ÍNDICE

I. OBJETIVOS ............................................................................................................... 2
II. FUNDAMENTO TEÓRICO ......................................................................................... 2
III. DATOS Y RESULTADOS ....................................................................................... 5
IV. PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................ 7
4.1. DIAGRAMA DE FLUJO ........................................................................................... 7
4.2. RESULTADOS OBTENIDOS .................................................................................. 9
4.3. OSBSERVACIONES ............................................................................................. 11
4.4. EXPLICACIÓN DE LO OBSERVADO ................................................................... 11
V. CONCLUSION .......................................................................................................... 12
5.1. CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA ..................................................................... 12
5.2. CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA ...................................................................... 12
VI. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 12
VII. ANEXOS ............................................................................................................... 13
¿En qué consiste la cromatografía de Gases/Masas/Masas? ................................... 13
Aplicación en el sector vitivinícola ............................................................................. 14
I. OBJETIVOS

- Entrenar en técnicas de separación e identificación de pigmentos naturales por

cromatografía.
- Conocer las distintas técnicas cromatografías.
- Conocer los fundamentos físico-químicos implicados en los procesos de
separación por cromatografía.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla.
Esta separación se logra utilizando un sistema bifásico: fase estacionaria donde se
retienen los compuestos a separar y fase móvil que desplaza de forma diferencial los
compuestos a través de la fase estacionara.
Dependiendo de la naturaleza de las fases, se pueden distinguir distintos tipos de
cromatografía: (Camargo, 2008)
- Cromatografía sólido-líquido: la fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido
- Cromatografía líquido-líquido: ambas fases son líquidos y en la estacionaria el
líquido se ancla a un soporte sólido.
- Cromatografía líquido-gas: la fase estacionaria es un líquido no volátil sobre
soporte sólido y la fase móvil un gas.
- Cromatografía sólido-gas: la fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

Existen otras clasificaciones para los distintos tipos de cromatografía:

A) En función de la interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y

las fases móvil y estacionaria: (Camargo, 2008)
- Cromatografía de adsorción: se producen interacciones de tipo polar siendo la fase
estacionaria un sólido.
- Cromatografía de partición: la separación se basa en las diferencias de solubilidad
de los componentes de la mezcla entre las dos fases siendo ambas líquidas.
Cuando la estacionaria es menos polar que la móvil se denomina cromatografía en
fase inversa.
- Cromatografía de intercambio iónico: se producen intercambios entre iones
presentes en la fase estacionaria y los del compuesto orgánico solubilizado e
ionizado en la fase móvil
B) En función del tipo de soporte empleado para la fase estacionaria: (Camargo, 2008)
- Cromatografía en columna: utiliza como soporte una columna de vidrio
- Cromatografía en capa fina: el soporte es una placa de vidrio, aluminio o plástico.
La cromatografía se puede emplear para:

Conocer el número de componentes de una mezcla e identificarlos por comparación con

patrones, (Cromatografía Analítica). Separar mezclas de compuestos y como método de
purificación, (Cromatografía Preparativa)
Tanto la cromatografía en columna como la de papel y capa fina de manera general se
clasifican como cromatografía de adsorción. (Gokel, 1985)

En la Cromatografía en columna la fase estacionaria se encierra en una columna de

vidrio. (Ver Figura 1) Se utilizan muchos materiales de empaque que van desde tierra de
diatomeas, resinas sintéticas, sustancias polisacáridos, alúmina o sílica gel. La fase móvil
es por lo general un disolvente o una mezcla de disolventes, que se hacen pasar a través
de la columna, y es seleccionada de acuerdo a la naturaleza de los componentes de la
mezcla que se va a separar. Los líquidos fluidos son colectados en fracciones numeradas
y cada una de las cuales es evaporada y analizada. (Gokel, 1985)

Figura 1 cromatografia en columna (Gokel, 1985)

