03 de octubre 2018

Antecedentes científicos sobre el Premio Nobel de Química 2018

Evolución dirigida de enzimas y proteínas de unión

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La Real Academia Sueca de Ciencias ha decidido otorgar el Premio Nobel de Química 2018, con una media de Frances H Arnold “Para

la evolución dirigida de enzimas”, y la otra mitad en forma conjunta a George P Smith y señor Gregory P invierno " para la

presentación en fagos de péptidos y anticuerpos”.

Introducción

La evolución natural de las enzimas ha existido desde la aparición de la vida en la Tierra. Los genes han mutado y proteínas han evolucionado

para mejorar la aptitud de un organismo para combatir las afecciones en los nuevos entornos. Durante miles de años, los seres humanos han

sido la cría de animales y plantas a través de la selección de organismos con propiedades deseadas. Para la mayor parte de este tiempo sin

siquiera saber que lo estaban haciendo, los seres humanos evolucionaron y enzimas y proteínas de unión optimizados largo de muchas

generaciones.

La evolución dirigida de enzimas y proteínas de unión es un

procedimiento artificial construido en el entendimiento

molecular, que se mueve el proceso de evolución en el

laboratorio y lo acelera. El procedimiento se basa en la

variación prevista de secuencias de proteínas a un nivel

definido de la aleatoriedad. A esto se une a las estrategias de

cribado y selección de ingeniería. La evolución dirigida es un

procedimiento iterativo que implica la identificación de una

proteína de estado de partida, la diversificación de su gen, una

estrategia de expresión y cribado, re-diversificación,

re-screening, etc.

Figura 1. La evolución hacia la evolución dirigida

hasta un nivel de rendimiento satisfactorio en términos de actividad enzimática, de afinidad o especificidad de unión se alcanza.

La evolución dirigida de enzimas y proteínas de unión se ha convertido en una estrategia ampliamente utilizado en la investigación

académica, así como en las industrias químicas y farmacéuticas. La evolución dirigida de enzimas ellos adapta para operar en nuevas

condiciones de reacción, optimiza su actividad catalítica hacia nuevos sustratos, y los hace catalizan nuevas reacciones químicas. La

evolución dirigida de enzimas ha ampliado considerablemente el repertorio de biocatalizadores útiles. Las enzimas evolucionado

ofrecen alternativas eficientes y ambientalmente amigables a los metales y catalizadores orgánicos en industrias químicas y

biotécnicos.

evolución dirigida de proteínas de unión es una forma eficiente para identificar variantes con alta afinidad y selectividad para un objetivo

determinado, y para asignar los requisitos de secuencia para alta afinidad y las interacciones proteína de selectividad altos. La evolución

dirigida de anticuerpos humanos conduce a agentes terapéuticos útiles.

1 (24)
La evolución dirigida de enzimas y proteínas de unión - en teoría

En 1984, Manfred Eigen publicó un documento teórico esbozar un posible flujo de trabajo para la evolución dirigida de las enzimas

(Figura 2, ref 1). Eigen señaló que dicha optimización se convierte en un reto interesante debido a que el genotipo y el fenotipo

dependen de diferentes moléculas. Llegó a la conclusión de que la búsqueda de variantes mejoradas raras en grandes bibliotecas

sería difícil, si no imposible. En su lugar, propuso el uso de las bibliotecas más pequeñas y varias generaciones de mutagénesis y

cribado como un procedimiento que sería más probable que conduzca hacia adelante. Eigen predijo que sería posible construir una

“máquina evolutiva” iterativo paso a paso para producir enzimas optimizadas.

Otra predicción teórica se encuentra en una patente (2) que describe la evolución de proteínas de unión a través de la

diversificación iterativo de bibliotecas entre rondas de selección. La evolución dirigida de enzimas también se introdujo

brevemente como una posibilidad en un resumen de un estudio de ingeniería de proteínas más clásico de la optimización de la

enzima (3).

Figura 2. Extracto de la propuesta teórica de Eigen de evolución dirigida (1).

La evolución dirigida de enzimas - en la práctica

Una década después del trabajo teórico de Eigen (1), el primer trabajo experimental parecía que describe la implementación exitosa

de evolución dirigida de enzimas en un entorno de laboratorio para mejorar la función de la enzima y la versatilidad (4). Frances H

Arnold informado de la evolución dirigida de la subtilisina E para obtener una variante de la enzima, que era activo en un entorno

altamente no natural (desnaturalización), es decir, a altas concentraciones de la dimetilformamida disolvente orgánico polar (DMF).

Después de cuatro rondas secuenciales de mutagénesis y cribado en presencia de DMF, una variante de la enzima con 256 veces

mayor actividad que la enzima de tipo salvaje en 60% (v / v) fue creado DMF (4,5).

En el papel seminal (4), Arnold había dominado todo el flujo de trabajo para la evolución dirigida de enzimas, una metodología depender de

varias partes: 1) la identificación de una enzima de partida adecuado para la tarea elegida, 2) la construcción de bibliotecas de ADN de

secuencia para cubrir subconjuntos bien elegidos de

2 (24)
espacio de secuencia, 3) la identificación de los criterios de selección que conducirá a funciones y métodos mejorados o nuevos para la selección de

variantes de la enzima optimizadas, 4) re-diversificación de los genes para crear nuevas bibliotecas de ADN de secuencia alrededor de las

secuencias de la primera selección para cubrir nuevos subconjuntos de espacio de secuencia, 5) de configuración de criterios de selección con una

mayor rigurosidad, y así sucesivamente para tantas rondas como sea necesario para alcanzar el nivel deseado de rendimiento de la enzima. Cada

uno de estos cinco pasos ya se ha desarrollado y optimizado en los últimos años en el laboratorio de Arnold y varios otros laboratorios.

Además de un primer conjunto de cuatro mutaciones sencillas combinadas, la primera de trabajo (4) que se utiliza PCR propensa a error

para crear y volver a diversificar bibliotecas secuencia de ADN a través de tres rondas de mutagénesis aleatoria y cribado para

evolucionar subtilisina E. El criterio de selección fue hidrólisis de la caseína proteína de la leche. La enzima activa variantes creado halos

visibles sobre placas de agar con caseína. Las enzimas secretadas por colonias de bacterias se transfirieron así a placas de agar que

contienen tanto DMF y la caseína, para permitir la identificación de las variantes de la enzima más activos en presencia del disolvente

orgánico. El ADN plasmídico se aisló a partir de clones que secretan una variante de la enzima que produce un halo mayor que los que

rodean la enzima madre, y se somete a rondas adicionales de mutagénesis.

