia obtenidos por
cada equipo, además muestra el coeficiente de correlación y la ecuación de la recta con la cual se
obtuvo la concentración de la muestra problema.
Concentración (mg/mL) Equipo No. Equipo No. 2 Equipo No. 3 Equipo No. 4 Promedio
1
Absorbancia a 595 nm.
0.1 0.41 - - 0.19 0.3
0.2 1.019 0.971 0.386 0.53 0.7265
0.3 1.026 0.756 0.756 0.847 0.84625
0.4 1.444 0.987 0.833 1.002 1.0665
Tabla No. 1.- Resultados en absorbancia de la curva de calibración.

Gráfica No. 1.- Curva de calibración, ecuación de la recta, y coeficiente de correlación.

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La ecuación obtenida de la gráfica No. 1 se De las tres formas cargadas del colorante se
despejó para obtener: encuentran las catiónicas que son de color rojo
𝑦 − 0.13 y verde las cuales absorben a una longitud de
𝑥=
2.4193 onda de 470 y 650 nm respectivamente. En
En esta ecuación se sustituye Y por la
contraste la forma anicónica es el azul, el cual
absorbancia de la muestra problema que en
se une a la proteína, este azul absorbe a 595
este caso fue:
nm, con lo cual se entiende que se cuantifica el
- Muestra problema No. 1 = 0.769.
azul de este colorante. El colorante aparece
- Muestra problema No. 2 = 0.212.
cuando se una a residuos de arginina y lisina en
Y se obtuvo una concentración de:
la proteína, esta unión es un enlace iónico o
- Concentración real de problema No. 1 =
salino, dado que la arginina y lisina son
0.264125 mg/mL.
aminoácidos cargados de forma positiva
- Concentración real de problema No. 2 =
(cationes) y el colorante está cargado de forma
0.03389 mg/mL.
negativa (anión).
Discusión.
Además Stephenson menciona que la
Los resultados de la curva de calibración
intensidad de absorción depende del contenido
muestran mucha variación, es por eso que se
de aminoácidos básicos y aromáticos. Las
decidió sacar un promedio y graficar a partir de
interferencias o no existen o son mínimas por
este. Los dos datos faltantes en la
cationes tanto sodio como potasio y
concentración de 0.1 de los equipos 2 y 3
carbohidratos como la sacarosa. Otras
reflejan la variación de los datos, estos
sustancias que interfieren en el ensayo son los
resultados pueden deberse a ciertos factores
agentes fuertemente alcalinos (fácilmente
sin embargo los demás datos demuestran que
solucionable con la utilización de buffers). Los
la mencionada variación no fue causada solo
únicos componentes encontrados que dan una
por algún factor si no que fueron varios factores
excesiva interferencia en el color del ensayo,
los que congeniaron para que estos resultados
son altas concentraciones de detergentes como
se dieran de esta manera.
el SDS, Triton X-100, etc.
Según Kruger, N. (2002) la reacción para el
Conclusión.
ensayo de Bradford se da entre el colorante
Se cumplió con los objetivos propuestos para la
Coomasie Blue g250 y la proteína. Menciona
práctica dado que se logró realizar la técnica de
también que diversos estudios dicen que el
cuantificación de Bradford y además mediante
colorante libre puede existir en 4 diferentes
la realización de este reporte se logró
formas iónicas cuyos pKa son 1.15, 1.82 y 12.4.
comprender el fundamento de esta técnica.
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Además mediante los datos obtenidos en la • Walker, J. (2002). The protein
práctica se logró calcular la concentración de quantitation. The protein protocols

una muestra problema a partir de una curva de handbook. New Yersey: University of
Hertfordshire.
calibración. Debido a los resultados tan
• Kruger, N. (2002). Sample preparation
variables obtenidos se puede decir que la
for protein assays. Protein methods
manera en que se aplicó el método no es
overview. United Kingdon: University of
buena, pero dada la investigación bibliográfica
Oxford.
que indica que el método tiene un alto • Stephenson, F. (2008). Measuring
coeficiente de extinción lo cual es protein concentration by colorimetric
imprescindible para aumentar la sensibilidad en assay. Calculation for molecular biology
la medición de proteínas y que la unión and biotechnology.
colorante-proteína es un proceso muy rápido,
dos minutos, y el complejo permanece estable
durante un tiempo relativamente largo, una
hora, haciendo de este un proceso muy rápido,
y que no requiere un tiempo crítico para el
ensayo, además de que es un método muy
reproducible se puede llegar a la conclusión de
que el método de Bradford es un método muy
recomendable para la cuantificación de
proteínas, siempre y cuando se lleve de una
manera correcta.
Bibliografía.
• Hayworth, D. (2010). Assays methods.
Overview of protein assays methods.
U.S.: Thermo Scientific Pierce.
• Santiago, S. (2005). Separación y
determinación de proteínas.
Contribución a la determinación de la
fracción de metales traza ligados a las
proteínas similares a las metaloproteínas
en muestras de mejillón. España:
Universidad de Santiago de Compostela.