En la cromatografía en capa fina utiliza sustancias pulverizadas que se adhieren a una

placa de vidrio, plástico o aluminio, debido a que son inertes, resistentes y de fácil
manipulación. Las sustancias que se emplean como fase estacionaria incluyen gel de
sílice, alúmina, sulfato de calcio, polietileno o celulosa en polvo. Sin embargo, en los
laboratorios de Química orgánica la más usada es la sílica gel. La elección del adsorbente
dependerá de las características de las sustancias a separar, en general los compuestos
lipofílicos se separan sobre óxido de aluminio (alúmina) o gel de sílice, y las sustancias
hidrofílicas se separan sobre celulosa.(Gokel, 1985)
 En la cromatografía en papel y en capa fina es importante medir la relación entre la
distancia recorrida por el soluto y la distancia recorrida por el disolvente, denominada Rf.
Si dos compuestos tienen el mismo valor de Rf y éste se obtuvo en condiciones
experimentales similares, se puede considerar que los dos compuestos son iguales.

No todos los compuestos orgánicos a separar por cromatografía de adsorción son

coloridos por lo que para analizarlos es necesario utilizar medios físicos como la radiación
UV o bien medios químicos (sustancias reveladoras) los cuales forman derivados
coloreados o fluorescentes. (Gokel, 1985)

ORDEN DE POLARIDAD DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS:

Ácidos carboxílicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > Ésteres > Aldehídos y
Cetonas > Hc. Aromáticos > Hc. Halogenados > Éteres > Hidrocarburos Insaturados >
Alcanos

Cuanto más polar sea un compuesto más se retendrá en la fase estacionaria. Por
ejemplo, se retiene más un alcohol que un hidrocarburo

ORDEN DE POLARIDAD DE LOS ELUYENTES MÁS HABITUALES:

H2O > CH3-OH > (CH3)2CH-OH > CH3-CN > Dioxano > CH3COOEt > THF > CH2Cl2 >
CHCl3 > CCl4 >
CH3(CH2)4CH3
III. DATOS Y RESULTADOS

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y PELIGROSIDAD

Tabla 1 Propiedades fisicoquímicas y peligrosidad de n-hexano (Scientific)

Descripción: n-hexano C6H14

Propiedades: - Aspecto: Líquido transparente e incoloro.
- Punto de ebullición :60-70°C Punto de fusión : -95°C Punto
de inflamación : -22°C Temperatura de auto ignición :
240°C Límites de explosión (inferior/superior): 0,6 / 7,7 vol.
% Presión de vapor: 17,7 KPa (20°C Densidad (20/4): 0,67
Solubilidad: Insoluble en agua

Peligro: - Fácilmente inflamable. Irrita la piel. Tóxico para los

organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos
negativos en el medio ambiente acuático. Nocivo: si se
ingiere puede causar daño pulmonar. La inhalación de
vapores puede provocar somnolencia y vértigo.
Precauciones: - No inhalar los vapores.
- No permitir el paso al sistema de desagües. Evitar la
contaminación del suelo, aguas y desagües.
- Asegurar una buena ventilación y renovación de aire del
local.
Pictogramas:

Tabla 2 Propiedades fisicoquímicas y peligrosidad de etanol (UNAM, 2010)

Descripción: Alcohol etílico o etanol CH3CH2OH

Propiedades: - Apariencia: Líquido incoloro
- Olor: Ligero a alcohol
- Densidad Relativa a 20°C (Agua): 0.7893
- Punto de ebullición a 760mmHg: 78.5°C
- Temperatura de autoignición: 422°C
- Punto de inflamabilidad (°C): 17c.c.
- Solubilidad: Soluble en agua, alcohol metílico, éter,
cloroformo, acetona y benceno.

Peligro: - Inflamable. Se evapora fácilmente. Sus vapores pueden

formar mezclas explosivas con el aire si se concentran en
 lugares confinados.

Precauciones: - Evitar toda fuente de ignición o calor. Mantener buena

ventilación y los equipos de iluminación o eléctricos deben
ser a prueba de explosión.

Pictogramas:

Tabla 3 Propiedades fisicoquímicas y peligrosidad de acetona (GTM, 2016)

Descripción: Acetona CH3COCH3

Propiedades: - Apariencia: Líquido incoloro
- Olor: Picante, dulce y penetrante
- Densidad Relativa a 20°C (Agua): 0.791
- Punto de ebullición a 760mmHg: 56.2°C
- Temperatura de autoignición: 573°C
- Temperatura de inflamabilidad: 17.8°C
- Solubilidad: Soluble en agua, alcohol etílico, cloroformo y
benceno.
-
Peligro: - Fácilmente Inflamable. Al ser ingerido puede llegar a causar
daños a los riñones cambios metabólicos y coma. En caso
de inhalación, irrita a los ojos, nariz y garganta; originando
dolor de cabeza y náuseas..

