INGENIERIA GENÉTICA

VOL II
EXPRESIÓN DE DNA EN SISTEMAS HETERÓLOGOS
ANIMALES TRANSGÉNICOS | TERAPIA GÉNICA

La manipulación genética consiste en las técnicas dirigidas a modificar el caudal

hereditario de alguna especie, con fines variables, desde la superación de
enfermedades de origen genético (terapia genética) o con finalidad experimental
(conseguir un individuo con características no existentes hasta ese momento).

1. ANIMALES TRANSGÉNICOS
A lo largo de los siglos se han producido animales con nuevas combinaciones
de genes, utilizando métodos tradicionales de reproducción mediante cruces
selectivos e hibridaciones, pero siempre con la limitación de que los genes que
se cruzaban debían pertenecer a la misma especie o a especies muy parecidas.
Actualmente, y desde los años 80, la transgénesis ha permitido superar este
obstáculo, permitiendo a los científicos la investigación y aplicación de esta
técnica en numerosos campos. Además de la obtención de productos valiosos
por medio de microorganismos, la ingeniería genética permite la obtención de
plantas y animales alterados genéticamente. Son lo que se denominan
organismos transgénicos, y son aquellos dotados de una nueva información
genética derivada de la adquisición de un DNA foráneo y que son capaces de
transmitirlo a su descendencia. Normalmente, en los organismos animales
superiores, la información genética se transmite por mecanismos de
reproducción sexual en lo que se conoce como transmisión genética vertical;
sin embargo, hace alrededor de 20 años, se logró en ratones la transferencia
de esta información génica por inyección de un DNA extraño en un cigoto
obtenido por fecundación in vitro. Esto último es una transmisión genética
horizontal denominada transgénesis. Existen numerosas técnicas que se
emplean hoy en día para la obtención de animales transgénicos (virus sin
poder patógeno que actúan como vectores genéticos, microproyectiles
cargados con DNA, electroporación, microinyección de DNA,…), pero el
método más utilizado debido, principalmente, a que permite dirigir las
secuencias genéticas a lugares específicos del genoma, es aquel en el que se
emplean células en cultivo a las que se somete a modificaciones genéticas
específicas, produciendo células madre transgénicas que, posteriormente, son
insertadas en embriones en fase de blastocisto. Los individuos resultantes
portarán el gen sólo en un porcentaje de sus células.
A lo largo de los años, se han ido descubriendo nuevas técnicas para el
desarrollo de este proceso ya que posee múltiples utilidades y aplicaciones en
numerosos campos. Una de las aplicaciones que tiene la transgénesis en
animales es la implantación de la hormona del crecimiento para que los
animales tengan un crecimiento mayor y más rápido. Así, en el salmón, esta
técnica ha conseguido ejemplares que engordan dos veces más rápido y
comen menos que las variedades naturales, creciendo incluso en invierno,
época en la que normalmente el crecimiento se detiene. También se puede
utilizar esta terapia para conseguir fortalecer el sistema inmune de
determinados animales, haciéndolos incluso resistentes a algunas
enfermedades. Existen terneros, por ejemplo, que son resistentes a la mastitis,
a la disentería o al cólera, y estas alteraciones a veces pueden transmitirse a la
descendencia. En el campo de la medicina, también son empleados animales
transgénicos con un fin terapéutico, para avanzar en el tratamiento de
determinadas enfermedades, para generar medicamentos de forma
endógena, o incluso con el objetivo de la realización de trasplantes entre
distintas especies (xenotrasplantes). Si se aísla el gen humano causante de una
determinada enfermedad y se introduce en ratones, éstos desarrollarán la
enfermedad y, así, pueden investigarse nuevos tratamientos sin arriesgar vidas
humanas. También se emplean en bioreactores, que son animales a los que se
les introduce DNA de ciertos genes humanos capacitándolos así para producir
ciertas proteínas humanas que pueden ayudar a tratar determinadas
enfermedades. Algunos ejemplos de esta aplicación son vacas, ovejas y cabras
cuya leche puede ser usada para tratar la diabetes, el enfisema pulmonar o la
hemofilia entre otras enfermedades; el pez Tilapa, que puede producir insulina
humana para diabéticos; o cerdos que contienen hemoglobina humana en sus
glóbulos rojos. En relación a los animales empleados como bioreactores, es
importante destacar que recientemente, en febrero de 2009, la FDA (Food and
Drug Administration) ha aprobado el empleo del primer animal transgénico
(una cabra) para la producción de la proteína recombinante humana α-
antitrombina, una proteína anticoagulante. El objetivo de la producción de esta
proteína es el tratamiento de personas con una deficiencia hereditaria de α-
antitrombina, ya que estas tienen altos riesgos de sufrir trombos si son
sometidos a operaciones o durante el parto. En cuanto a los xenotrasplantes
arriba mencionados, si se realiza la implantación de genes humanos en
animales, éstos se convierten en posibles donantes de órganos, ya que portan
en su DNA un antígeno regulador del complemento humano que evita que se
dé el rechazo hiperagudo típico de los trasplantes entre distintas especies. El
cerdo, debido al tamaño de sus órganos, podría convertirse en el primer
donante transgénico. Aún con esto, la producción de animales transgénicos
para la investigación científica y con fines comerciales continúa siendo un área
muy importante de la biotecnología que tiene un gran futuro por delante.

1.1. Transgénesis
La transgénesis es un procedimiento biotecnológico por el que se
introduce un gen foráneo (transgén) en el genoma de un ser vivo. En
la transgénesis se busca que el transgén se integre en la línea germinal
(gametos) de una manera estable, asegurando así que ese nuevo gen
incorporado pueda ser heredado por la descendencia. En los animales
superiores, la información genética se transmite por reproducción
sexual (transmisión genética vertical). En 1981, Gordon y Ruddle
demostraron la integración y transmisión estables (a través de la línea
germinal) de genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón
obtenidos por fecundación “in vitro”. Eran los primeros ratones
transgénicos. Es decir, se trataba de una transmisión genética
horizontal, que se denominó transgénesis. El paso siguiente consistió
en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que
incorporaran en su
genoma un gen
(transgén) de otra especie.
Así, en 1982, Palmiter y
col. obtuvieron ratones
transgénicos gigantes al
inyectar en el pronúcleo
de un cigoto de ratón el
gen de la rata que codifica
la hormona del
crecimiento. Incluso, estos
mismos investigadores,
obtuvieron también
ratones transgénicos
gigantes cuando el
 transgén introducido, que codificaba la hormona del crecimiento, era
de origen humano. Los ratones fueron los primeros animales en los que
se consiguió la transgénesis. A los experimentos con ratones, siguieron
los mismos procedimientos con conejos, ovejas y cerdos, en un intento
de aumentar su tamaño (Hammer y col., 1985).

1.2. Producción de Animales Transgénicos

De las técnicas utilizadas para la producción de animales transgénicos,
es decir, para introducir el transgén en el genoma, destacan las
siguientes:
i. Microinyección pronuclear de transgenes en pronúcleos de
óvulos fertilizados (cigotos).
ii. Vectores virales, que transfectan las células integrando en ellas
su genoma previamente modificado (virus recombinantes).
iii. Transferencia de DNA exógeno mediada por esperma durante
la fertilización (SMGT, “spermmediated gene transfer”).
iv. Inyección, en la cavidad de blastocistos, de células madre
embrionarias (ES “cells”, “embrionic stem cells”) y/o células
germinales embrionarias (EG, embrionic germ cells”),
previamente modificadas genéticamente mediante la técnica de
“gene targeting”.
v. Transferencia nuclear (NT, “nuclear transfer”) con células
somáticas, ES o EG que previamente han sido modificadas
genéticamente.

También se puede facilitar la entrada del transgén en las células

mediante otras técnicas como el uso de liposomas y de la
electroporación. Además, en la actualidad, están en desarrollo
nuevas técnicas para generar transgénesis, como el uso de
transposomas (secuencias de DNA capaces de autoreplicarse e
integrarse aleatoriamente en sitios adicionales del genoma) y la
tecnología del RNA interferente (RNAs de doble cadena que inhiben
genes endógenos).

1.2.1. Microinyección Pronuclear

En esta técnica, la introducción del
transgén se realiza mediante la
microinyección de esta construcción
de DNA en el pronúcleo de un
ovocito fertilizado. El procedimiento
sería el siguiente:
 i. Se extraen óvulos de hembras en las que se ha inducido una
superovulación y han sido fertilizadas “in vivo”, o bien se
fertilizan posteriormente “in vitro”.
ii. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se
inmoviliza el óvulo fecundado y se inyecta en uno de sus
pronúcleos una solución que contiene muchas copias del
transgén.
iii. Posteriormente, estos óvulos fecundados y microinyectados
se introducen en madres receptoras, previamente
sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la
técnica de la transferencia de embriones.
iv. Finalmente, los recién nacidos son examinados para ver si en
ellos se ha producido la incorporación del transgén.

La microinyección es un método para generar animales

transgénicos muy ineficiente, debido a que conlleva la integración
aleatoria del gen foráneo en el genoma receptor con las siguientes
consecuencias:

- El transgén se introduce en el genoma receptor de forma

aleatoria, por lo que sólo en un pequeño porcentaje se sitúa en
el lugar adecuado para conseguir una buena expresión en el
animal transgénico.
- No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma
el transgén (no son transgénicos, por tanto).
- El gen exógeno puede insertarse en un lugar erró- neo, por
ejemplo en medio de un gen del genoma receptor,
interrumpiéndolo y causando su mutación y, con ello, la muerte
del embrión o alteraciones en el animal transgénico nacido.
- Se produce un patrón variable de expresión del gen exógeno
en la progenie transgénica, a menudo en mosaico.
- En ocasiones, el transgén microinyectado no es heredable
porque no se inserta en la línea germinal del animal
transgénico.
- No se pueden encontrar dos animales transgénicos fundadores
con el transgén insertado en el mismo lugar, por lo cual, para
conseguir animales homocigóticos para este gen exógeno sólo
pueden ser fabricados mediante el cruce de los nacidos de un
único animal fundador (en el caso de la vaca, la producción de
 una línea homocigótica a partir de un único fundador requiere
alrededor de 5 años).

La microinyección de DNA en cigotos es una de las técnicas más

extendidas en la generación de ratones transgénicos. Sin embargo,
esta técnica tiene un éxito limitado en mamíferos superiores,
debido a problemas específicos inherentes y a su baja eficacia. Así,
para producir un único animal fundador, son necesarios cerca de
1000 cigotos en el caso de los bóvidos, 300 cigotos en el de los
óvidos y 200 en el de las cabras. Por ello, el coste de producción
de animales de granja mediante microinyección pronuclear de
DNA es altísimo y, en la práctica, inabordable.

