QUÍMICA BIOLÓGICA

TRABAJO DE LABORATORIO Nº 1:

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

DOCENTES: Dante Maugeri y Paula Iribarren

Introducción:

Descripción de los métodos más utilizados:

1) Espectrofotometría UV:

a) Absorbancia a 280 nm

La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a 280 nm.
Los grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos
(Tirosina y Triptofano).

Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar
de acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se
puede considerar que una unidad de absorbancia se corresponde con una
concentración (C) de 1mg/ml de proteinas:

Abs280nm . E280nm = C, si E280nm se considera = 1

Abs280nm ≡ 1 mg/ml

Si la solución de proteínas contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la

medición, dado que estos absorben a 280 nm.

b) Absorbancia a 205-210 nm

A dicha longitud de onda absorbe la unión peptídica, por lo tanto es un método

más sensible y no dependiente de los aminoácidos que componen la proteína en
estudio.
La limitación de esta técnica esta dada porque la mayoría de los buffers
utilizados también absorben a esa longitud de onda.

1
 2) Método de Lowry:

Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen
a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose
los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la
reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por
los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-
Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por
los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Al producirse dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede

ser cuantificado determinando la absorbancia a 660 nm.

El rango adecuado es de entre 5 a 100 microgramos de proteína.

2
 Existe una amplia lista de sustancias (como buffers, detergentes, lípidos, etc.)
que interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinación de la C real. La
solución a este problema se consigue por precipitación de las proteínas y resuspensión
en un buffer sin interferentes.

3) Método de Biuret:

Es un método más rápido y menos engorroso que el de Lowry. La reacción debe

su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-
NH2), que es la más sencilla que da positiva la reacción. Bajo condiciones alcalinas,
sustancias conteniendo dos o más uniones peptídicas forman un complejo púrpura con
sales de cobre, al igual que en la primera etapa del método de Lowry.

Tiene muy pocos agentes interferentes (uno de ellos es el sulfato de amonio). Es

un método menos sensible que el de Lowry por lo que requiere mayor cantidad de
muestra.

El rango adecuado usando 1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.

4) Método de Bradford: método por unión de colorantes

En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden

interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a
precipitados con un color característico.

Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G-

250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de
color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los
grupos amino de las proteínas.

Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación
lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas.

3
 Este método es muy rápido, barato y sensible y se puede trabajar en un rango de
1 a 25 microgramos para un volumen de 1 ml.

Interfieren en el ensayo detergentes y las soluciones alcalinas.

Materiales y Métodos:

• Espectrofotómetro y cubetas adecuadas

• Estándar de proteínas con concentración conocida: 10 mg/ml de Seroalbúmina bovina
(BSA) para Biuret y 0,1 mg/ml de BSA para Bradford.
• Muestras de concentración desconocida (muestras incógnitas)
• Ensayo de Biuret:
La fórmula del reactivo de Biuret es la siguiente:

2,25g de tartrato de sodio y potasio (PM 282,22); 0,75g de sulfato cúprico x 5 H2O (PM
249,68); 1,25g de ioduro de potasio (PM 166,0), todo disuelto en este orden en 100 ml
de NaOH 0,2M. Llevar a volumen a 250 ml con agua destilada.

Método:
Añadir a 0,1 ml de muestra 0,9 ml de reactivo. Mezclar y dejar a temperatura ambiente
20 minutos. Leer a 550 nm e interpolar en una curva estándar.

• Ensayo de Bradford:

Reactivo de Bradford: 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 se disuelven en 50

ml de etanol y 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Se ajusta el volumen a 1 litro con agua
y se filtra. Estable por 2 meses.

Microensayo: las muestras se llevan a 800 microlitros con agua, se agrega 0,2 ml de
reactivo de Bradford, se agita y se deja 5 min a temp ambiente.
Leer a 595 nm e interpolar en una curva estándar.