Precauciones: - En atmosferas donde exista acetona se utilizaran equipos

de respiración de aire comprimido con visor que cubra toda
la cara. Utilizar guantes de PVC o neopreno y gafas
protectoras.
Pictogramas:
IV. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. DIAGRAMA DE FLUJO

A) CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

B) CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA
4.2. RESULTADOS OBTENIDOS

A) CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

La primera lamina corresponde

a la mezcla de hexano-acetona
(5:1), la segunda lamina
corresponde a la mezcla de
hexano-acetona (3:1) y la última
lamina a n-hexano.

n-hexano n-hexano
n-hexano
acetona (5:1) acetona (3:1)

Y 5.5 5.3 5.5

X1 (amarillo) 5.3 4.4 1

X2 (gris) 1.1 2.4 ____

X4 (verde oscuro) ___ 1.7 ____

X5 (verde pasto) ___ 1.5 ____

𝒅𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒅𝒆𝒔𝒅𝒆 𝒆𝒍 𝒐𝒓𝒊𝒈𝒆𝒏 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐 𝑿

𝑹𝑭 = =
𝒅𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒅𝒆𝒔𝒅𝒆 𝒆𝒍 𝒐𝒓𝒊𝒈𝒆𝒏 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒇𝒓𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒍𝒖𝒚𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒀
 - n –Hexano puro
1
𝑹𝒇 = = 0.182
5.5

- Hexano+Acetona(5:1)
5.3
𝑹𝒇 = = 0.964
5.5
1.1
𝑹𝒇 = = 0.2
5.5

- Hexano+Acetona(3:1)
4.4
𝑹𝒇 = = 0.83
5.3
2.4
𝑹𝒇 = = 0.453
5.3
1.7
𝑹𝒇 = = 0.321
5.3
1.5
𝑹𝒇 = = 0.283
5.3

B) CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

Figura 2 compuesto verdoso Figura 3 compuesto verdoso

intenso (clorofila a) más claro (clorofila b)
4.3. OSBSERVACIONES

A) Cromatografía de capa fina

- En el experimento de cromatografía de capa fina el mecanismo a observar es

la separación de compuestos por medio de su polaridad u apolaridad.
- Usamos una luna de reloj en los vasos de precipitado con las soluciones a usar
debido a que son volátiles.
- En la placa con n-hexano notamos una línea amarilla
- En la placa con n-hexano y acetona (3:1) notamos cuatros líneas
- En la placa con n-hexano y acetona (5:1) notamos dos líneas.

B) Cromatografía de columna

- Se instaló en la parte inferior de una columna de cromatografía una manguera

pequeña y una pinza de Hoffman.
- Se añadió lentamente n-hexano y se observó que se formaron burbujas en la
columna.
- Se observó que, al añadirle alúmina, esta se quedó en la parte superior de la
columna de cromatografía, luego la arena añadida y el n-hexano en la parte
superior.
- Añadimos el pigmento y al conectar el sistema al vacío se observó que el n-
hexano descendía rápidamente.
- Observamos que se formó muy color verdoso leve en la alumina
- Se añadió acetona y comenzó a descender una solución verdosa, un poco más
clara al color del pigmento.

4.4. EXPLICACIÓN DE LO OBSERVADO

- Se eliminaron las burbujas dando pequeños golpes a la columna ya que eso

podría fraccionar la alúmina y no se apreciaría la separación de los
compuestos.
- La alúmina es un absorbente (fase estacionaria) y el n-hexano se comporta
como un eluyente (fase móvil). Los compuestos que se disolverán en la
eluyente poco a poco saldrán de la columna de cromatografía y se recogerán
en fracciones (diferentes tubos de ensayo). Las fracciones menos polares
serán las primeras en salir de la columna, mientras tanto los componentes más
polares seguirán retenidas en el absorbente.
- En el caso de nuestro pigmento no se llegó a una fase amarillenta en el
absorbente ya sea por una mala utilización, es por ello que se le agrego
acetona con la finalidad de aumentar la polaridad para que sean arrancados
otras sustancias presentes.
- Para lograr que la clorofila b traviese la columna se necesitó aumentar la
polaridad añadiendo acetona 100 %
- Cuanto más polar sea un compuesto más se retendrá en la fase estacionaria
V. CONCLUSIÓN