La evolución dirigida de la subtilisina E para mejorar su actividad en un disolvente orgánico polar fue un logro de referencia que se

abrió el campo de la evolución dirigida de enzimas. Este trabajo se convirtió en el punto de partida para el continuo desarrollo

técnico de la metodología para la evolución dirigida. El campo se expandió hacia la mejora y remodelación de enzimas para

numerosas reacciones químicas, antiguos y nuevos, lo que lleva a las aplicaciones de importancia para la investigación en la

síntesis orgánica, así como para la industria química y farmacéutica y más allá.

conocimientos moleculares diseño de la biblioteca guía

No es posible asignar al azar a cada posición en una enzima, el tamaño típico de los cuales es 200-300 residuos de aminoácidos o

más. De hecho, sólo una pequeña fracción de las posiciones de aminoácidos se puede variar si el objetivo es una biblioteca con

cobertura de secuencia completa. La razón es simple matemática combinatoria y el rápido aumento del número de variantes en

relación con el número de clones que se pueden manejar en cualquier entorno de laboratorio, o incluso utilizando la capacidad

conjunta de todos los laboratorios del mundo. Sin embargo, una gran cantidad de estudios deja claro que las mutaciones en y cerca

del sitio activo, así como sustituciones más distantes en la superficie de la enzima pueden contribuir a la actividad catalítica

optimizada. Arnold y colaboradores han demostrado por muchos ejemplos que diseño de la biblioteca debe basarse en el

conocimiento molecular y las opciones basadas en el conocimiento de que las posiciones de aminoácidos para variar,

Un prominente de los primeros contribuyentes al desarrollo y la aplicación de la metodología para la evolución dirigida fue el difunto

William (PIM) Stemmer († 2013). Stemmer introdujo una estrategia de recombinación de ADN denominado “barajado de ADN” a la

evolución de las enzimas. Esto era una manera eficiente para propagar mutaciones beneficiosas mientras que el aumento del tamaño

de una biblioteca de ADN

3 (24)
a través de fragmentación aleatoria y re-ensamblaje de genes (6,7). Se mostró que el uso de barajado de ADN, es decir, la recombinación de

ADN a partir de genes similares a partir de varios organismos, introduce más variación que muchos otros métodos y por lo tanto puede mejorar

las posibilidades de alcanzar un aumento de la actividad sustancial de las variantes evolucionadas. En un estudio de prueba de principio

Stemmer y compañeros de trabajo establecen para aumentar la actividad de la enzima β-lactamasa (una enzima responsable de la resistencia a

antibióticos); tres ciclos de barajado de ADN y el cribado en placas con sucesivamente mayor concentración del antibiótico cefotaxima

condujeron a la evolución de una enzima con un aumento significativamente la actividad de (6,7). transposición de genes había sido reportado

como un medio para aumentar la variación y mejorar la afinidad del anticuerpo por una diana, a veces llamada maduración de la afinidad, y

siempre que los primeros ejemplos de evolución dirigida de proteínas de unión (8-10). En estos casos, los segmentos de genes barajados

correspondían a las cadenas ligeras (10) o a los bucles variables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas (8,9).

Figura 3. El flujo de trabajo para la evolución dirigida de enzimas.

4 (24)
barajado de ADN, proceso escalonado de extensión (STEP) y otros métodos para la generación de la biblioteca se desarrolla más en

Arnold de y laboratorios de Stemmer para uso en la evolución dirigida de enzimas durante la segunda mitad de la década de 1990 (11-26).

Desde finales del siglo pasado, los costos progresivamente decrecientes para de novo síntesis de los genes con codones degenerados, o

bibliotecas de ADN completamente diseñados, han abierto un nuevo camino hacia la producción eficiente y asequible de las bibliotecas de

secuencias con diversidad adaptado.

Criterios de selección y técnicas de selección

Los criterios de selección y las técnicas de detección deben ser adaptados para cada esfuerzo optimización enzima. La selección puede ser

acoplado a una función de supervivencia celular; por ejemplo, la actividad enzimática deseada puede desintoxicar un compuesto que de otro

modo inhibe el crecimiento. La selección también puede estar acoplado a un ensayo de enzima espectroscópico u otros medios de óptica o

ocular de sondeo para la actividad mejorada.

Al utilizar evolución dirigida para mejorar la actividad de la enzima bajo condiciones no nativas, tales como temperatura elevada o

alta concentración de una sustancia tóxica o desnaturalización o disolvente orgánico, las condiciones pueden tener que ser

introducido por etapas con aumentando gradualmente la rigurosidad de la presión de selección. Esto asegura que la plantilla de

enzima en cada ronda tiene al menos alguna actividad de partida rudimentaria en las condiciones utilizadas en esa ronda. aumento

paso a paso del factor de estrés, con intervenir diversificación entre rondas de selección, hace que sea posible derivar enzimas o

enzimas sucesivamente más eficaces y más tolerantes con nuevas propiedades catalíticas. La selección puede llevarse a cabo en

placas de agar (4-6), utilizando un ensayo de lavado de filtro (4) o el uso de la citometría de flujo (27,28). in vitro compartimentación

en gotitas de emulsión de agua-en-aceite que contiene ribosomas y mRNA biblioteca (29).

Nuevas condiciones de reacción

Se añadieron las primeras aplicaciones de evolución dirigida de enzimas dirigidas a optimizar la estabilidad y el rendimiento en las

nuevas condiciones de reacción tales como altas fracciones de disolventes orgánicos (4), nuevas rondas de evolución dirigida para

llegar a un aumento de la actividad 471 veces más que de tipo salvaje (30 ). Otro ejemplo del laboratorio Arnold refiere a la

optimización de una esterasa paranitrobencilo para la actividad en presencia de un (31).