1.2.2. Vectores Virales

Un método alternativo es la transgénesis viral: el uso de virus
recombinantes para introducir genes en el embrión. Los vectores
retrovirales han sido estudiados extensamente para terapia génica
humana. Estos vectores han demostrado transferir eficientemente
genes en embriones murinos, bovinos y porcinos. Sin embargo, los
retrovirus están sometidos a modificación epigenética y la expresión
retroviral se corta durante la embriogénesis o es breve después del
nacimiento. Se ha conseguido una mejora sustancial con el uso de
vectores derivados de lentivirus, que proceden de una familia de
retrovirus complejos. Estos vectores tienen la capacidad de
atravesar la membrana nuclear y alcanzar el genoma de las células,
cualquiera que sea la fase del ciclo celular en la que se encuentren,
incluyendo células quiescentes y embrionarias, y cualquiera que sea
el tipo celular. Los vectores lentivirales han demostrado que
transducen células madre embrionarias humanas y embriones de
ratón y rata pre-implantación. En el caso de los cerdos, se ha
conseguido la expresión ubicua de los genes portados por vectores
lentivirales en los distintos tejidos del animal y con una correlación
lineal entre la expresión del transgén y el número de provirus que
se ha integrado en el genoma. En animales de granja, la eficiencia
de la transgénesis con vectores lentivirales es 50 veces superior a la
que se consigue con la microinyección pronuclear de DNA. Su mayor
limitación es que no pueden transportar transgenes con más de 8-
9 kb de DNA y, además, los sitios en los que se produce su
integración de forma preferente son regiones codificantes de los
genes de las células que infectan. El procedimiento podría ser así:
 embriones pre-implantación son expuestos “in vitro” a soluciones
concentradas de virus recombinantes (virus a los que previamente
se les ha introducido el gen de interés), o son incubados sobre una
monocapa de células infectadas con estos virus. A continuación de
la exposición a los virus, los embriones infectados “in vitro” son
transferidos a hembras receptoras para completar la gestación.

1.2.3. Transferencia De Genes Mediada Por Esperma (SMGT)

Hoy en día, los métodos más extendidos para la producción de
animales de granja transgénicos son: la inyección directa de DNA
en uno de los pronúcleos de ovocitos fertilizados; las construcciones
basadas en virus (sobre todo retrovirus) como vectores para la
introducción de DNA exógeno en embriones; y la transferencia
nuclear (descrita más adelante) utilizando células somáticas o
embrionarias modificadas genéticamente. Todos estos métodos
están afectados por una baja eficiencia, un elevado manejo y la
necesidad de la manipulación de embriones en estadios tempranos
del desarrollo. Además, el uso de retrovirus presenta dudas en
cuanto a su seguridad. En 1989, se describió por primera vez un
nuevo método para la generación de animales transgénicos: la
transferencia de genes mediada por esperma (SMGT), que se basa
en la capacidad intrínseca de los espermatozoides de unirse e
internalizar DNA exógeno que, posteriormente, podrá ser
transferido al huevo durante la fertilización. Esta habilidad de los
espermatozoides por capturar DNA exógeno fue descubierta en
1971 (Brackett, 1971), pero el hallazgo, con sus importantes
implicaciones, fue ignorado durante cerca de 20 años. El primer
procedimiento de SMGT se realizó en un modelo de animal
pequeño, el ratón, y demostró ser muy eficiente. Posteriormente,
esta técnica se adaptó a grandes animales, siendo exitosa en la
generación de diversas líneas de cerdos transgénicos. Se considera
que la SMGT puede ser utilizada en todas las especies animales con
reproducción sexual mediada por gametos, siendo una técnica de
aplicación potencialmente universal. En síntesis, la aplicación de la
SMGT consiste en:
- Obtención del eyaculado a partir de animales previamente
seleccionados.
- Conversión de los espermatozoides del eyaculado en células
transgénicas mediante la incubación conjunta del esperma con
el plásmido que contiene el DNA de interés. En este proceso se
suceden las siguientes etapas:
i. la unión del DNA exógeno a la superficie del
espermatozoide.
ii. seguida de la internalización de este DNA en el
espermatozoide.
iii. posteriormente, la integración del transgén en el
genoma del espermatozoide (hecho que se ha
demostrado que no ocurre al azar, sino en lugares
concretos del genoma).
- Inseminación artificial, con el esperma transgénico, de hembras
previamente sincronizadas (en cerdos) o inyección
intracitoplasmática de esperma (ICSI, “intracytoplasmic sperm
injection”) transgénico en ovocitos para generar embriones que
 posteriormente sean transferidos a hembras sincronizadas para
gestarlos (en ratones).
- Obtención de las camadas, seguida del estudio de la eficiencia
de la transgénesis en ellas, seleccionando los animales
transgénicos fundadores que serán capaces de transmitir el
transgén a las sucesivas generaciones.

1.2.4. “Gene Targeting”

La mayoría de las técnicas utilizadas para la introducción de DNA
exógeno en células producen una integración aleatoria en el
genoma celular del DNA introducido, con los consiguientes
inconvenientes que se han descrito. La técnica de “gene targeting”
evita esos problemas, al generar una modificación genética dirigida,
específica y controlada, basada en la introducción o en la
eliminación de DNA en lugares precisos del genoma, utilizando la
recombinación homóloga de esas secuencias de DNA foráneas con
los genes autóctonos. Esta técnica requiere la utilización de células
madre embrionarias (ES “cells”, “embrionic stem cells”), que son
pluripotentes y que, una vez modificadas genéticamente, son
inyectadas en blastocistos para generar embriones quimera. En este
punto, antes de seguir con el “gene targeting”, conviene aclarar
algunos aspectos sobre el origen de las células ES:
- El cigoto y los estadios de división celulares tempranos, hasta el
estadio de mórula, son definidos como totipotentes, porque
pueden generar un organismo completo.
- En el estadio de blastocisto, sólo las células de la masa celular
interna (ICM, “inner cell mass”) son pluripotentes, es decir,
mantienen la capacidad de generar las tres capas embrionarias
primarias (ectodermo, mesodermo y endodermo) así como las
células germinales primordiales (PGCs, “primordial germ cells”)
que son las células precursoras de los gametos masculinos
(espermatozoides) y femeninos (óvulos). Las células ES derivan
de la ICM del blastocisto y tienen la capacidad de diferenciarse
“in vitro” en células de todos los linajes celulares somáticos y
también en células germinales masculinas y femeninas.
- En tejidos y órganos adultos, existen células madre
multipotentes y células progenitoras para reemplazar las células
pérdidas o dañadas. En la actualidad, se desconoce en qué
medida las células madre adultas pueden transformarse en
células de otros linajes (transdiferenciarse) o qué factores
pueden aumentar su capacidad de diferenciación. La tecnología
de “gene targeting” necesita el establecimiento del cultivo de
células ES. Estas células tienen, por una parte, la capacidad de
autorenovarse en cultivo manteniendo su pluripotencialidad y,
por otra, la capacidad de diferenciarse en todas las células
somáticas y germinales (gametos).

Por ello, las modificaciones genéticas introducidas en células ES

generan individuos con gametos que llevan la modificación
genética y que, por tanto, pueden generar descendencia que porte
esa modificación. Una importante limitación para el uso de esta
técnica es que estas células ES no se han conseguido cultivar, hasta
el momento, en animales de producción. Por ello, el “gene
targeting” casi sólo se realiza de forma exclusiva en ratón, especie
para la que sí existen líneas de células madre embrionarias
establecidas. La técnica de “gene targeting” tiene las siguientes
fases:
 i. Obtención de embriones de ratón en fase de blastocistos.
ii. Aislamiento de células ES de los blastocistos.
iii. Cultivo “in vitro” de las células ES.
iv. Introducción de la modificación genética, mediante “gene
targeting”, en las células ES en cultivo.
v. Selección de clones individuales de las células ES.
vi. Screening de DNA genómico de los clones de células ES,
para comprobar cuál ha conseguido introducir la
modificación genética en el sitio deseado, así como análisis
del cariotipo y de la presencia de micoplasmas.
vii. Generación de los embriones quimera: se inyectan las
células ES, que portan la modificación genética deseada, en
la cavidad de un blastocisto.

viii.
Transferencia de estos blastocistos resultantes, con ES
modificadas y ES originales, a hembras sincronizadas para
gestarlos.
 ix. Estudio de las quimeras generadas (animales con dos tipos
de células: algunas con la modificación genética, porque
proceden de las microinyectadas en los blastocistos, y otras
no).
x. Realización de cruces entre machos y hembras
heterocigotos para el gen modificado, con el fin de obtener
homocigosis en dicho gen.

Los tipos de modificaciones genéticas que se pueden obtener

por “gene targeting” son:

- “Knockouts” o inactivación génica. Si se bloquea la expresión de

un gen concreto (eliminando un fragmento del mismo o
introduciendo una mutación en su secuencia que impida su
traducción), estamos produciendo una inactivación génica y
generando un animal knockout. Este animal permite estudiar
qué ocurre cuando se elimina un gen concreto y, así, conocer
su función.
- “Knockins”: si se introduce una mutación en un gen o se
sustituye un gen por otro. En ocasiones, la modificación
genética que introducimos puede causar la letalidad del
embrión. Para evitarlo, se puede controlar la expresión de la
modificación genética introducida en lugar y tiempo.
- “Knockouts” o “knockins” específicos de tejido. En ellos la
modificación sólo se expresa en los tejidos que nos interesa,
utilizando promotores específicos de tejido (por ejemplo que el
gen se exprese en hígado y no en adipocitos).
- “Knockouts” o “knockins” condicionales o inducibles. En ellos
controlamos el momento de la expresión de la modificación
genética. Por ejemplo, una vez que el animal ya haya nacido
(con lo que evitamos la posible muerte embrionaria por la
modificación introducida).