4
 TRABAJO PRÁCTICO

Objetivos:

Determinar la concentración de proteínas presentes en distintas muestras

mediante el método de Biuret y el de Bradford utilizando curvas de calibración
adecuadas. Caracterizar aminoácidos presentes en una muestra mediante una
cromatografía radial en papel.

1º Parte:

Curva estándar y muestra incógnita utilizando el ensayo de Biuret:

A) Preparación de la curva estándar:

1) Se parte de una solución de albúmina bovina de concentración 10 mg/ml.

Calcular la cantidad que se debe añadir de esta solución tal que por tubo se tengan 0
(blanco), 2, 4, 6, 8 y 10 miligramos de proteína para realizar el ensayo según fue
explicado en materiales y métodos. La siguiente tabla sirve de guía:

mg de BSA l H2O (l) Biuret (l)

0,0 0 100 900
0,2 c.s.p 100 900
0,4 c.s.p 100 900
0,6 c.s.p 100 900
0,8 c.s.p 100 900
1,0 c.s.p 100 900
(c.s.p = cantidad suficiente para)

2) Mezclar e incubar 20 min a Tº amb.

3) Leer Abs a 550nm.
NOTA: Llevar a cero el espectrofotómetro con agua.

5
mg de BSA Abs 550 nm
(corregida)
0,0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

4) Graficar Absorbancia en función de mg de proteína. Calcular la pendiente de

la curva teniendo en cuenta solo los puntos que entran en el rango lineal. (¿Por qué ?).
Calcular el factor “f”.

B) Averiguar la concentración de la muestra incógnita:

Cada grupo recibirá una solución de proteínas de concentración desconocida.

Efectuar la determinación en simultáneo con la curva estándar e interpolar esos datos en
dicha curva para averiguar la concentración (utilizando el factor “f”). Corregir con el
factor de dilución si fuera necesario.

2º Parte:

Curva estándar y muestra incógnita utilizando el ensayo de

Bradford:
A) Preparación de la curva estándar:

Se realizará una curva estándar similar a la realizada para Biuret pero teniendo
en cuenta que el rango óptimo para el ensayo es diferente. La solución de BSA estándar
utilizada tiene una concentración de 0,1 mg/ml. Utilizar como guía la siguiente tabla:

g de BSA l H2O (l) Bradford(l) Abs 595nm

0 0 800 200
2 c.s.p 800 200
4 c.s.p 800 200
7 c.s.p 800 200
10 c.s.p 800 200
25 c.s.p 800 200

Luego de agregar el reactivo de Bradford agitar e incubar a Tº amb 5’.

Leer Abs a 595nm

6
Graficar Absorbancia en función de g de proteína, calcular la pendiente de la curva y
el factor “f”.

B) Averiguar la concentración de la muestra incógnita:

Realizar diluciones de la muestra y extrapolar esos datos en la curva estándar

utilizando el factor “f” para averiguar la concentración.

3º Parte:

Cromatografía radial de aminoácidos (en papel)

Varios factores son importantes en la separación de sustancias por cromatografía en

papel; entre ellos hay que citar la partición, la adsorción y en algunos casos, el intercambio
iónico. El tipo de fenómeno principal que promueve la separación es la partición continua
líquido-líquido entre la fase estacionaria adsorbida sobre el papel (agua) y el solvente (fase
móvil) que lo atraviesa movido por fuerzas de capilaridad. Pero el papel no es un soporte
totalmente inerte y debido a eso hay cierta intervención de los fenómenos de adsorción e
intercambio iónico en el proceso separativo.
El soluto se mueve en la dirección de flujo del solvente a una velocidad que está
determinada por su afinidad por la fase acuosa estacionaria o por la fase orgánica móvil no
polar. Además influyen en la velocidad de migración: el peso molecular, tipo de papel
empleado, tamaño y saturación de la cámara, temperatura, etc.
Se han ideado muchas técnicas para llevar a cabo la cromatografía en papel. La
cromatografía circular tiene muchas ventajas para el trabajo rutinario de laboratorio,
especialmente la simplicidad del aparato necesario, la velocidad de desarrollo y el poder
comparar al mismo tiempo distintas muestras. Con este propósito se han usado distintas
técnicas; en la que se usará en este T.P. se dispone el papel de filtro horizontalmente y de él
cuelga una especie de mecha que sirve como capilar para el solvente y que está conectada
con el centro del papel.
Placa de Petri