Existen muchos métodos para el aumento de la termoestabilidad de las enzimas y otras proteínas. Cuando la evolución dirigida de

enzimas se utiliza con el objetivo de aumentar su estabilidad térmica, el proceso evolutivo se puede configurar ensayos de tratamiento

térmico y de la actividad como intercalados, o, alternativamente, los ensayos de actividad se puede realizar a temperatura elevada. En un

estudio, la termoestabilidad de Bacillus subtilis P- nitrobencil esterasa se incrementó en más de 14 ° C (aumento de T metro) después de seis

generaciones de mutagénesis aleatoria, la recombinación a través de barajado de ADN, y

5 (24)
cribado con tratamiento intercalada calor y ensayos de actividad (32). Este trabajo mostró que es posible mejorar la estabilidad

térmica de una enzima sin comprometer su actividad catalítica a temperaturas más bajas, si ambas propiedades se ven limitadas.

Si no es así, la evolución de una propiedad puede venir a costa de la otra, con independencia de que las dos propiedades se

correlacionan inversamente correlacionada o no en absoluto (32). Naturaleza por lo general proporciona organismos adaptados a

entornos fríos o calientes con dos enzimas diferentes que tienen propiedades catalíticas óptimas a baja o a altas temperaturas,

respectivamente. Arnold demostró que la evolución dirigida puede producir una única enzima con una elevada actividad catalítica a

temperaturas altas y bajas (32-35). Otra estrategia de evolución dirigida se basó en la información estructural en forma de Bfactors

cristalográficas, una medida de qué regiones son más o menos ordenada en una proteína cristalizada. Al centrarse la biblioteca de

mutaciones a las 10 posiciones con los más altos factores B, se consiguió un gran aumento de estabilidad de la enzima (36).

Además de derivar biocatalizadores mejorados y novedosos, los estudios de evolución dirigida contribuyen a nuestra comprensión general del

proceso de evolución de proteínas naturales y los factores determinantes de la acción enzimática, a pesar de las presiones de selección

operan sobre totalmente diferentes escalas de tiempo, los tamaños de población, las tasas de mutación, fuerza de la selección, etc. . Arnold y

otros han demostrado la importancia de la evolución de proteínas de factores tales como la termoestabilidad (37,38), los efectos relativos de

las mutaciones al azar y recombinación (39), la importancia de la deriva neutra de la evolución de la función de la proteína (40,41) y las

correlaciones entre las tasas de expresión de la proteína y la evolución (42).

Elección de estado de inicio

Arnold y colaboradores han demostrado repetidamente que es posible evolucionar enzimas para mejorar su actividad bajo nuevas

condiciones en términos de composición de la solución, temperatura, etc., y para cambiar su actividad catalítica hacia nuevos sustratos y

reacciones. Esto es posible siempre que la enzima que se elige como punto de partida tiene al menos algunos bajo nivel de actividad

para la reacción deseada, es decir, un cierto nivel de promiscuidad catalítica (Figura 4, revisado en, por ejemplo 43-46). Un andamio

inactivo no es una buena opción; evolución dirigida requiere algún nivel bajo de actividad. Incluso un nivel de actividad muy baja hacia la

reacción deseada proporciona un estado de partida para optimizar través de la evolución. A menudo sólo unas pocas mutaciones son

necesarias para impulsar a la nueva actividad.

Si una enzima tiene un bajo nivel de actividad para una reacción deseada, pero mucho más alta actividad para una natural, puede ser

provechoso para reducir primero la actividad natural antes de comenzar los esfuerzos de evolución dirigida hacia la nueva reacción

pretendida.

Nuevas reacciones químicas

Como un ejemplo reciente de esta última estrategia, la actividad de la triptófano sintetasa de Pyrococcus furiosus se redujo primero

por 95% a través de la eliminación de los dominios no catalíticos de la enzima. El dominio catalítico aislado estaba sujeto a tres

rondas de evolución dirigida para introducir nuevas actividades catalíticas hacia la síntesis de análogos de triptófano (47-51).

6 (24)
Figura 4. A: Un punto de partida sin actividad para la reacción deseada es inútil ya que no hay variaciones de la secuencia (flechas rojas) crean el

nuevo reactividad. SEGUNDO: Una enzima promiscua con al menos baja actividad para la reacción deseada es un punto staring adecuado. Algunas

combinaciones de mutaciones aleatorias pueden mejorar la nueva reactividad (flecha negro). La primera variante (1) sirve como un estado de partida

para rondas secuenciales de variación y de cribado → ( 2) → (3) → ( 4) para variantes mejoradas. Sólo se necesitan normalmente un pequeño número de

ciclos y para impulsar el nuevo reactividad.

En una serie de estudios, Arnold y compañeros de trabajo cambian la actividad de citocromo P450 para catalizar un conjunto de

reacciones para las que estaba disponible anteriormente no enzima específica, por ejemplo, ciclopropanación. citocromo P450 BM3 tiene

una promiscuidad catalítica y una capacidad de catalizar, con muy baja eficiencia, la ciclopropanación de estireno por

etil-diazoacetato (EDA). Mucho más enzimas específicas y eficientes fueron evolucionado y sólo una pequeña fracción (0,2%) de los

aminoácidos en la enzima necesaria para cambiarse para optimizar la nueva actividad catalítica (52-54). Esto incluyó un cambio del

residuo de hierro-ligando de Cys a Ser o His, que conduce a un cambio en la característica de 450-nm pico Soret en el espectro de

absorbancia de la enzima a 411 nm. Por lo tanto, las enzimas evolucionaron fueron llamados P411 citocromo.

Otros ejemplos de reacciones para las que no hay enzimas naturales han evolucionado son reacciones de transferencia de nitreno. En un caso,

Arnold y compañeros de trabajo comenzaron a partir de una variante de citocromo P411 realiza la reducción de azida de aproximadamente 100

veces más eficiente que la transferencia de nitreno a sulfuro. Uso de evolución dirigida que producían una variante de la enzima que en vez

promueve de manera eficiente el proceso de transferencia nitreno deseado (55). Hay varios otros ejemplos de evolución dirigida de enzimas para

carbeno y reacciones de transferencia de nitreno (véase por ejemplo 56,57).

Las reacciones con enlaces CH alifáticos y aromáticos son otro objetivo tratable. Uso de evolución dirigida de monooxigenasa

citocromo P450, una enzima fue creado que cataliza la aminación intermolecular de enlaces C-H bencílicos. El biocatalizador es

enantioselectiva y dura

7 (24)
para hasta 1.300 pérdidas de balón, proporcionando de este modo un biocatalizador eficiente para la síntesis de aminas bencílicos valiosas (58).