1.2.5. Transferencia Nuclear

En la transferencia nuclear (NT) se utiliza el núcleo de una célula
procedente del animal que queremos clonar para introducirlo en
un ovocito receptor previamente enucleado. Este ovocito se activa
eléctricamente, o por otros métodos, para que reprograme al
núcleo y éste comience la generación de un embrión que tendrá un
98-99% de la información genética procedente del núcleo del
animal a clonar y un 1-2% procedente del DNA contenido en las
mitocondrias y otras organelas presentes en el citoplasma del óvulo
receptor. Consecuentemente, el organismo resultante no será un
clon exacto del animal donante del núcleo. Durante el desarrollo, el
contenido genético de cada célula se mantiene, con unas pocas
excepciones, idéntico al que tenía el cigoto. Por lo tanto, las células
diferenciadas (adultas) poseen en su núcleo toda la información
necesaria para generar un organismo completo. Esto es lo que se
conoce como totipotencia nuclear. En sus inicios, la transferencia
nuclear (NT) se desarrolló como un medio de comprobar, de forma
experimental, este concepto de totipotencia, mediante la clonación
de animales a partir de células adultas. Los núcleos de estas células
adultas se reprograman con la información que hay en el
citoplasma del ovocito, de manera que se silencian algunos genes
y comienzan a funcionar otros, produciéndose la parada de la fase
adulta para encenderse la embrionaria. Esta reprogramación
permite que las células donantes de los núcleos para la NT puedan
ser fetales, embrionarias o somáticas (tabla 1). Como es posible
obtener un número ilimitado de células somáticas a partir de un
animal, la clonación constituye una tecnología que puede ser
utilizada para la producción de un gran número de animales
genéticamente idénticos entre sí (clonación reproductiva), aunque
difieran en algo de su progenitor donante del núcleo. Muchos
animales de granja, tales como vacas, cerdos y ovejas, han sido
clonados de forma satisfactoria utilizando esta técnica. La oveja
Dolly, en 1996, fue el primer animal clonado a partir de una célula
somática adulta (célula de la glándula mamaria de una oveja de 6
años, Wilmut y col., 1997, figura 8). Las líneas celulares obtenidas a
partir de células somáticas permiten la manipulación de los
genomas de los animales de granja “in vitro”, lo cual permite crear
células transgénicas de ovejas, cerdos y vacas cuyos núcleos,
posteriormente, pueden ser transferidos a un ovocito enucleado
para generar un animal transgénico mediante transferencia nuclear:
clonación a partir de una célula transgénica. Polly es la primera
oveja transgénica producida por transferencia nuclear (Schnieke y
col. 1997). Fue generada a partir de fibroblastos fetales que fueron
previamente modificados genéticamente mediante la adición del
gen humano que codifica el factor IX de coagulación, introducido
en un vector que portaba un promotor que dirigía la expresión a la
glándula mamaria. Polly excretaba el factor IX de coagulación
humano en su leche. Por otra parte, si un embrión obtenido por NT
 de células somáticas se detiene en fase de blastocisto y de él se
obtienen células ES, éstas pueden cultivarse “in vitro” para diferentes
usos potenciales (clonación terapéutica): terapias de reemplazo y
regeneración celular; investigación médica; e, incluso, se puede
realizar la modificación genética de estas células ES para corregir
un defecto genético del individuo donante.

1.3. Principales aplicaciones de la transgénesis en animales

1.3.1. Desarrollo de modelos animales para el estudio de enfermedades
humanas.
El genoma humano, secuenciado en 2004, tiene entre 20.000 y
25.000 genes responsables de la formación y del mantenimiento del
cuerpo humano. Gran parte de las enfermedades humanas tienen
una base hereditaria y están causadas por mutaciones de genes.
Por otra parte, existe una gran concordancia entre el genoma de
las diferentes especies de mamíferos por lo que, los modelos
animales transgénicos, son de gran ayuda para comprender el
papel de los genes en el desarrollo de una enfermedad o para
reproducir enfermedades humanas en animales, con el fin de
investigar nuevos tratamientos. Existen modelos transgénicos
animales para el estudio de una amplia variedad de enfermedades
humanas. Las características de un modelo animal ideal son:
- Facilidad de cría en cautividad.
- Tiempos de reproducción cortos.
- Descendencia numerosa.
- Disponibilidad de métodos de manipulación genética y
experimental.
- Elevado número de genes conservados respecto al ser humano.
La aplicación de la tecnología transgénica ha sido particularmente
útil para el examen de la importancia de la expresión de
determinados genes en la etiopatogenia de gran número de
enfermedades. Con frecuencia aparecen en los medios de
comunicación noticias que recogen nuevos descubrimientos en los
que están implicados animales transgénicos, es bien conocido que
el desarrollo de modelos animales ha sido básico para el avance en
el conocimiento de los oncogenes y los virus oncogénicos, pero
hay otros muchos ejemplos de avances científicos en los que los
ratones transgénicos son también herramientas importantes. Para
algunas enfermedades, los ratones Knockout son modelos
adecuados, pero los ratones y los humanos difieren
significativamente en su anatomía, fisiología y modo de vida por lo
que el uso del ratón como modelo genético ha demostrado
algunas limitaciones con respecto al estudio de numerosos
caracteres humanos. Los animales de granja, tales como cerdos,
ovejas y ganado vacuno, podrían ser modelos más apropiados para
evitar algunos problemas, como por ejemplo el requerimiento de
periodos de observación más largos en el estudio de muchas
enfermedades humanas. Se han usado cerdos transgénicos como
modelo experimental en estudio de la retinitis pigmentosa.
También se ha estudiado en modelos porcinos la alteración del
factor de liberación de la hormona del crecimiento, que se observa
en pacientes con síndrome de Turner, enfermedad de Crohn,
insuficiencia renal y retraso de crecimiento intrauterino. Una
diversidad de enfermedades neurodegenerativas, como el
síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob o el insomnio familiar fatal, debidas a una
 alteración en la proteína prión celular (PrPc), han sido estudiadas
en modelos transgénicos de ratón y ganado vacuno, creando
incluso animales resistentes a estas patologías. También se han
utilizado ratones transgénicos, conejos, ovejas y cerdos como
modelos para examinar el crecimiento postnatal de los mamíferos.
Se han incorporado en los animales los genes que expresan la
Hormona del Crecimiento (GH) y los factores de crecimiento
análogos a la insulina. Esto ha permitido el estudio de la expresión
crónica de estas hormonas, independientemente de la regulación
normal. Los resultados han demostrado que el aumento de GH
conlleva la mejora de las tasas de crecimiento y la eficiencia
alimentaria en ganadería, si bien, todavía se acompaña de efectos
secundarios indeseables como el aumento de la incidencia de
artritis y el engrosamiento de los huesos. Son innumerables las
líneas de investigación que utilizan animales transgénicos como
modelos con resultados iniciales prometedores. El estudio del
envejecimiento, la ateroesclerosis, la diabetes, el Síndrome de
Parkinson o las enfermedades cardiovasculares, son algunos
ejemplos de campos en los que la investigación con estos reactivos
biológicos puede dar réditos en los próximos años.

1.3.2. Animales transgénicos como biorreactores

Una importante aplicación de los transgénicos es la producción de
proteínas terapéuticas para uso clínico en humanos. A través de la
ingeniería genética se pueden producir proteínas de animales,
plantas o microorganismos en la leche de los mamíferos. Por
ejemplo, es posible expresar proteínas de alto valor farmacéutico
en la leche de ratones, conejos, cerdos, cabras y ovejas. Una de las
ventajas de la síntesis de proteínas en la glándula mamaria es la
capacidad que tienen sus células secretoras de modificar
correctamente las proteínas para que sean biológicamente activas
y, a continuación, secretarlas en grandes cantidades a través de la
leche. También se pueden producir proteínas terapéuticas en los
huevos de las gallinas, si bien en cantidades más pequeñas. Se
puede orientar la fracción de albúmina mediante construcciones
transgénicas y obtener la consiguiente cosecha de proteínas que
estarán presentes en la clara del huevo. El huevo tiene la ventaja
sobre la leche de que los gastos de alojamiento y mantenimiento
de los animales son menores, si bien la producción de proteínas es
mucho menor. Los genes que codifican determinadas proteínas con
valor farmacéutico, como el Factor de Coagulación IX, para el que
los hemofílicos son genéticamente deficientes, pueden ser
incorporados en la carga genética de ovejas, cabras o vacas
transgénicas para que lo segreguen en su leche pudiendo
posteriormente recuperarlo, purificarlo y administrarlo a los
hemofílicos como terapia. Algunos otros ejemplos importantes son
la 𝛼1 antitripsina para el tratamiento del enfisema; la proteína C para
limitar la formación del coágulo; la albúmina sérica humana para los
productos sustitutivos artificiales de sangre, y los antígenos de
hepatitis para la producción de vacunas. Debido a su alto coste, la
producción de animales transgénicos, tales como cerdos, cabras,
ovejas y ganado vacuno, debe proporcionar un elevado beneficio
para que la inversión sea económicamente rentable. Por esta razón,
la producción de sustancias de alto valor para la industria
farmacéutica es, en la actualidad, la principal y la más prometedora
aplicación para la transgénesis animal. A pesar de los bajos costes
de producción de biomoléculas en microorganismos, como
bacterias y levaduras, estos organismos no ejecutan de forma
correcta muchas de las modificaciones post-traduccionales que
requieren las proteínas, o no permiten el adecuado plegamiento de
las mismas, por lo que no se obtienen proteínas humanas
completamente funcionales. Muchos polipéptidos humanos
pueden producirse en cultivos de células de mamíferos que sí
permiten recuperarlos con su funcionalidad completa; pero, estos
sistemas de cultivos celulares in vitro, debido a su baja capacidad
productiva, generan biomoléculas extremadamente caras. Por todo
esto, muchas compañías biotecnológicas se han orientado a la
producción de altas concentraciones de biomoléculas de interés
farmacéutico utilizando los animales transgénicos como
biorreactores. La biotecnología ha aplicado estas técnicas
experimentales de modificación genética y se han creado “granjas
farmacéuticas” o “granjas moleculares” en las que se crían ovejas,
cabras, vacas, y cerdos que producen proteínas de uso
farmacéutico en una variedad de fluidos biológicos tales como
leche, orina, saliva, sangre y fluido seminal, dirigiendo su expresión
mediante promotores específicos de tejido. De esta manera se
podrían llegar a producir grandes cantidades de proteínas
utilizando como vehículos los fluidos corporales de las especies
domésticas de ganado, incluidos los caballos y las aves de corral.
Por ejemplo, para la producción de una proteína humana en leche,
se introduce en el genoma del animal la porción de DNA humano
que codifica ese producto en particular, unido a un elemento
regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la
síntesis de proteínas de la leche (lactoglobulina, caseína, etc.). Con
este regulador específico de tejido mamario, que se ha asociado al
gen humano, el animal transgénico no se ve perjudicado en su
desarrollo, porque el gen humano sólo se expresará en las células
de las glándulas mamarias del animal transgénico (no
sintetizándose, por tanto, la proteína humana en el resto de tejidos
del animal, ya que en éstos el gen humano queda silenciado). La
glándula mamaria del ganado vacuno lechero es una excelente
fábrica de producción de proteínas. A través de ella, se pueden
generar grandes cantidades de polipéptidos de alta complejidad
(llegan a expresar más de 2 g de proteínas recombinantes
heterólogas por litro) que es posible recuperar de la leche a muy
bajo coste. Algunas proteínas humanas que se han expresado en la
leche de ganado transgénico, son: lactoferrina como bactericida
(vacuno); 𝛼-antitripsina para enfisema y cirrosis (ovejas); factor VIII
de coagulación para la hemofilia-a y factor IX para la hemofilia-b
(ovejas); antitrombina III para trombosis y embolismos pulmonares
(cabras); calcitonina, para osteoporosis e hipercalcemia (conejos).
También se producen anticuerpos humanos generando vacas
transgénicas con genes de anticuerpos humanos, a las que se les
ha bloqueado, a su vez, sus propios genes productores de
anticuerpos. Estas vacas, una vez inmunizadas con una vacuna que
contiene el agente infeccioso de interés, generan anticuerpos
humanos frente a dicho agente, que son recolectados mediante la
recuperación del plasma de la vaca y su tratamiento posterior para
eliminar los componentes contaminantes de origen bovino. El
producto resultante, se inyecta a pacientes para combatir la
infección frente a ese agente infeccioso.
1.3.3. Animales transgénicos para xenotrasplantes
Desde que el Doctor Barnard hiciera su primer trasplante de
corazón, la técnica del trasplante de órganos se ha generalizado en
la práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de
perfección. Sin embargo, uno de los retos pendientes es el de la
desproporción entre la oferta y la demanda: Desgraciadamente,
muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante
deseado. Por ello, la posibilidad de recurrir a especies animales
como donantes de órganos se planteó hace ya muchos años. De
hecho, entre los años 1964 y 1995, se realizaron 32 xenotrasplantes
de riñón, corazón, hígado y médula ósea procedentes
mayoritariamente de chimpancé y mandril, con un resultado
negativo en todos los casos. La utilización de órganos procedentes
de mono tenía la lógica de su proximidad evolutiva con la especie
humana, pero la diferencia de tamaños de los órganos entre las
especies suponía un serio inconveniente. Actualmente, diversos
estudios han demostrado que el cerdo es el animal considerado la
mejor elección como donante de órganos para los humanos. Esta
afirmación se basa en que:
a. sus órganos son similares en tamaño, anatomía y fisiología a
los órganos humanos;
b. los cerdos crecen rápidamente y son una especie prolífica;
c. el mantenimiento de altos estándares higiénicos es posible
a un coste relativamente bajo;
d. se han establecido técnicas de transgénesis para modificar
la inmunogenicidad de las células y los órganos porcinos y
evitar así el rechazo de su trasplante a humanos.
 Las causas principales que origina la existencia de obstáculos
inmunológicos en los xenotrasplantes incluyen:

- la respuesta de rechazo hiperagudo, que ocurre en segundos

o en minutos tras el trasplante;
- el rechazo vascular agudo, que ocurre en días;
- y el rechazo celular, potencialmente crónico, que ocurre
semanas tras el trasplante.

Se han desarrollado numerosas aproximaciones transgénicas

para superar la respuesta inmunológica que activa la cascada
del complemento, que se desencadena por la acción del
complejo antígeno-anticuerpo y es la responsable de la
inducción de las respuestas de rechazo hiperagudo y de
rechazo vascular agudo. Entre ellas están la producción de
cerdos transgénicos que expresan proteínas humanas que
inhiben la cascada del complemento y la creación de cerdos
Knockout para las estructuras antigénicas de superficie celular
de los órganos porcinos que desencadenan el rechazo. Sin
embargo, el punto crítico para la aplicación de los
xenotrasplantes es el peligro de transmisión de zoonosis a
través de los órganos trasplantados. Además, en los últimos
años, el progreso acelerado que se ha producido en la
investigación con células madre humanas, como medio de
producir tejidos y órganos humanos para trasplantes, ha
reducido de una manera significativa el esfuerzo destinado a la
investigación en xenotrasplantes. Una aplicación excepcional de
la ingeniería genética en ganadería, y en particular de la
tecnología transgénica, es la producción de células, tejidos u
órganos que contienen antígenos o proteínas humanas que les
confieren biocompatibilidad y, por tanto, les hacen aptos para
utilizarlos en xenotrasplantes y en otros usos biomédicos.
1.3.4. Animales transgénicos como productores de leche modificada
Otro claro ejemplo de los alcances de la transgénesis es la
modificación de algunos constituyentes de la leche. Un gran
porcentaje de la población mundial, especialmente la de origen
asiático, presenta algún grado de déficit en la actividad de la enzima
lactasa (encargada de la degradación del principal azúcar de la
leche: la lactosa). En el mercado existen fórmulas comerciales de
leche deslactosada, pero actualmente se trabaja en el desarrollo de
animales transgénicos que lleven una copia del gen que codifica
para la enzima lactasa, de forma tal de obtener, directamente del
animal, una leche libre de lactosa apta para el consumo humano.
También se trabaja en el desarrollo de animales genoprivos
(knockout) para el gen de la lactoglobulina, para obtener leche
destinada a consumidores alérgicos. Por otra parte, se ha logrado
producir lactoferrina humana en la leche de vacas transgénicas. La
lactoferrina humana no sólo tiene propiedades antibacterianas,
antifúngicas y antivirales, sino que también posee efectos tróficos
sobre el intestino. El propósito de producir leche vacuna con
lactoferrina humana es el de mejorar la defensa inmunológica de
los niños alimentados con leche de vaca. De esta forma, vemos
cómo la transgénesis se utiliza para lograr leches para consumo
humano que puedan suplir deficiencias enzimáticas de la población,
que sean aptas para el consumo de personas alérgicas y, también,
para mejorar la calidad de la leche vacuna para aquellos niños que
no pueden ser amamantados por sus madres.
1.3.5. Impacto medioambiental
Se han diseñado variantes
transgénicas del pez cebra
(Zebrafish) con elementos
de respuesta (RE) a
contaminantes del agua que
inducen la expresión de
luciferasa y generan luz.
Estos peces, emiten luz
únicamente cuando se
encuentran en un medio
con altos índices de
contaminación, por metales
pesados o por otros
residuos de origen
industrial.
Otro modelo de interés, por su repercusión medioambiental, es el
EnviroPig ™ (Golovan et al., 2001). Se trata de cerdos transgénicos
que expresan una fitasa bacteriana en la glándula salivar, lo que les
permite metabolizar los fitatos del pienso. Estos animales utilizan
eficientemente el fósforo de la dieta, lo que se traduce en mejores
índices de crecimiento y en purines menos contaminantes, ya que
excretan hasta un 75% menos de fosfato. Esto supone una
reducción significativa de la contaminación procedente de la
industria porcina y su impacto medioambiental.
2. TERAPIA GÉNICA
No existe aún un consenso en relación con la definición exacta de la Terapia
Génica; según Lacadena se puede definir de dos formas: La primera definición
considera que este procedimiento se basa en la administración deliberada de
material genético en un paciente con la intención de corregir un defecto
genético específico; mientras que la segunda, considera que la Terapia Génica
es una técnica terapéutica mediante la cual se inserta un gen funcional en las
células de un paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar
a las células de una nueva función. La primera definición solo enmarca los
protocolos encaminados a corregir los defectos genéticos de algunas
enfermedades monogénicas recesivas; sin embargo, no incluye una serie de
procedimientos que se sale de esta línea y que hoy en día se están realizando;
la segunda definición tiene como desventaja que enmarca la realización de
tratamientos que no son propiamente terapéuticos, pero que se presentan
enmascarados como tal. El traspaso de los límites del concepto de Terapia
Génica puede tener una gran trascendencia social. De ahí que algunos autores
opinen que la utilización amplia del concepto puede ser considerada una
forma de hacer más aceptables procedimientos de ingeniería genética
humana que de otro modo podrían contar con una mayor oposición social. En
este sentido, Soutullo considera que resulta más apropiado definir la Terapia
Génica como la modificación genética de células de un paciente para tratar
alguna enfermedad. Está claro que este concepto no elimina de forma radical
los problemas antes señalados, pero deja explícito los usos de la Terapia
Génica con fines terapéuticos y deja fuera utilidades preventivas o eugenésicas
no propiamente curativas. El mayor problema de la Terapia Génica tiene como
base la existencia de dos tipos de intervenciones sobre la base de las células
que sean blancos del procedimiento: la Terapia Génica germinal y la Terapia
Génica somática. La de tipo germinal tiene como objetivo eliminar
radicalmente las enfermedades que son producidas por defectos en algún gen
mediante la sustitución del gen dañado en el individuo y en su descendencia.
Este resultado se alcanza realizando la modificación genética de las células
embrionarias implicadas en la formación de óvulos y espermatozoides. Este
procedimiento no ha sido aplicado en humanos; pero, sin dudas, la posibilidad
de su aplicación constituye un problema de carácter científico y ético, pues
existen limitaciones en relación con la tecnología para la manipulación de este
tipo de células y además esta modificación pasaría a todas las células de la
descendencia. Por su parte, en la terapia somática se modifican las
características genéticas de las células que no son germinales; es decir, las que
pertenecen a un tejido adulto por lo que las consecuencias genéticas de este
procedimiento no son transmitidos a la descendencia. En la actualidad, los
protocolos clínicos de Terapia Génica que se han llevado a cabo han sido de
terapia somática, la terapia germinal no está autorizada en ningún país.
Aunque, en teoría, la terapia génica podría aplicarse también a las células
germinales, las evidencias apuntan hacia la aplicación de la Terapia Génica
somática durante algunos años. Sin embargo, no cabe duda de que con el
progreso de la terapia somática se obtendrá un dominio más amplio de la
misma y esto puede contribuir al desarrollo de la terapia germinal. Para llevar
a cabo la Terapia Génica somática es necesario introducir los productos
génicos en el tejido diana y existen dos formas de alcanzar este objetivo:
i. la Terapia Génica ex vivo, mediante la cual se usan células modificadas
genéticamente in vitro con el sistema de expresión deseado, que
portan la información genética deseada y luego se implantan en el
organismo receptor y
ii. la Terapia Génica in vivo, que se lleva a cabo por el tratamiento directo
de las células hospederas in situ con vectores, ya sean virales o no
virales, que expresan el o los genes de interés terapéutico.