Disco de papel

Solvente
Mecha

7
 Objetivo de la experiencia

Separar los componentes de una mezcla de aminoácidos por cromatografía radial

sobre papel.

Materiales y reactivos

1) Disco de papel Whatman N°1, de 12,5 cm de diámetro.

2) Caja de Petri
3) Mecha (hilo de algodón)
4) Solución de tirosina 0,05%
5) Solución de leucina 1,0%
6) Solución de arginina 1,0%
7) Solvente de desarrollo: butanol normal: NH3 28% (v/v):etanol 96° (10:4:3 v/v)
8) Micropipetas
9) Revelador: solución al 0,2% de ninhidrina en acetona.

Procedimiento

Determinar el centro del disco de papel y trazar un círculo de aproximadamente 2,5

cm de diámetro a partir del centro, usando lápiz de grafito. Con lápiz y regla dividir el
papel en cuadrantes.
Hacer un pequeño agujero o un corte en el centro del papel para insertar la mecha,
de unos 5 cm.
En el borde del disco escribir el nombre del operador y en cada cuadrante: Tyr, Leu,
Arg y mezcla.

1. Siembra

Usando una micropipeta limpia para cada solución tirar una línea con la misma a lo
largo de la circunferencia antes trazada ( o verter el contenido en su centro) con
aproximadamente 0,02 ml, de forma que a cada lado de las líneas que separan los
cuadrantes queden unos 0,5 cm sin solución. Dejar secar las aplicaciones.

2. Colocación del solvente

Preparar el solvente de desarrollo y colocar cantidad suficiente para que alcance en

el compartimiento inferior una altura aproximada de 1 cm.

3. Colocación del papel

Sobre la caja de Petri que contiene el solvente se apoya el papel de modo que la
mecha se sumerja en el solvente y se cierra la caja.

8
 4. Desarrollo

El desarrollo se hace a temperatura ambiente hasta que el solvente llegue al borde

de la caja de Petri.

5. Secado del papel

Sacar el papel, marcar el frente del solvente y secar en estufa a 55-60°C.

6. Revelado

Se impregna el papel con la solución de revelador. Se deja secar al aire (bajo

campana) y luego en estufa a 55-60°C durante aproximadamente 15 minutos (hasta
aparición de las manchas).
Calcular los Rf a partir del centro de cada zona. Comparar los de la muestra
incógnita con los patrones.

Rf = distancia desde el centro de la mancha al origen

distancia desde el frente del solvente al origen

Informe:

 Objetivos.
 Curvas de calibración: tabular y graficar las curvas estándares y explicar cuáles
fueron los puntos que se consideraron al trazar la recta y averiguar su pendiente
y el factor “f”.
 Averiguar la concentración de proteínas presente en las muestras incógnitas.
 Detallar brevemente conclusiones respecto a la especificidad, simplicidad,
linealidad, sensibilidad y limitaciones de los métodos desarrollados.
 Determinar el Rf de las soluciones estándares y de las muestras problemas.
 Discutir cualquier dificultad o resultado inesperado que se pudo haber
presentado.

Lecturas recomendadas:

Bradford, M.M. (1976) Analytical Biochem. 72, 248-254.

Gornall, A.G.; Bardawill, C.J.; David, M.M. (1949) J.Biol. Chem. 177, 751-766.
Peterson, G.L. (1979) Analytical Biochem. 100, 201-220.