Otros ejemplos de evolución hacia nuevas reacciones incluyen la generación de enzimas que catalizan la desintoxicación arseniato

(14), la producción de carbociclos altamente tensas (59), y la conmutación de una enzima a partir de una galactosidasa a una

fucosidasa (15).

Figura 5. Un evolucionó biocatalizador para

ciclopropanación. La variante del citocromo P411 de

citocromo P450 (ref.

52) con el esqueleto de la proteína se muestra como

representación de la cinta y cadenas laterales como palos.

Cadenas laterales que fueron mutados en las variantes de

ingeniería se muestran en rojo.

Vías metabólicas

Una fuerza de la metodología de la evolución dirigida es la capacidad de co-evolucionar enzimas en las rutas biosintéticas. En un ejemplo Arnold y

colaboradores desarrollaron una vía de multi-enzima para la producción de carotenoides en E. coli (60). Su laboratorio también se mostró como

biocatalizadores de células completas pueden ser desarrolladas para la producción de productos químicos valiosos mediante el uso de la evolución

dirigida para permitir la producción de L-metionina en E. coli ( 61).

Los biocombustibles

Uno de los retos para la humanidad es encontrar sustitutos o suplementos adecuados para los combustibles fósiles, que se pueden

producir de una manera sostenible y respetuosa del medio ambiente. Aquí, uno busca para producir alcoholes a partir de alcanos de

cadena corta (62) y un biocombustible principal candidato es 2methylpropan-1-ol (isobutanol). Isobutanol se pueden producir usando

una ruta biosintética en recombinante Escherichia coli. Dos enzimas en la ruta, sin embargo, requieren la nicotinamida adenina

dinucleótido fosfato (NADPH) como cofactor, mientras que la glucólisis, el metabolismo normal durante el crecimiento de E. coli produce

nicotinamida adenina dinucleótido reducida (NADH). Para resolver este obstáculo, Arnold y colaboradores utilizaron la evolución

dirigida para alterar la dependencia cofactor de las enzimas por lo que en su lugar pueden confiar en NADH, por lo que las enzimas y

con ello el organismo adecuado para la producción de biocombustibles (63).

8 (24)
enlaces químicos nuevos

enlaces carbono-silicio son comunes en los productos químicos hechos por el hombre, pero ausente en la biología. La naturaleza no ha

evolucionado enzimas que catalizan la formación de enlaces carbono-silicio. Sin embargo, la evolución dirigida se puede utilizar como una

estrategia para asegurar que tales química inventado por los seres humanos también puede llevarse a cabo con ayuda de enzimas.

Arnold y colaboradores observaron que las proteínas hemo pueden catalizar reacciones de carbeno de inserción no naturales. Después

de cribado de una serie de proteínas hemo de diversos organismos, se decidió utilizar citocromo c de Rhodothermus marinus como punto

de partida. Esta proteína cataliza la formación de enlaces carbono-silicio con baja eficiencia, pero con exceso enantiomérico 97% (ee; 64).

Una pequeña biblioteca de variantes se proyectó durante el tratamiento térmico y en los ensayos de la actividad catalítica, y el mejor

candidato se sometió a mutagénesis adicional y cribado. El resultado de este trabajo es una enzima que cataliza la formación de enlaces

de silicio-carbono 40 veces mejor que la enzima de partida y con 99% de ee (64). La enzima evolucionado tuvo 15 veces más alto número

de recambio que el mejor catalizador no enzima conocida para la misma reacción. Este ejemplo muestra que es posible ampliar el

alcance de las reacciones catalizadas por enzimas en términos de qué tipo de enlaces se forman por la enzima de ingeniería.

Otros ejemplos de bonos y reacciones no catalizadas por cualquier enzima que se encuentra en la naturaleza, pero para los que la

evolución dirigida se utilizó para crear enzimas eficientes, son enlaces carbono-borano (65) y enantio-selectiva intramolecular CH

aminación (66).

Selectividad enantiomérica

La evolución dirigida es una forma eficaz para mejorar la selectividad enantiomérica de enzimas, es decir, la mejora de su

rendimiento en la catálisis asimétrica. Las enzimas evolucionados se utilizan en la producción de sustancias quirales con pureza alta

enantiómero. Un ejemplo temprano de evolución dirigida con el objetivo de mejorar la selectividad enantiomérica de una enzima se

informó por Matcham y Bowen relativa a las transaminasas en la catálisis de la producción de amina quiral (67). Este trabajo se inició

con una enzima con bajo nivel de S-selectividad (65% ee) en la conversión de la cetona β-tetralona a aminotetralina, la amina

correspondiente. Una biblioteca de mutantes fue generado y se tamiza para la actividad mejorada en el S-isómero, pero no el

R-isómero. El resultado fue un biocatalizador que produjo el S-aminotetralina con selectividad mucho mayor (94% ee), que fue

mejorado aún más por rondas adicionales de mutagénesis y cribado (67). Manfred Reetz y colaboradores informaron otro ejemplo

temprano que ha llevado a una mejor enantioselectividad de las lipasas en la hidrólisis del éster (68). A través de evolución dirigida a

través de cuatro ciclos de mutagénesis al azar, el factor de selectividad de una lipasa bacteriana de Pseudomonas aeruginosa

se aumentó por primera vez de 1.1 a 11 (68) y luego a 35 después de una mayor diversificación de la biblioteca (69). Otros ejemplos

tempranos se encuentran en (70-73).

La evolución dirigida en la síntesis orgánica y la industria

La evolución dirigida rápidamente hizo su camino desde el ámbito académico para aplicaciones industriales (74-77). Las enzimas

desarrolladas utilizando la evolución dirigida se utilizan en la industria en la producción de

9 (24)
biocombustibles, materiales, a granel y productos de química fina, detergentes, productos de consumo, reactivos de laboratorio y farmacéuticos,

así como productos intermedios para la industria farmacéutica. Varias de las enzimas desarrolladas en el laboratorio de Arnold se utilizan en la

industria. Muchas empresas tienen sus propios equipos científicos la aplicación de estrategias de evolución dirigida para mejorar catalizadores o

productos terapéuticos basados ​en proteínas en términos de estabilidad, actividad, especificidad u otras propiedades. Ejemplos específicos de

enzimas y productos evolucionados son potenciadores del sabor, fármacos contra la diabetes y las placas vasculares, así como productos

farmacéuticos hipolipemiantes. Algunas enzimas producidas por la evolución dirigida se hacen a escala muy grande. Esto incluye lipasas utilizadas

en los detergentes. productos químicos industriales se hacen en grandes cantidades con la ayuda de los biocatalizadores producidos por la

evolución dirigida.