Ambos tipos de terapia, in vivo y ex vivo, usan vectores, virales o no virales,

que expresan el gen o los genes de interés terapéutico. Los vectores no virales
incluyen liposomas, ADN desnudo y complejos ADN-proteínas, mientras los
vectores virales derivan de virus que se atenúan con el objetivo de prevenir la
infección destructiva en los tejidos diana. Los vectores no virales, aunque se
prefieren desde el punto de vista de la bioseguridad, son menos eficientes que
los virales. La principal inconveniencia que se deriva del uso de vectores virales
incluye la seguridad de su utilización, pues se conoce que estos vectores
pueden causar inflamación y toxicidad en el tejido hospedero. Muchos son los
vectores virales que han sido objeto de estudio en el campo de la Terapia
Génica, dentro de ellos los más ampliamente usados para lograr la liberación
del transgén de interés han sido los adenovirales, los adenoasociados, los
herpes virus, los retrovirus y los lentivirus. Cada uno de ellos tiene sus ventajas
y desventajas, y aunque no existe aún un consenso en relación con cuál es el
idóneo para su uso en la Terapia Génica, muchos autores concuerdan en que
los vectores adenoasociados y lentivirales son los más convenientes. Una de las
características importantes que se deben de considerar al escoger el tipo de
vector viral es la posibilidad de integrarse al genoma hospedero y, en este
caso, la selección depende de los objetivos que se quieran alcanzar con este
procedimiento. Por ejemplo, cuando se utilizan células como vehículo de
liberación de genes que tienen la potencialidad de dividirse, tanto in vitro como
in vivo, resulta beneficioso el uso de vectores virales que se integren al genoma
y con esta característica se logra además una expresión más duradera del gen
de interés en el tejido hospedero. Este tipo de vector también es elegible en el
caso de que se quieran tratar células cancerosas con genes, cuyos productos
proteicos detengan el crecimiento de las células afectadas. Si por el contrario,
el objetivo está dirigido a realizar una Terapia Génica in vivo en el tejido
cerebral, constituido de manera predominante por células en no división,
pueden utilizarse vectores virales que permanezcan de forma episomal.

2.1. SECUENCIAS DE ADN

Desde hace más de quince años, las secuencias de los genes que se
obtenían a través de técnicas manuales con el consiguiente esfuerzo
económico y técnico se han ido gradualmente almacenando en unas
bases de datos informáticos internacionales accesibles a los
investigadores. La identificación de un gen en la mosca de la fruta o en
cualquier otro organismo, suscitaba la búsqueda de ese mismo gen en
el ser humano, y esto era posible dado los altos niveles de conservación
entre las especies, en otras palabras, la secuencia del gen era muy
parecida entre ambas especies. Casi inevitablemente, estas búsquedas
de secuencias de ADN análogas entre por ejemplo, la Drosophila y el
ser humano, resultaba en la identificación de genes equivalentes o
similares. El resultado era todavía más seguro si se partía de una
secuencia de DNA de una especie más cercana al hombre, por ejemplo,
el ratón. Poniendo en evidencia lo que ya se ha dicho antes, que los
enzimas o proteínas involucrados en las funciones básicas y vitales de
una célula son compartidos por todas las especies, y de ahí que las
secuencias de los genes que codifican estas proteínas sean tan
parecidas. Con la ejecución de los grandes programas de secuenciación
automatizada de genomas, como el proyecto genoma humano
completado en 2000, la velocidad de identificación de secuencias
funcionales o genes se ha disparado, y con ello la posibilidad de su
utilización en beneficio la salud.

2.2. EL GENOMA Y LA IDENTIFICACIÓN ESTRUCTURAL Y

FUNCIONAL DE UN GEN
El genoma está compuesto por una larga molécula lineal de ADN,
formada por cuatro bases nitrogenadas o nucleótidos A, T, C, G
(adenina, timina, citosina, guanina) unidas por un grupo fosfato. Esta
larga sucesión de cuatro bases sobre un “hilo” de fosfatos se
empaqueta enrollándose sobre sí misma como un ovillo para generar
los cromosomas, visibles microscópicamente en el núcleo de una célula
en división. Los genes se distribuyen a lo largo del genoma de forma
aparentemente indistinguible de las secuencias que los limitan. Algo
parecido a la identificación de una palabra en una “sopa de letras”
lineal. En el caso del pasatiempo la identificación es posible porque
conocemos el lenguaje, en el caso genético, todavía falta acabar de
establecer las reglas “sintácticas” del código o lenguaje. La estructura
del gen se compone de varias zonas. El gen per se, es la secuencia de
DNA que codifica la proteína (exón) y se ve interrumpida por secuencias
no codificantes (intrón) que no contienen información sobre la proteína
y sirven de “espaciadores”. Además, antes del gen existe una secuencia,
específica para cada gen, que se llama región promotora o promotor.
Esta secuencia regula la expresión del gen que le precede. Es decir,
controla que la fabricación de la proteína que codifica ese gen se haga
en la célula que la necesite y en el momento que la necesite. De ahí,
que la identificación estructural de un gen no sea siempre evidente y
se deban buscar motivos específicos de la secuencia para delimitar el
inicio de la transcripción y las fronteras entre exones e intrones. La
identificación funcional de un gen tampoco es fácil. Muchas veces se
ha identificado la secuencia (o estructura) de un gen, pero se
desconoce la función o el papel fisiológico que juega la proteína que
de él se fabrica. Esto es común a muchas secuencias que se han
identificado fruto del proyecto genoma humano, y cuyas funciones
biológicas se desconocen. Existen varias maneras de averiguar la
función fisiológica de un gen, y a menudo son necesarios varios
enfoques. Se puede desactivar ese gen específico del genoma de un
organismo vivo, por ejemplo un ratón, generando un ratón knockout,
y después evaluar los síntomas que el animal knockout padece. No
obstante, la mayoría de las funciones de genes involucrados en
enfermedades genéticas hereditarias se han descubierto al comparar
fragmentos del genoma de individuos afectos por la enfermedad y de
individuos sanos, y su función se ha inferido por el defecto fisiológico
que los enfermos padecen. Sea como fuere, la identificación de nuevos
genes siempre lleva consigo la posibilidad de su uso terapéutico. El
planteamiento de esta modalidad terapéutica es conceptualmente
sencillo. Una vez se ha identificado el gen cuya alteración provoca
enfermedad, se corrige la alteración por inserción del gen normal en
las células que contengan la versión mutada y se restablece la función
curando así la enfermedad. No obstante, la inserción de genes
terapéuticos en células conlleva problemas técnicos que todavía están
siendo investigados: se verán a continuación. Antes se expondrán los
 rudimentos sobre el funcionamiento de los genes a modo de
recordatorio para los lectores no iniciados.

2.3. TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA Y TERAPIA GÉNICA GERMINAL

La terapia génica hace referencia a
dos tipos de enfoques
conceptualmente diferentes. Todos
los ensayos clínicos de terapias
génicas llevados a cabo en
humanos, tienen como objetivo la
corrección de un defecto genético
en células somáticas, es decir, en las
células que no son ni
espermatozoides ni óvulos. Esto es
la terapia génica somática, donde la
corrección del defecto genético no
se transmite a los descendientes, ya
que la línea germinal del paciente
tratado no está manipulada. La
inserción de un gen terapéutico en
óvulos, espermatozoides o en un
óvulo fecundado, se conoce como
terapia génica germinal, y dado que
ésta no se ha realizado en humanos porque la legislación actual lo prohíbe,
no se tratará este tipo de terapia génica en este capítulo. La terapia génica
somática ha centrado sus actuaciones sobre enfermedades hereditarias bien
 definidas cuyo defecto genético reside en un único gen, las llamadas
enfermedades monogénicas. Estas podrían ser del tipo de las hemofilias,
fenilcetonuria, deficiencia de ADA (adenosina desaminasa), fibrosis quística,
distrofia muscular, hipercolesterolemia familiar, etc. Enfermedades
hereditarias cuyo defecto genético es fácilmente confirmable en los
portadores, y altera el funcionamiento de un tipo celular concreto y más o
menos accesible a los genes terapéuticos externos. Las enfermedades
provocadas por la alteración de más de un gen, o por la falta de coordinación
de varios genes, las llamadas poligénicas, son lógicamente más complejas de
abordar y de momento se desestima la terapia génica para su posible
tratamiento. El cáncer es una excepción, ya que aunque el cáncer engloba
más de doscientas enfermedades diferentes, todas tienen en común los
mismos mecanismos de enfermedad: la división celular incontrolada y/o la
ausencia de muerte celular programada. Ambos mecanismos son controlados
genéticamente y regulados por más de un gen. El cáncer responde a la
acumulación de errores o mutaciones durante la vida del individuo en más de
un gen de los que controlan la división y la muerte en una misma célula
somática y ésta acaba generando el tumor. Por ello, el cáncer es estrictamente
una enfermedad poligénica. No obstante, la terapia génica se ha utilizado en
ciertos modelos de tumores con el fin de activar el suicidio de las células
cancerosas. Este tipo de terapia génica se tratará más adelante. Antes de
poder evaluar los ensayos de terapia génica en humanos, es importante
entender cuáles son las dificultades técnicas de la introducción de un gen
terapéutico en una célula. Para ello se debe primero distinguir los dos tipos
básicos de la terapia génica somática. La terapia génica in vivo y la terapia
génica ex vivo.

2.4. TERAPIA GÉNICA IN VIVO Y EX VIVO

Esta clasificación de la terapia génica responde al lugar donde se
produce la manipulación genética de las células. La terapia génica in
vivo aborda la modificación genética de la célula en el interior del
organismo, o sea, la introducción del gen terapéutico en el lugar
normal de “residencia” de la célula en un organismo. Por ejemplo, la
modificación de células pulmonares o hepáticas con una versión
correcta del gen de la alfa-1 antitripsina en pacientes con enfisema
pulmonar o cirrosis fruto de esta deficiencia, o en la introducción del
gen de la distrofina en tejidos musculares en pacientes de distrofia
muscular. En el caso de la terapia génica ex vivo, la manipulación
genética ocurre fuera del organismo, en un tubo de ensayo. En este
caso, se extraen las células del paciente, se cultivan en el laboratorio, se
les introduce el gen terapéutico y se reinfunden en el paciente. Este
proceso es más fácil con células del sistema hematológico. La
 obtención de médula ósea, purificación de células madre, su
manipulación en el laboratorio, y la introducción de la célula madre con
la versión funcional de un gen de vuelta en el paciente ha servido por
ejemplo para el tratamiento de la inmunodeficiencia combinada severa
(SCID) por deficiencia de ADA. La introducción del gen ADA funcional
en las células progenitoras del sistema inmunológico han curado ya a
niños con SCID, los conocidos como niños burbuja, en unos ensayos
clínicos. Lógicamente, el método de introducción de un gen terapéutico
dependerá del tejido diana de la terapia, y del objetivo de la terapia,
pero todos los métodos de transferencia conllevan unos problemas
intrínsecos, actualmente en vías de resolución.