5.1. CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

- Notamos que la primera placa con n-hexano y acetona (5:1) aparecen dos
líneas una amarilla y la otra grisácea; indican la presencia de xantofilas
- Notamos que en la segunda placa con n-hexano y acetona (3:1) aparece el
color amarillo, grisáceo y diferentes tonos de verde estos colores nos indicas la
presencia de xantofilas y diferentes tipos de clorofila.
- Notamos que en la tercera placa con n-hexano aparece el color amarillo esto
nos indica la presencia de xantofilas, ya que estas presentan grupos oxidrilos.
- La cromatografía en capa fina es muy eficaz si queremos observar ciertas
moléculas en una mezcla o solución.
- Cuanto es más afín la molécula con la solución a usar va aparecer más rápidos
que los otros compuestos debido a su polaridad con esta sustancia.

5.2. CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

- La cromatografía en columna es un método donde aparte de separar, también

sirve para purificar diferentes compuestos orgánicos como se puedo apreciar
en la experiencia.
- Se concluyó que la polaridad de los pigmentos varia siendo los no polares los
carotenos y los xantafilas (estos no logramos visualizarlos en esta experiencia),
siguiendo luego del polar que es la clorofila a y el más polar que es la clorofila
b. Se concluyeron estos compuestos orgánicos experimentalmente a base de
los colores de las diferentes fracciones recolectadas.

VI. BIBLIOGRAFÍA

Camargo, M. (2008). Laboratorio de Química Orgánica Aplicada. Mexico D.F.

Gokel, D. y. (1985). Química Orgánica experimental. Reverte.

VII. ANEXOS

LA APLICACIÓN DE NUEVAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS EN LOS

ANÁLISIS VITIVINÍCOLAS

La calidad, la seguridad y la investigación son seguramente los aspectos más exigentes

de la industria alimentaria actual. Este sector ha evolucionado de tal manera que los
controles de calidad que tenemos hoy en día, permiten cada vez más a las industrias
conocer al detalle los alimentos que producen y garantizar su seguridad alimentaria.

Estas exigencias alimentarias se han cumplido gracias al desarrollo de la tecnología en la

instrumentación de análisis de los laboratorios de calidad e investigación. El avance
realizado en los equipos de medición ha permitido a los técnicos especialistas determinar
las concentraciones de compuestos a nivel de trazas, actualmente podemos medir
cantidades de compuestos que se encuentran a niveles de nanogramos (milmillonésima
parte de un gramo) o picogramos (billonésima parte de un gramo) en los diferentes
alimentos.

Tecnologías muy avanzadas como la cromatografía de gases acoplada a la

Espectrometría de Masas que anteriormente solo encontrábamos en los grandes centros
de investigación o en las universidades, ahora forman parte del trabajo rutinario en los
departamentos de calidad de las empresas de alimentación.

En el Instituto Catalán del Corcho hemos adquirido la última de las novedades en

instrumentación para la determinación de compuestos volátiles y semivolátiles en
alimentos: la cromatografía de gases con detección de espectrometría de masas/masas.

¿En qué consiste la cromatografía de Gases/Masas/Masas?

La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas tradicional ha sido la

herramienta utilizada hasta el momento para separar, identificar y cuantificar los
compuestos volátiles de mezclas complejas, tales como alimentos, productos vinícolas o
muestras vegetales. La detección con espectrometría de masas se basa en fragmentar
con energía los compuestos que salen de la columna del cromatógrafo en fragmentos
masa/carga, característicos para cada compuesto.