Una alternativa verde

La evolución dirigida proporciona enzimas con especificidad única, lo que ofrece biocatalizadores respetuosa del medio ambiente. Las

enzimas desarrolladas utilizando la evolución dirigida han sustituido a los procesos industriales severos con la biotecnología más leve que

no requiere metales tóxicos o grandes cantidades de disolvente orgánico. Uso industrial de enzimas desarrolladas utilizando la evolución

dirigida haber, por ejemplo, sustituido catalizadores químicos en la síntesis asimétrica y proporcionar una alternativa verde que conduce a

un menor consumo de disolventes orgánicos y menores cantidades de productos secundarios y residuos.

La evolución dirigida en el diseño de proteínas

La evolución dirigida pretende modificar las actividades de las enzimas ya existentes basadas en el entendimiento molecular combinado

con un gran elemento de aleatoriedad. Ortogonal a la evolución dirigida es el diseño racional de proteínas. el diseño de proteínas se basa

en ab initio o cálculos empíricos y objetivos para el diseño de proteínas a partir de cero. Sin embargo, en el campo de diseño de proteínas,

es ampliamente reconocido que con el fin de alcanzar un nivel aceptable de condición física, por ejemplo, en términos de afinidad de unión

y especificidad, es a nuestro nivel actual de conocimientos necesarios para agregar evolución dirigida como una final paso de optimización

(véase, por ejemplo, refs. 78-80).

Resumen y perspectivas

La evolución dirigida de enzimas se ha convertido en un protocolo altamente eficiente para el desarrollo de biocatalizadores con alta

especificidad, las reacciones secundarios limitados y la tolerancia de las diversas condiciones de reacción. La evolución dirigida es un camino

versátil y eficiente hacia enzimas optimizadas y enzimas con nuevas funciones. Una conclusión principal que se desprende de la investigación es

que la evolución dirigida de hecho enzimas pueden ajustarse para catalizar nuevas reacciones, y para reacciones muy diferentes a las

catalizadas por enzimas propias de la naturaleza. Hay un amplio espacio para la optimización y la redirección de la función enzimática en

términos de reactividad, especificidad de sustrato y las reacciones químicas, así como la tolerancia a diversas condiciones de reacción. Estamos,

probablemente, muy lejos del límite de las cuales catalizan reacciones de enzimas pueden - hay un montón de espacio para una mayor

descubrimiento.

10 (24)
La presentación en fagos de péptidos y anticuerpos

evolución dirigida de proteínas de unión se ve facilitada por un acoplamiento físico entre (proteína de unión de alta afinidad alta

selectividad) fenotipo y genotipo (secuencia de ADN). Esto se proporciona mediante presentación en fagos.

La presentación en fagos de péptidos

La presentación en fagos representa un importante avance tecnológico y fue desarrollado por George P Smith ( 81). El ADN que

codifica para un miembro de proteína específica de la biblioteca se empaqueta dentro del fago de tal manera que el fago presenta la

proteína en su superficie. Esto simplifica la detección basada en la unión a los receptores. Esto también simplifica la identificación y

amplificación de fagos que expresan las proteínas mejor unión. La infección por los fagos de E. coli y la multiplicación en el huésped

produce una biblioteca enriquecida después de cada ronda de selección. También es posible volver a la diversificación de la biblioteca

de fagos entre las rondas de selección.

En un artículo seminal, Smith mostró que un péptido podría insertarse en un bucle de la proteína III, una proteína de recubrimiento

menor en la superficie del fago de fusión, y que el péptido presentado retenido interacción con su objetivo (81). En este trabajo, el

péptido presentado era un fragmento de 57 residuos de una endonucleasa de restricción. El uso de una sola ronda de purificación por

afinidad frente a antisuero para la endonucleasa, Smith mostró que fagos que presentan el péptido endonucleasa insertado en la

proteína de cubierta III de su superficie podrían enriquecerse 1000 veces más que otros fagos. Esbozó una forma de avanzar hacia

mucho mayor enriquecimiento, lo que podría lograrse mediante el uso de una secuencia de rondas de purificación por afinidad.

En otra publicación, de 1988 (82), Parmley y Smith introdujeron varias mejoras técnicas a la tecnología de presentación en fagos, por

ejemplo, moviendo la ubicación del péptido presentado dentro de la proteína III. Esto fue motivado por el hecho de que la proteína III

media la infección de E. coli por unión a su pilus F. Totalmente proteína funcional III es por lo tanto esencial para la propagación del

fago. Smith introdujo el término “biopanning” para purificación por afinidad de fagos que presentan péptidos de alta afinidad a partir

de un fondo de las de menor afinidad, usando placas de Petri recubiertas con estreptavidina a la que se acopló diana biotinilado.

Esto ofreció un dispositivo fácil para la captura, el lavado y la elución en el procedimiento de purificación por afinidad. Smith

demostró la viabilidad de su enfoque mejorado al lograr 10 8- doblar enriquecimiento de fagos que presentan un péptido que

representa el epítopo de un anticuerpo anti-β-galactosidasa utilizando la purificación por afinidad hacia su objetivo (82).

11 (24)
Smith también propuso que la presentación en fagos de péptidos podría ayudar en el desarrollo de vacunas (81). Estos estudios

inspirados en péptidos del parásito de la malaria Plasmodium falciparum se visualiza en la superficie de fagos filamentosos y

encontrado que es activo como antígenos (83,84).

Figura 6. La selección de proteínas a partir de bibliotecas de presentación de fagos de unión de alta afinidad. Una biblioteca inicial de péptidos o proteínas variantes que

aparecen en la proteína III en la punta del fago (superior izquierda) se añade a una proteína diana (blueyellow) inmovilizado sobre un soporte sólido, perlas aquí magnéticos

(rojo). Después de un extenso lavado para eliminar los fagos unidos débilmente (inferior derecha), las mejores variantes de unión se eluyen (por ejemplo, ácido usando) y se

utilizaron para infectar E. coli para producir una biblioteca amplificada enriquecer en los miembros de alta afinidad para una siguiente ronda de purificación por afinidad. El

procedimiento se puede repetir tantas veces como sea necesario para obtener el nivel deseado de selección.