2.5. TRANSFERENCIA GÉNICA o GENE DELIVERY

El problema de cómo hacer llegar un gen terapéutico a una célula diana
deficitaria de esa función es el mayor obstáculo de la transferencia
génica, más conocida por la expresión inglesa gene delivery. Este
proceso es particularmente difícil en la terapia génica in vivo, ya que los
tejidos u órganos diana, o los focos tumorales ocultos, no siempre son
 accesibles. Para cualquier tipo de gene delivery se necesita un vector
de transferencia que transporte, proteja y transfiera el gen terapéutico
de forma segura y eficaz y que además le confiera la especificidad de
alcanzar únicamente a las células diana. El vector es la clave del éxito
de la terapia génica. Un virus es algo más que un grupo de genes que
se autorreplican cubiertos de una cobertura con proteínas que le dan
entrada específica a un tipo celular concreto. Por ello, tradicionalmente,
se ha aprovechado el cromosoma de virus humanos con especificidad
natural para determinados tejidos, después de haber reemplazado
algún segmento génico que le confiriera virulencia al virus, por el gen
terapéutico. Actualmente también se están desarrollando otro tipo de
vectores no basados en virus. Esto se debe al peligro que encierra el
desconocimiento que tenemos sobre la posibilidad de recombinación
de los vectores víricos con virus endémicos latentes en el ser humano,
y la posibilidad de generar nuevos virus con capacidad infecciosa
desconocida, tanto para el paciente tratado como para el resto de la
sociedad. Sobre todo con los retrovirus, cuya capacidad de inserción
en el cromosoma celular ha sido vista en los últimos años como una
gran ventaja para este tipo de terapias. Inicialmente se deseaba que el
objetivo de inserción del gen terapéutico en el cromosoma celular
fuese el lugar preciso de su versión defectuosa. Esto es muy difícil de
controlar y ahora sabemos que no es necesario, y que el gen
terapéutico se puede integrar y producir la proteína o ejercer su función
curativa desde otras localizaciones, ya sean dentro del cromosoma o
de forma extracromosomal, como es el caso de los episomas o
minicromosomas autónomos. Los principales tipos de vectores son: Los
Retrovirus, los Adenovirus, los virus asociados a los adenovirus, los
liposomas y el DNA desnudo (o naked DNA).

2.5.1. Retrovirus
Los Retrovirus introducen sus genes de forma permanente en el
cromosoma de las células que invaden. Una vez el retrovirus se ha
integrado en el cromosoma, sus genes se copian y se transfieren a
todas las células descendientes de la célula invadida. Esta
característica ha hecho de los retrovirus un candidato de mucho
interés científico y utilidad para la introducción de genes
terapéuticos en células madre o stem cells. El problema de este tipo
de virus, como ya se ha comentado, es que son altamente
promiscuos e inseguros, depositan sus genes en muchos tipos
celulares y son inútiles para la inserción de genes en células que
 raramente se dividen, como las neuronas o las células del músculo
esquelético. Además, la integración del cromosoma viral se produce
en lugares cromosómicos impredecibles, aumentando el riesgo de
que la propia integración altere lugares críticos donde residan
genes de control de la división celular, reparación del DNA o
programación de la muerte celular, pudiendo ser potencialmente
oncogénicos. La falta de especificidad de diana de los retrovirus se
ha estudiado con retrovirus quiméricos derivados de virus humanos
y virus de otras especies animales. Por ejemplo, la especificidad de
infección reside en las proteínas de la cubierta del virus, y éstas son
sustituibles en el cromosoma del virus. Así, se ha conseguido
sustituir una proteína de la cubierta del virus de la leucemia del
ratón (MLV) por la del virus de la estomatitis vesicular humana
(HVSV) y cambiar la especificidad del MLV por células humanas. En
la actualidad se están probando vectores basados en estas
quimeras víricas, sobre la base de que le MLV no produce
enfermedades conocidas en el hombre y que los niveles de
fabricación de proteína a partir de un gen terapéutico insertado en
su genoma pueden ser regulables y apropiados para su uso en
terapias. También se ha estudiado el virus de la inmunodeficiencia
humana VIH, retrovirus causante del SIDA, como un posible vector
de transferencia génica en células que no se dividen, como por
ejemplo en el cerebro, pero el peligro de que existan residuos
patogénicos del VIH u otros retrovirus está siendo evaluado con
suma cautela por la comunidad científica. El potencial infeccioso de
estos virus por mutagénesis, recombinación y replicación dentro del
organismo debe ser cuidadosamente evaluado antes de llevarlo a
la práctica como vector de terapia génica.

2.5.2. Adenovirus
El adenovirus humano presenta un modelo de vector de
transferencia de notable seguridad, con un riesgo de enfermedad
asociada a la terapia de, a lo sumo, un resfriado. Estos virus infectan
células humanas con mucha facilidad, y su potencial para su uso
como vectores de genes es muy alto debido a ello. Además el
adenovirus puede infectar células independientemente de si están
en división o no y los niveles in vivo de fabricación de proteína a
partir de un gen exógeno son muy elevados. Los adenovirus
raramente se integran en el cromosoma de las células que invaden,
aunque sí introducen sus genes en el núcleo de ésta. Esto quiere
 decir que el gen terapéutico acaba desapareciendo y con él su
función terapéutica. Por otro lado, esta aparente desventaja puede
ser utilizada para tratamientos que requieran transitoriedad, y
repercute directamente en la seguridad del tratamiento. Éste puede
ser repetido con cierta periodicidad convirtiendo a la enfermedad
en una condición crónica sintomática, y aunque se escape de lo que
es estrictamente curativo, sí puede ser una buena y segura solución
para muchas enfermedades. La mayor desventaja del uso de
adenovirus en terapia génica es que poseen una baja especificidad
celular, lo que complica la infección selectiva de células en
procedimientos in vivo, y la respuesta inmunológica que suscitan
puede llegar a ser lo suficientemente importante como para
provocar la muerte de las células infectadas por el vector. Estos son
dos de los campos en los que se está trabajando para evitar estos
problemas: la necesidad de derivar nuevos vectores basados en
adenovirus de donde se hayan desechado o alterado los genes que
provocan la respuesta inmunológica.

2.5.3. Virus Asociados a Los Adenovirus

Los virus asociados al adenovirus no producen enfermedades
conocidas en el humano y no pueden replicarse en ausencia de un
virus coinfectante, por ejemplo un adenovirus. Son virus pequeños
y con poca capacidad de albergar grandes genes terapéuticos en
su interior, no obstante, pueden integrar sus genomas en el
cromosoma de la célula huésped y no inducen una respuesta
inmunitaria. También poseen la capacidad de infectar neuronas, ya
que su pequeño tamaño le permite cruzar la barrera
hematoencefálica. Otros virus como el herpesvirus, el alfavirus o el
poxvirus son candidatos a vectores de transferencia. Por ejemplo, el
virus herpes simple ha demostrado ser útil en el transporte de genes
hasta el interior de las neuronas, y aunque no integre su ADN en el
cromosoma de la célula huésped, sí puede hacerlo permanecer en
forma de episoma en la neurona durante toda la vida de la célula.
Como los adenovirus, los herpesvirus que no han sido modificados
pueden ocasionar lesiones celulares e inducir respuestas
inmunológicas.

Si bien estos virus son en general muy prometedores para proporcionar

un vehículo de transferencia para genes exógenos no se puede desestimar
su capacidad de cambiar a formas nuevas que induzcan enfermedades. La
ingeniería genética dedicada a la derivación de vectores para terapia
génica a partir de estos virus debe hacerlo con suma precaución para
evitar este tipo de cambios genéticos a priori imprevisibles.
Para evitar este tipo de problemas, se han empezado a desarrollar
vectores de gene delivery no derivados de virus. Estos son los liposomas y
el ADN desnudo.

2.5.4. Liposomas
Para evitar los problemas inherentes a la toxicidad potencial de virus
humanos se han diseñado múltiples agentes sintéticos que
empaquetan el ADN de forma que éste pueda ser introducido en
la célula a la vez que lo protegen de su degradación tanto fuera
como en el interior de la célula. Los liposomas son “perlas” de lípidos
que contienen un ADN plasmídico en el que se encuentra el gen
terapéutico con todas las señales de secuencia necesarias para su
expresión en el destino celular de elección. La transferencia a la
célula se realiza por medio de la fusión entre los lípidos del liposoma
y los de la membrana celular. El mayor problema de esta estrategia
es la especificidad de las células diana en terapias in vivo y la baja
eficacia de la transferencia. La falta de especificidad está siendo
corregida por la incorporación de epítopos o pequeños
polipéptidos en el revestimiento de estas perlas lipídicas, para
fusionarlas sólo en las células diana que presenten moléculas
receptoras específicas para estos polipéptidos.

2.5.5. ADN Desnudo

Esta estrategia supone la inyección directa de ADN sin ningún
revestimiento lipídico o proteico en el interior de la célula. La
especificidad en protocolos in vivo sigue resultando un problema
aunque esta variante terapéutica ha sido utilizada con cierto éxito
en la inmunización contra enfermedades o contra ciertos tipos de
cáncer. El ADN desnudo posee la cantidad mínima de ADN para
evitar su degradación y pérdida durante la división celular,
quedando protegido en el interior de la célula por elementos que
permiten su replicación en cada división celular como si fuese un
minicromosoma artificial.
2.6. TERAPIA CON BLOQUEADORES DE GENES
Este método se utiliza para corregir las mutaciones negativas
dominantes como por ejemplo la enfermedad de Huntington y el
síndrome de Marfan. Aunque no están tan bien desarrollados como los
métodos de terapia de sustitución génica, los métodos de bloqueo
génico están en desarrollo y son prometedores.

2.6.1. Terapia Antisentido

Consiste en crear mediante ingeniería genética un oligonucleótido
con una secuencia de ADN complementaria a la secuencia de
ARNm producida por una mutación. Este oligonucleótido se une al
ARNm anormal, evitando su traducción en una proteína nociva.

2.6.2. Terapia con ribozima

Las ribozimas son moléculas de ARN, capaces de escindir el ARNm.
Éstas pueden ser manipuladas para que escindan secuencias de
ARNm específicas que contienen una mutación no deseada,
destruyéndola antes de su traducción a proteínas.