Este tipo de cromatografía de gases se ha perfeccionado acoplándose a un

espectrómetro de masas con triple cuádruplo; este sistema de detección consiste, en vez
de hacer una fragmentación de los compuestos, en hacer dos fragmentaciones a través
de una célula de colisión. Este revolucionario sistema funciona de manera que una vez
realizada la primera ionización del compuesto permite aislar un ión en la cela de colisión,
eliminando otros posibles iones que interferirían en la detección. Y seguidamente se
realizará una segunda fragmentación más específica que la primera mediante la colisión
con un gas inerte. El modo de adquisición en que trabaja el tándem se denomina MRM
(Monitoreo de Reacciones Múltiples), este modo permite en el análisis cuantitativo de alta
sensibilidad minimizar al máximo los interferentes y trabajar de manera selectiva en
matrices complejas.

Aplicación en el sector vitivinícola

La unión de la SPME con la cromatografía de Gases Masas/Masas ha abierto un abanico

de posibilidades inmensas que en el Instituto Catalán del Corcho hemos desarrollado para
la cuantificación de aromas en vino.

La complejidad del vino está en consonancia con su complejidad química; podemos

encontrar compuestos de familias químicas muy diferentes (ésteres, aldehídos, cetonas,
terpenos, alcoholes, etc.). El aroma del vino es el resultado de interacciones complejas
entre muchos de estos compuestos con olor; se sabe que en un mismo vino puede llegar
a encontrarse hasta 800 compuestos volátiles. Las notas sensoriales aparecen como
consecuencia de las acciones concertadas de muchas moléculas y, sorprendentemente,
en muchos casos estas moléculas se encuentran en concentraciones muy cercanas o
incluso por debajo de su umbral de percepción. A veces un cierto aroma no es debido a
un solo compuesto sino a la suma de diferentes compuestos que a baja concentración
pueden dar una misma nota aromática.

La cantidad y variedad de compuestos aromáticos que podemos encontrar depende de

muchos factores: la naturaleza de la uva, la variedad genética, la madurez, el suelo, el
clima, las levaduras usadas en el proceso de fermentación, el tipo de envejecimiento y
almacenamiento, etc. La cromatografía de Gases Masas/Masas nos permite medir la
evolución de la concentración de estos compuestos de una manera mucho más precisa y
selectiva que hasta ahora. La separación de los compuestos conseguida entre la suma de
la cromatografía y la detección en tándem es tan alta, que el ruido del cromatograma final
es mínimo, hecho que nos permite detectar compuestos que hasta ahora pasaban
desapercibidos debido a su baja concentración. Gracias a este hecho podemos
correlacionar mucho mejor los resultados obtenidos de la cromatografía con los resultados
de los análisis sensoriales y catas que realizamos día a día.
Las aplicaciones de la técnica son infinitas, por citar algunos ejemplos:

 Evolución de los compuestos terpénicos (linalol, geraniol, α-terpineol...) durante la

fermentación y su evolución desde su origen, la uva, al producto final.
 Cuantificación de los compuestos aromáticos que aportan las barricas de madera
al vino: furfural, metil-furfural, vainillina, whiskylactona…
 Evolución de los compuestos de oxidación y reducción del vino en el
envejecimiento y posterior embotellado.
 Determinación de compuestos off-flavors, para lograr eliminar al máximo la
presencia de estos compuestos incluso por debajo de su umbral de percepción.
 Influencia del tipo de cierre en la evolución del vino a largo plazo.
Las posibilidades son tan elevadas que sería imposible nombrarlas todas, ya que como
bien sabemos, cada vino tiene su identidad y características aromáticas particulares que
podemos asociar a diferentes compuestos químicos.

En esta línea, el Instituto Catalán del Corcho a través de proyectos de investigación o de

análisis de protocolos de calidad para las empresas, estamos desarrollando todas estas
aplicaciones gracias a nuestra experiencia de más de 20 años en cromatografía de gases.

En resumen, la última innovación en tecnologías de análisis que nos ha ofrecido el

mercado de la instrumentación química, la cromatografía de Gases Masas/Masas, nos
está permitiendo conocer, separar y cuantificar con más precisión y fiabilidad que nunca
los compuestos que forman la complejidad aromática de los diferentes vinos; con el
objetivo final de poder tener productos más adecuados y acordes con las preferencias de
los consumidores cada día más exigentes en el momento de escoger los vinos que
acompañan sus comidas.