La presentación en fagos de bibliotecas de péptidos

En su documento de 1985 (81), Smith predijo que sería posible aislar clones de una biblioteca de insertos al azar en un vector de

fago. En 1988 (82), escribió que la expresión de un gran número de péptidos con secuencias al azar en la superficie del fago podría

ser útil para la búsqueda de los epítopos reconocidos por los anticuerpos. Él razonó que tal tecnología podría revelar el epítopo de

casi cualquier anticuerpo, ya que muchos anticuerpos reconocen segmentos lineales cortos de cinco y seis residuos de aminoácidos.

El marco para la producción de bibliotecas de presentación en fagos para la selección de péptidos de unión se desarrolló así en el

laboratorio Smith, sino también inmediatamente recogido por otros grupos. Una serie de publicaciones apareció casi simultáneamente

a principios de 1990,

12 (24)
Los dos primeros trabajos aparecieron en la misma edición de Ciencia ( 85,86). Ambas bibliotecas se expresaron en fusión con proteína de la

cubierta III. Devlin y colaboradores informaron de una biblioteca de 20 millones de diferentes péptidos 15-mer, que fue utilizado para deducir

un motivo de unión de péptido, HPQ, que confiere una alta afinidad por el sitio de unión a biotina de estreptavidina (85).

Scott y Smith informaron de una biblioteca de 40 millones de péptidos 6-mer utilizados para determinar los epítopos de dos anticuerpos

monoclonales diferentes que habían sido generados contra un fragmento de seis restos de myohaemerythrin (86). péptidos de unión al

anticuerpo fueron-purificaron por afinidad de las bibliotecas a través de tres rondas sucesivas de biopanning, seguido por la infección de E. coli para

producir una biblioteca de presentación de fagos enriquecido para la siguiente ronda, y así sucesivamente. Después de tres rondas de

purificación por afinidad, en combinación con mediciones de afinidad para clones seleccionados, Smith y compañero de trabajo mostraron que

sólo los más altos péptidos de afinidad se retuvieron. Un motivo de unión de consenso para el epítopo de anticuerpo podría deducirse basado en

la secuenciación del ADN de los clones individuales (86). Mediante la comparación de un gran número de secuencias de aminoácidos,

encontraron que los tres primeros aminoácidos del epítopo son los más importantes para conferir la unión al anticuerpo (86) de alta afinidad.

Una biblioteca aleatoria de hexa-péptidos se utilizó para seleccionar péptidos para un anticuerpo antiβ-endorfina unión de alta afinidad;

después de tres rondas de purificación por afinidad y la secuenciación de 51 clones, un motivo de consenso podría deducirse y no se

encontraron las dos mayoría de los residuos N-terminales para ser el más importante en este epítopo para determinar la afinidad de

anticuerpos (87).

La presentación en fagos de bibliotecas de péptidos hizo posible determinar epítopos para anticuerpos. A través de la presentación en

fagos de anticuerpos, los investigadores podrían invertir el procedimiento de selección, que fue un paso importante hacia el desarrollo

de anticuerpos terapéuticos.

La presentación en fagos de fragmentos de anticuerpos

En 1990, señor Gregory P invierno informaron la visualización de un fragmento de anticuerpo plegado y completamente funcional en fago

filamentoso (88). IgG intactos son grandes moléculas bivalentes compuestas de cadena de más de un ácido amino y por lo tanto son difíciles

de expresar en la superficie del fago. Winter y compañeros de trabajo en lugar muestran un fragmento variable de cadena única, scFv, un

constructo en el que la parte variable de la cadena pesada estaba ligado covalentemente a través de un enlazador polipéptido flexible para la

cadena ligera (89). Como tal, un scFv lleva un único sitio de unión a antígeno del compuesto de seis bucles variables, denominado de

definición complementarios regiones (CDRs).

En el primero de trabajo (88), Winter y compañeros de trabajo muestran un scFv derivado en ratones inmunizados contra gallina

lisozima de clara de huevo en fusión con la proteína de fago filamentoso III. Ellos mostraron que los scFv fagos unidos a la lisozima de

clara de huevo de gallina, pero no lisozima humana o lisozima de clara de huevo de pavo. La muy alta especificidad implicaba que el

scFv se muestra en forma plegada funcional en la superficie del fago. Un enriquecimiento millón de veces de fago que lleva el

fragmento de unión al antígeno sobre otros fagos se logró mediante dos rondas de purificación por afinidad con intervenir

amplificación de los fagos retenidos (88).

13 (24)
La Figura 7. Definición de fragmentos de anticuerpos. estructura de la inmunoglobulina G (IgG) (izquierda) con las dos cadenas pesadas en azul

azul y la luz y las dos cadenas ligeras en rojo y rosa, con la ubicación de Fab y scFv (89) indicado. El modelo de llenado del espacio de un scFv

(derecha) muestra los bucles variables en verde.

Este logro fue el punto de partida de una revolución farmacéutica: la eficacia probada de utilizar la presentación en fagos de

fragmentos de anticuerpos funcionales para la selección de ligantes de alta afinidad para un antígeno definido. La tecnología

ahora hace posible pasar por alto la inmunización para la generación de anticuerpos monoclonales con andamios totalmente

humanos, y la posibilidad de visualizar las bibliotecas combinatorias de anticuerpos humanos facilita el desarrollo de anticuerpos

terapéuticos. Además, la tecnología de presentación de fago hace posible derivar anticuerpos que reconocen antígenos tóxicos, o

antígenos que de otro modo comprometer el anfitrión.

Inspirado por la presentación de fagos de bibliotecas de péptidos (81,82,85,86), Invierno esbozó varias direcciones y aplicaciones de

presentación de fagos de anticuerpos (88) en el futuro. Propuso la construcción y selección de bibliotecas combinatorias de anticuerpos

grandes creadas por combinación aleatoria de genes para la pesada y dominios variables de cadena ligera para la exhibición en fago

filamentoso. También propuso la producción y selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos totalmente sintéticos.