2.6.3. Terapia génica para enfermedades no hereditarias

Alrededor de dos tercios de los protocolos de terapia génica se
refieren a cánceres no hereditarios. Por ejemplo, el gen
supresor p53, que se ha perdido en aproximadamente la mitad de
los cánceres, es insertado en tumores pulmonares para detener la
progresión tumoral. Algunos tumores escapan a la detección del
sistema inmunitario, eliminando las moléculas del HLA de clase I.
Liposomas con ADN que codifican moléculas de HLA se pueden
introducir en el interior de las células de melanoma maligno,
produciéndose la expresión de la molécula de HLA en la superficie
 de las células y la consiguiente destrucción por parte de las células
T citotóxicas. Ello ha llevado en algunos casos a la desaparición del
melanoma. Diversos enfoques de terapia génica se están
orientando al virus de la inmunodeficiencia humana. La mayoría de
éstos van dirigidos a detener la replicación del virus.

2.7. APLICACIONES
La terapia génica constituye una gran esperanza para los pacientes
afectados por alguna alteración genética. Estas técnicas pueden
sustituir el gen alterado por uno normal; sin embargo, es necesario
conocer las alteraciones moleculares de las enfermedades genéticas y
decidir si son factibles de tratamiento con la terapia génica. El gen en
estudio debe clonarse e introducirlo con seguridad en las células. A
continuación se mencionan algunas aplicaciones de la terapia génica
en diferentes áreas de la medicina: enfermedades hereditarias, cáncer,
enfermedades autoinmunitarias y otras.

2.7.1. Inmunodeficiencia Combinada Grave

En la inmunodeficiencia combinada grave se ha descrito un defecto
en el gen que codifica una parte de un receptor celular que envía
las señales a los progenitores de las células T y NK. Sin este gen las
células no se desarrollan, no crecen y tampoco proliferan, lo que
hace que los pacientes se encuentren indefensos frente a la más
leve infección, viéndose abocados a vivir en el interior de una
burbuja estéril («niños burbuja») a la espera de un trasplante de
médula ósea. La corrección génica de un pequeño número de
células permite recuperar toda su fuerza y repoblar toda la parte
del órgano que falla. En 1990, se aprobó en Estados Unidos el
primer ensayo clínico de auténtica TG. Se trataba de introducir el
gen que codifica para la enzima adenosina desaminasa en niños
que presentaban una inmunodeficiencia combinada grave. Un año
después, se autorizó el mismo tipo de ensayo en Italia, y en 1995 los
dos grupos de investigación publicaban los resultados de su
experimentación clínica poniendo de manifiesto la eficacia de la
técnica de TG ex vivo en los «niños burbuja».
A principios del año 2000, investigadores franceses pusieron a
punto con éxito un método de TG que trata la inmunodeficiencia
combinada grave X-1 en el hombre. Dos lactantes de 8 y 11 meses
recibieron una copia normal del gen defectuoso y, tras once meses
desde su aplicación, los bebés presentaron un sistema inmunitario
normal y sin efectos secundarios. En este caso, los investigadores
 recolectaron médula ósea de los pacientes con el fin de extraer
células progenitoras hematopoyéticas e infectarlas con un retrovirus
portador del gen de reemplazo. Transcurridos tres días de infección
repetida, los científicos trasplantaron las nuevas células a los
pacientes y, en tan sólo 15 días, se detectaron nuevas células
portadoras de la versión correcta del gen y un importante
crecimiento de células inmunitarias plenamente funcionales y
diversificadas. Hoy día, se mantienen abiertas varias líneas, en todas
ellas el gen a transducir sigue siendo la adenosina desaminasa y el
vector utilizado, los retrovirus. Las diferencias estriban en el tipo de
célula diana, así como en las vías de administración. El dominio
adquirido en los trasplantes de médula ósea y la capacidad que
tienen las células primordiales hematopoyéticas para reconstituir
totalmente la médula ósea hacen del sistema hematopoyético un
candidato idóneo para el tratamiento génico en algunas
hemoglobinopatías (talasemias), deficiencias de adhesión
leucocitaria y enfermedades de depósito lisosomal (enfermedad de
Gaucher). Las hemoglobinopatías representan uno de los trastornos
genéticos más frecuente en humanos. Una aproximación es la
expresión regulada del gen de la globina, para lo que se ha utilizado
vectores retrovirales. La enfermedad de Gaucher es una
enfermedad autosómica recesiva, producida por el derivado
proteico de un gen que codifica la enzima glucocerebrosidasa.
Aunque el trasplante alogénico de médula ósea ha corregido la
enfermedad en algunos pacientes, en la actualidad se están
llevando a cabo estudios de trasferencia génica retroviral del gen
de la glucocerebrosidasa en células madre de ratón, seguida de la
expresión proteica en macrófagos diferenciados a partir de células
madre transducidas.

2.7.2. Hemofilia
La TG está resultando también eficaz en casos de hemofilia «A» y
«B» donde se encuentran alterados los factores coagulantes VIII y
IX, respectivamente. En ellas se han realizado aproximaciones
utilizando el transgén de estos factores y vectores retroviales,
adenovirus, virus adenoasociados y ADN desnudo administrados
por vías comunes como la subcutánea, intramuscular, intrahepática,
intraperitoneal, o intravenosa. Los vectores actúan como un
liberador de los factores a las células musculares del paciente,
donde producirán continuamente este factor. Valores equilibrados
 de éstos en el flujo sanguíneo reducirán sustancialmente los
episodios de hemorragias espontáneas y la necesaria infusión de
estas proteínas en los pacientes de este tipo de hemofilia.

2.7.3. Fibrosis quística

En la fibrosis quística se ha observado un defecto en el gen que
codifica para el canal de cloro conocido como CFTR, que resulta en
un transporte anormal de electrólitos en las glándulas exocrinas y
conduce a una enfermedad crónica obstructora de los pulmones,
insuficiencia pancreática exocrina y aumento de la cantidad de
electrólitos en el sudor. Utilizando como transgén el gen de CFTR y
como células diana las células del epitelio del tracto respiratorio, se
han realizado estudios utilizando liposomas y adenovirus como
vectores. Los riesgos de toxicidad parecen descartados en los
primeros intentos y basta con algo tan sencillo como un inhalador
para conseguir la expresión del gen y aliviar en un 30% los síntomas
de la enfermedad.

2.7.4. Distrofia muscular Duchenne

En un avance significativo hacia un tratamiento para la distrofia
muscular de Duchenne (DMD), investigadores han usado TG para
proteger músculos respiratorios vitales en ratones con la
enfermedad, debido a que la mayor causa de muerte en la DMD es
el deterioro del diafragma. La nueva investigación ha demostrado
por primera vez cómo el diafragma puede ser rescatado por medio
de la inyección intravenosa con el gen de la distrofina, que es
defectuoso en las personas con DMD. Después del tratamiento, el
músculo del diafragma del ratón mostró una expresión estable del
gen de la distrofina durante seis meses.

2.7.5. Cáncer
En el cáncer las líneas de investigación, tanto preclínicas como
clínicas dentro de la TG, pueden ser agrupadas en varias estrategias:
- Destrucción de las células tumorales mediante la expresión de
productos tóxicos, o, en su defecto, enzimas capaces de activar
profármacos, como puede ser por la sobreexpresión de la
enzima tiroxina cinasa que transforma un profármaco, el
aciclovir, en un veneno.
- Fortalecer y estimular la protección natural del sistema
inmunitario contra las células anormales incrementando el
 carácter extraño de estas células, potenciando los mecanismos
del sistema inmunitario o modificando las células cancerígenas
para hacerlas más susceptibles a su destrucción.
- Cambio del fenotipo de las células cancerígenas, bien
inhibiendo la expresión de oncogenes o aumentando la de
genes supresores de tumores, como el p53 que aparece
mutado en un alto porcentaje de tumores, o introduciendo
«genes suicidas» en células tumorales.
- Protección de las células normales de los efectos de la
quimioterapia o radioterapia.
- Incremento de la cantidad y citotoxicidad específica de los
linfocitos que reaccionan con las células tumorales.

Las primeras aproximaciones utilizaban el marcaje de linfocitos de

infiltración tumoral para seguir el progreso del tratamiento contra
el melanoma maligno. En 1990, se obtuvo la aprobación definitiva
para una aplicación de TG a pacientes con casos avanzados de
melanoma basada en experimentos ex vivo con linfocitos de
infiltración tumoral (TIL) procedentes de los tumores de pacientes
con melanoma. Los TIL fueron introducidos en una solución de
interleucina-2, una sustancia natural que potencia su efecto
destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus que codificaban
para el factor de necrosis tumoral, una proteína que interfiere con
el suministro de sangre al tumor y debilita las células tumorales. Los
TIL activados se hospedarían en los tumores atacando las células
cancerosas y, a la vez, liberando el factor antitumoral para ayudar
a exterminarlos. Sin embargo, esta aproximación presenta
 problemas debido a que los linfocitos modificados pueden quedar
atrapados en el hígado, bazo y pulmones, y la expresión no
regulada en estos órganos del factor de necrosis tumoral puede
originar procesos tóxicos secundarios.

2.7.6. Alteraciones hepáticas

A pesar de los problemas técnicos, existen protocolos clínicos
aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hígado, para el
tratamiento de la insuficiencia hepática aguda e hipercolesterolemia
familiar.

Los experimentos con ratones transgénicos, bioquímica y

fenotípicamente modificados han permitido evaluar la eficacia
terapéutica de la transferencia génica somática de vectores
adenovirales de la ornitina transcarbamilasa (OTC), beta-
galactosidasa y alfa1-antitripsina humana. Una de las vías para
restituir la funcionalidad del hígado cirrótico se enfoca en la
degradación del exceso de acumulación de proteínas de la matriz
extracelular, principalmente colágena tipo I en el parénquima
hepático. La metaloproteasa de matriz-8 o colagenasa de
neutrófilos de humano es una buena candidata para ser
sobreexpresada. Otra aproximación, en hígados cirróticos, la
constituye el gen del activador del plasminógeno urocinasa
 humano modificado. Su inserción mediante un vector adenoviral
induce la degradación del exceso de matriz extracelular y estimula
la proliferación de hepatocitos, logrando un rápido restablecimiento
de la funcionalidad del hígado. La TG mantiene abiertas dos líneas
de investigación en pacientes con diabetes tipo 1, caracterizada por
una pérdida completa de las células betapancreáticas

2.7.7. Diabetes
La TG mantiene abiertas dos líneas de investigación en pacientes
con diabetes tipo 1, caracterizada por una pérdida completa de las
células betapancreáticas. Mientras la primera se basa en la
modificación de la respuesta anómala del sistema inmunitario, la
segunda intenta aumentar el número de células capaces de secretar
insulina. Entre las vías de actuación sobre la respuesta
autoinmunitaria destacan:
- Inhibición de moléculas implicadas en el desarrollo de la
diabetes tipo 1 como interleucina 1beta, factor de necrosis
tumoral alfa, interferón gamma, interleucina 6 y óxido nítrico.
- Estimular la expresión de interleucina 4 con el fin de prevenir el
proceso de inflamación previo a la destrucción de las células
beta.
- Inhibición de la interacción de moléculas Fas/Fas-L.
- Producción local, en células beta genéticamente modificadas,
de moléculas anti-CD40-ligando, una proteína que desempeña
un papel clave en la activación de los linfocitos T.