Otro ejemplo de presentación en fagos de fragmentos de anticuerpos, en este caso a lo largo de toda la longitud de la superficie del fago,

en fusión con la principal proteína de recubrimiento VIII, se informó por Richard Lerner y colaboradores en 1991 (90). Este trabajo

muestra fragmentos de anticuerpos algo más grandes, fragmentos Fab llamados, derivadas en ratones contra la toxina del tétanos. Dos

dominios de la cadena pesada del anticuerpo se muestran en el fago y dos dominios de la cadena ligera del anticuerpo se expresaron en

forma secretada. Los fragmentos de las dos cadenas reconstituyó el Fab en la superficie del fago y un enriquecimiento de 2700 veces

sobre fagos no específicos se logró utilizando biopanning; los investigadores proponen que un mayor enriquecimiento se obtendría

utilizando rondas secuenciales de biopanning (90).

También en 1991, la presentación en fagos de fragmentos Fab heterodiméricas de ratones inmunizados en proteína III se informó por Winter y

compañeros de trabajo (91). Dos dominios de una cadena de anticuerpo (pesada o ligera) se expresaron en fusión con la proteína III del fago y

dos dominios de la cadena de anticuerpo opuesto (ligero o pesado, respectivamente) en forma secretada. Se encontró que ambos

orientaciones para producir

14 (24)
Fab funcional; los dos fragmentos reconstituyó el Fab en la superficie del fago filamentoso. Se razonó que esto proporciona un

formato para explorar una variedad mucho más amplia de secuencias (10 14) que alcanzable en las bibliotecas individuales (10 7) a

través de la ventaja combinatoria de la coexpresión de dos bibliotecas (91). Otro estudio de 1991 muestra un fragmento Fab de ratón

dirigido contra el dominio extracelular del receptor HER2, y mostró que podía ser enriquecido millón de veces a partir de un fondo de

fagos no vinculantes (92), o en relación enriquecido a fragmento Fab mutada con menor afinidad por el mismo antígeno.

La presentación en fagos de bibliotecas de anticuerpos

Se informó de un número de bibliotecas de anticuerpos en fagos filamentosos durante 1991. Este trabajo fue realizado en varios

laboratorios en paralelo, incluyendo el invierno y laboratorios Lerner.

El primer informe describió la presentación en fagos de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos scFv (8). Esta biblioteca fue

derivado de ratones inmunizados con el antígeno de molécula pequeña 2-feniloxazol-5one (phOx) y se muestra en la parte

N-terminal de la proteína III del fago filamentoso. Uso de antígeno phOx inmovilizada sobre una resina de columna, Winter y

colaboradores demostraron que era posible para seleccionar anticuerpos phOx-unión de la biblioteca inicial y que la fracción de

anticuerpos highaffinity aumento en rondas secuenciales de selección. Por otra parte, encontraron que los anticuerpos de mayor

afinidad se podrían derivar si la cadena pesada variable (VH) y genes lightchain variable (VL) se vuelven a barajar entre las rondas

de selección por afinidad para producir nuevas combinaciones que no están presentes en los ratones inmunizados (8). La biblioteca

original de 200.000 secuencias de scFv contenidas,

Poco después, se informó de la visualización de una biblioteca combinatoria de fragmentos Fab en la proteína de superficie de fago III

(93). Esta biblioteca contenía una fracción de bajo de fragmentos Fab derivados de ratones inmunizados con la toxina del tétanos. La

biblioteca se usó para seleccionar ligantes a la toxina del tétanos de un fondo de fago no vinculante usando biopanning (93). Otra

publicación informado phagedisplayed Fab bibliotecas de 10 millones de variantes de la secuencia, que se derivan de la médula ósea

del VIH-positivos seres humanos (94). Estas bibliotecas se utilizaron para derivar fragmentos Fab de alta afinidad contra la

glicoproteína de superficie gp120 del virus.

Se informó de dos bibliotecas de scFv de origen humano en 1991, que se muestra en la proteína III del fago filamentoso (95). Estas

bibliotecas se construyeron como combinaciones de las partes variables de las cadenas pesada y ligera de IgM (27 millones de

miembros) o de las partes variables de las cadenas pesada y ligera de IgG (160 millones de miembros) derivadas de seres humanos no

inmunizados. La capacidad para derivar anticuerpos de alta afinidad a partir de estas bibliotecas utilizando cuatro rondas de

bioselección se demostró utilizando como antígenos la pequeña molécula phOx, así como las proteínas de la lisozima de huevo de

pavo-blanco y albúmina de suero bovino.

15 (24)
bibliotecas de anticuerpos tempranos

Antes de la presentación en fagos de anticuerpos (88), un par de otros formatos se ensayaron para el cribado o selección de ligantes de alta

afinidad. En 1989, Winter y colaboradores informaron bibliotecas de fragmentos de anticuerpos que podrían ser manejados fuera de las células

para la selección in vitro ( 96). repertorios nativos de anticuerpos fragmentos VH se obtuvieron a partir de ratones inmunizados con lisozima o

hemocianina y se clonaron en un formato que permite la secreción de E. coli, solo o en combinación con VL (V κκ ) cadenas. Los anticuerpos

pueden ser seleccionados de las bibliotecas secretadas utilizando antígeno inmovilizado. En un segundo ejemplo del mismo año, Lerner y

colaboradores expresaron una gran biblioteca combinatoria de fragmentos Fab que representa el repertorio de anticuerpos de ratón en E. coli utilizando

un vector lambda (97). Proyección de esta biblioteca para los miembros de unión a antígeno se realizó usando un ensayo de elevación de la

placa. Las tecnologías utilizadas en estos intentos anteriores para la selección y selección de bibliotecas de anticuerpos pronto fueron

abandonados en favor de la tecnología de visualización de fagos más eficiente.

Una nota sobre la humanización

Los primeros anticuerpos monoclonales producidos por el hibridoma no se adaptaron fácilmente a convertirse en medicamentos de uso

humano, a pesar de su alta afinidad y alta selectividad. Estas proteínas de ratón no fueron bien tolerados por los humanos. Winter inventó

un “protocolo de humanización”, en la que las porciones más antigénicos del anticuerpo monoclonal de ratón se sustituyen por una

secuencia humana invariante. Con la introducción de fago representada anticuerpos humanos, se evita la necesidad de “humanización”.

Papel de copia número de fagos proteínas y multivalente contra presentación monovalente

Algunos estudios han investigado la visualización en la mayor VIII proteína de la cubierta, de los cuales existen alrededor de 2700 copias

a lo largo de toda la longitud del fago filamentoso (90,98). Sin embargo, en la mayoría de bibliotecas de presentación de fagos, los

variados péptidos o proteínas se fusionan proteína III, de los cuales hay hasta cinco copias en la punta del fago. La razón detrás de la

elección de la proteína VIII ha sido maximizar efectos de avidez y para evitar la posible interferencia con la infección por fagos de E. coli

cuando se utiliza la proteína III (90). Lo más común hoy en día, multi-valencia se evita para permitir la clasificación de los fagos en base a la

afinidad en lugar de avidez. Los primeros proteína III construcciones de la biblioteca pueden haber tenido tantas como cuatro a cinco copias del

péptido que aparece en la cuatro a cinco copias de proteínas

III, una característica que puede conducir a la selección basada en la avidez en lugar de afinidad (86,87,99). presentación monovalente, es decir,

un máximo de una copia proteína III por fago, hecha de selección basado en la afinidad posible, y el uso de fagos coadyuvantes elimina cualquier

sesgo infección entre los miembros de la biblioteca. Wells y compañeros de trabajo introducidos presentación en fagos monovalente con el uso de

fagos coadyuvantes en el caso de la hormona de crecimiento humana (hGH; H100). La metodología se ha mejorado aún más para la visualización

de bibliotecas de hGH (J101,102). Otros ejemplos iniciales de presentación de fagos monovalente facilitaron la selección basada en la afinidad de

los miembros de las bibliotecas de anticuerpos (92,93).

16 (24)
Otros formatos de visualización

La presentación en fagos es el primer ejemplo de un método para la evolución de las proteínas de unión, que ofrece un acoplamiento físico del fenotipo

(secuencia de la proteína) y el genotipo (secuencia de ADN). Varios otros métodos de biblioteca de visualización que pareja fenotipo a genotipo desde

entonces se han desarrollado, por ejemplo, presentación en ribosomas (103 104), presentación bacteriana (105) y de presentación en levadura (106).

Aún así, la presentación en fagos sigue siendo la plataforma más ampliamente utilizado para la derivación de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos,

con enorme impacto médico.

Los métodos para la selección de péptidos y proteínas de unión de alta afinidad

El método estándar utilizado para la selección de péptidos o proteínas de unión a partir de bibliotecas de presentación en fagos es en

principio la misma que la purificación por afinidad clásica; aquellos individuos en la biblioteca con la más alta afinidad por una diana se

capturan sobre un soporte sólido, seguido por múltiples y extensas etapas de lavado antes de que los péptidos de unión mejor con sus

fagos conectados se eluyeron con ácido, se neutraliza y se usaron para infectar E. coli para producir una biblioteca enriquecida. La

biblioteca enriquecida contiene así muchas copias de varios péptidos de mayor afinidad y un menor número de copias de péptidos

loweraffinity. Todo el experimento se repite varias veces con intervenir amplificación en E. coli y el aumento sucesivo de la rigurosidad de

la selección mediante la reducción de la cantidad de diana utilizada. La selección de péptidos y proteínas en fagos se realiza típicamente

usando dianas inmovilizadas sobre resinas de cromatografía, placas de Petri, perlas magnéticas u otros soportes. Sin embargo, en los

casos de pantalla celular, es más común el uso de citometría de flujo, en cuyo caso el acontecimiento de unión puede estar acoplado a

una lectura de fluorescencia.

La selección basada en la cinética, la estabilidad o la sensibilidad de la proteasa

Es posible basar la estrategia de selección en las tasas de asociación o de disociación entre los miembros diana y de biblioteca, en

lugar de en la afinidad, por elección cuidadosa de incubación y lavado veces (J3, J4). Al invocar algún tipo de presión de selección tal

como temperatura elevada o la presencia de proteasas, presentación de fagos se puede utilizar para mejorar la estabilidad de la

proteína (J5, J6). En uno de los primeros ejemplos en los que la selección se basa en otras propiedades que la afinidad, un enlazador

se colocó entre la proteína III del fago y hGH. La secuencia de enlazador fue aleatorizado y desafió por la presencia de proteasas

específicas cuando se utilizó receptor de hGH como un cebo; Esto permitió a los determinantes de secuencia de la sensibilidad de la

proteasa frente a resistencia a la proteasa que se determinen (J9).

Aplicaciones y perspectivas

evolución dirigida de proteínas de unión se ha convertido en un protocolo altamente eficiente para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. La

presentación en fagos de péptidos y anticuerpos se utiliza para obtener variantes con alta afinidad por una diana dada, y para proporcionar

información valiosa con respecto a la secuencia de

17 (24)
requisitos y fuerzas impulsoras moleculares para afinidad y especificidad en reacciones de unión, de plegamiento de proteínas y

estabilidad.

La evolución dirigida para mejorar la afinidad de unión al tiempo que conserva la alta selectividad de los anticuerpos se ha utilizado en los

últimos 25 años. Tales procedimientos de “afinidad de maduración” han derivado anticuerpos con afinidades por sus antígenos en el 10 12- 10

15 METRO- 1 variar representa una mejora mil a millón de veces sobre los anticuerpos resultantes de la inmunización, y más tarde a partir de

bibliotecas de presentación de fagos. Tal afinidad muy alta permite su uso como subcutánea, los agentes terapéuticos autoadministración

de, en lugar de requerir grandes cantidades inyectadas por vía intravenosa a la oficina de un doctor.

El anticuerpo terapéutico totalmente humano primero aprobado derivado usando presentación en fagos fue Adalimumab (aprobado

2002). Adalimumab se une con muy alta afinidad a la proteína de TNF-α secretada, una citoquina pro-inflamatoria, y se utiliza en el

tratamiento de la artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal, entre otras condiciones. Una gama de anticuerpos

humanos han sido y serán identificados utilizando la tecnología de presentación en fagos y están en uso clínico contra para las

enfermedades inflamatorias de instancia y cáncer.

Sara Snogerup Linse

Profesor de Física y Química de proteínas Ciencia Molecular de la Universidad de Lund miembro del Comité

Nobel de Química

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