Con el fin de aumentar el número de células beta, la TG ha centrado

sus esfuerzos en generar células no-beta capaz de secretar insulina
en respuesta a las concentraciones de glucosa. El tipo celular donde
se han obtenido resultados más interesantes y que ha generado
mayores expectativas es el hepatocito. Los hepatocitos presentan
la capacidad de captar la concentración extracelular de glucosa, ya
que comparten con las células beta algunos de los componentes
naturales del sistema de detección de glucosa, como la glucocinasa
y GLUT-2. Los hepatocitos modificados son capaces de producir
insulina con la actividad biológica y funcional similar a la de la
molécula producida por el páncreas. No obstante, debido a que las
células del hígado presentan diferente sensibilidad a la glucosa que
el páncreas, las cinéticas (los ascensos y descensos) de producción
de la insulina obtenida son muy diferentes a las de la insulina nativa
producida por el páncreas, y el control de la glucosa en sangre no
resulta óptimo. La introducción del gen PDX-1, implicado en las
primeras fases de formación y desarrollo del páncreas, y en el
 control de la expresión del gen de la insulina en células beta
maduras, ha resultado suficiente para que el hígado de los ratones
produzca insulina, lo que ha permitido un descenso de las
concentraciones de glucosa de los animales a los que se les había
inducido la diabetes mediante el agente químico estreptozotocina.
Una segunda aproximación es la modificación de hepatocitos para
que pierdan sus características y adquieran propiedades de las
células beta. Así, en células de hígado de animales de
experimentación en las que se han introducido dos genes (Neurod
y Btc), se ha observado que en una proporción de ellas aparece
una trasformación que inducía la neogénesis de islotes,
produciéndose no sólo insulina, sino el resto de las hormonas
(glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático). Además, la
sobreexpresión de glucocinasa, esencial en el sistema sensor de
glucosa, tanto de la célula beta como en el hígado, modificó las
características propias del hígado y adquirió las de la célula beta.

2.7.8. Enfermedades neurodegenerativas

Se han realizado también aproximaciones de TG en el tratamiento
de la enfermedad de Alzheimer en humanos. En cultivos primarios
de neuronas piramidales de hipocampo de rata se ha
sobreexpresado la proteína calbindina D28K, obteniéndose altos
rendimientos. Esta proteína es capaz de unirse al ion calcio
modulando sus concentraciones citoplasmáticas. La sobreexpresión
de esta proteína confirió protección a los cultivos frente a estímulos
citotóxicos como el fragmento 25-35 del péptido betaamiloide.
También se ha analizado a pacientes en las primeras etapas de la
enfermedad, con la implantación de células cutáneas a las que
previamente se les ha introducido el gen del factor de crecimiento
neurológico (NGF) que ha mostrado resultados positivos en el
deterioro cerebral en monos viejos. Otras patologías como la
enfermedad de Parkinson, en la que la relación con los factores
genéticos es menos clara, representan un mayor desafío. En esta
enfermedad, la TG ha sido llamada el «tercer paso», tras la terapia
sustitutiva con la levodopa y los implantes de células
dopaminérgicas. Así, las células hiperactivas del núcleo subtalámico
son consideradas como células diana para la inserción del gen de
la descarboxilasa glutámica ácida (GAD), responsable de la
producción del neurotransmisor inhibitorio GABA, obteniéndose
como resultado un funcionamiento más normal de la actividad de
la red cerebral. También se han realizado aproximaciones de TG ex
vivo, con trasplantes de células capaces de producir dopamina o de
secretar factores de crecimiento o neurotrofinas (BDNF, GDNF) que
actúan como agentes neurotróficos, activando rutas de
 supervivencia celular en las neuronas afectadas. Utilizando un virus
de inmunodeficiencia felino sobre un modelo animal de una
enfermedad lisosomal humana, la enfermedad de Sly, con déficit de
enzima beta-glucuronidasa que cursa con deterioro neurológico
progresivo, presentó, por primera vez en este tipo de
investigaciones, no sólo la prevención del progreso neurológico,
sino también la restauración de las capacidades previas mentales
de los animales. Como último ejemplo de las enfermedades
neurodegenerativas en las que se han llevado a cabo diversas
aproximaciones de TG, citaremos las ataxias, en las que se ha
utilizado como vector un VIH atenuado capaz de alcanzar los
ganglios dorsales medulares, una de las áreas más afectadas en la
ataxia de Friedreich. Se ha planteado el uso de moléculas, como el
factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-I), que retrasen la muerte
celular observada, planteándose la posibilidad de la regeneración
neuronal mediante el uso de células madre.

2.7.9. Ceguera
Se han realizado estudios en un tipo de ceguera total, acompañada
de degeneración de la retina, que se relaciona con mutaciones en
el gen RPE95. En modelos experimentales, la administración directa
en la retina de un virus portador del gen funcional es capaz de
impedir la degeneración y permite que la actividad eléctrica de esta
estructura ocular sea comparable a la que se observa en animales
sanos. Los resultados de este estudio constituyen el primer éxito
para prevenir la ceguera en un mamífero y tienen una importancia
adicional, si consideramos que las mutaciones del gen RPE95 se
observan en el humano en la ceguera congénita conocida como
amaurosis de Leber. Por otro lado, la manipulación genética de
células de la córnea ex vivo puede ser, en el futuro, una solución
frente a la incompatibilidad y el rechazo observado en algunos
trasplantes de córnea. Hasta ahora, los experimentos realizados en
animales han sido un éxito.

2.7.10. Sida
Se han realizado aproximaciones, tanto in vivo como ex vivo, en el
sida, mediante el empleo de vectores retrovirales portadores de
genes de la cápside o la envoltura del VIH, como la glicoproteína
120, siendo los linfocitos T las células diana. Los glóbulos blancos
modificados reconocen las células infectadas por el VIH y las
eliminan, tanto en las primeras etapas de la infección como al cabo
de largos tratamientos antivirales. En los primeros ensayos clínicos
estas células pueden eliminarlo de manera tan eficaz como lo harían
 los linfocitos T atacados por el virus, es más, éstas son capaces de
atacar eficazmente a varios mutantes del VIH.

2.7.11. Insuficiencia cardíaca

La TG viene a aumentar el abanico terapéutico disponible en la
actualidad en la insuficiencia cardíaca, abriendo las puertas a un
nuevo tratamiento que tiene como diana a la proteína fosfolamban.
Individuos con insuficiencia cardíaca presentan alteraciones en la
regulación de esta proteína. La sobreexpresión, mediante un virus
adenoasociado, de una forma mutada del gen de la fosfolamban
bloquea a la proteína nativa. En estos casos se utilizó un catéter,
similar al utilizado en la actualidad para practicar angioplastias, para
transportar el virus hasta el lugar de acción.

2.7.12. Arterosclerosis
Recientemente se ha abierto la posibilidad de aplicar la TG a
patologías como la arteriosclerosis. La administración, mediante
catéteres espaciales, en la arteria poplítea de la extremidad afectada
por mal riego sanguíneo de genes que expresaban el factor de
crecimiento vascular endotelial, ha sido considerada un éxito
parcial. Aunque los resultados iniciales no han sido del todo buenos
(ya que tan «sólo» consiguieron evitar la amputación de la pierna
gangrenada durante varias semanas), sí consiguieron revascularizar
la extremidad.

2.7.13. Disfunción eréctil e infertilidad

La sobreexpresión de factores de crecimiento antes de una
prostatectomía radical podría ayudar a reparar el nervio cavernoso
y, de esta manera, se podría minimizar la disfunción eréctil
neuropática y preservar la capacidad de erección. En ratas, la
técnica alcanza tasas de éxito de entre el 70 y el 85%. Las técnicas
de TG han sido también empleadas para revertir la infertilidad en
ratones machos, que se convirtieron en fértiles sin que el gen o el
vector lentiviral introducido se transmitiese a su descendencia. Los
ratones tratados presentaban dificultad en la formación de células
espermáticas debido a ciertas mutaciones en el gen KL2 de sus
células de Sertoli.

2.7.14. Dolor
Por último, la TG ha realizado incursiones en el campo del dolor.
Así, la expresión de forma continuada de preproencefalina en
neuronas sensitivas abre las puertas a aplicaciones clínicas en el
tratamiento del dolor asociado al cáncer, artritis, angina y
neuropatías periféricas. La TG, al ser específica, permite que la
liberación de sustancias analgésicas se produzca tan sólo en los
lugares de la hiperestimulación, evitando la aparición de efectos
secundarios de los narcóticos como la confusión mental y el letargo.
Aunque en este trabajo hemos dado una visión de la TG sólo en el
tratamiento de enfermedades hereditarias, la ingeniería genética
desde su inicio se ha utilizado para sintetizar, y en algunos casos
liberar, proteínas con fines terapéuticos. La modificación genética
de vegetales y animales permite, no sólo mejorar sus rendimientos
o resistencias frente a plagas o inclemencias naturales, sino también
la producción de proteínas de interés farmacéutico. Así, los animales
transgénicos constituyen una alternativa tremendamente
interesante para la industria farmacéutica. Las granjas transgénicas
farmacéuticas empiezan a ser realidad y las principales compañías
del mercado biotecnológico ya han puesto en marcha, de forma
experimental, la obtención de proteínas foráneas (alfa1-antitripsina,
fibrinógeno, lipasas BGL, lactoferrina) de la leche de rebaños
transgénicos, y comienzan a ser realidad las patatas transgénicas
que inmunizan contra el cólera o diarreas bacterianas, y el arroz,
capaz de producir provitamina A, con la que se pretende evitar los
problemas de ceguera asociados a dietas basadas en este cereal.
Este artículo nos ha dado una idea global de cómo la TG se erige
en la actualidad farmacológica como una de las formas más
prometedoras de terapéutica. Si bien la TG ha abierto nuevas
perspectivas al tratamiento de muchas enfermedades, ésta no es
una técnica generalizable o la panacea para todas las
enfermedades, por lo que tendrá que limitarse, ya que el éxito de
su aplicación no reside en la técnica, sino en la enfermedad misma.