QUÍMICA BIOLÓGICA

Trabajo Práctico Nº2: Cinética Enzimática

Estudio cinético de la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

Las enzimas son catalizadores biológicos, en la mayoría de los casos de

naturaleza proteica. Una enzima (E) se une a un determinado sustrato (S) para dar
un complejo enzima-sustrato (ES), el cual se descompone para dar la enzima libre
(E) y un producto (P).

La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son

catalizadas. Las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilización del
estado de transición, disminuyendo así la energía de activación, en consecuencia
la velocidad de la reacción aumenta y aunque el equilibrio de esas reacciones no
cambia, es alcanzado rápidamente.
 La cinética enzimática es la rama de la enzimología que trata de los
factores que afectan a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

Los factores más importantes son:

 Concentración de enzima
 Tiempo de incubación
 pH
 Fuerza iónica
 Temperatura
 Concentración de sustratos
 Concentración de inhibidores
 Concentración de activadores

Antes de analizar estos factores, debemos definir la velocidad de una

reacción catalizada por una enzima como la cantidad de sustrato consumido o la
cantidad de producto generado en la unidad de tiempo en una mezcla de reacción
que contenga la enzima y los constituyentes necesarios para que la reacción
proceda.

Si se grafica consumo de sustrato o aparición de producto en función del

tiempo de reacción enzimática, se obtiene una curva cuya pendiente en cada
punto es numéricamente igual a la velocidad de reacción en ese instante.

En la mayoría de las racciones enzimáticas es posible, acortando

suficientemente los períodos de medida de la reacción, obtener una zona inicial
donde el consumo de sustrato o la aparición de producto es función lineal del
tiempo. En esta zona la pendiente es constante y en consecuencia la velocidad en
cualquier instante es la misma. La pendiente de la zona lineal se denomina
“velocidad inicial”. En la práctica se considera que se está en condiciones de
velocidad inicial cuando la cantidad de sustrato consumido es a lo sumo el 5% del
inicial. Todas las ecuaciones de cinética enzimática han sido desarrolladas
suponiendo que lo que se mide es la velocidad inicial. Por este motivo la
determinación del tiempo de incubación en el que es posible medir la velocidad
inicial es un paso indispensable en el estudio de cualquier enzima.

Factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas

Analizaremos algunos de ellos.

a) Concentración de Enzima:

La siguiente figura muestra el comportamiento de la cantidad de producto

formado en función del tiempo de incubación. Además se muestran varias curvas
correspondientes a diferentes concentraciones de enzimas en órdenes crecientes
desde E1 a E4. Todas estas curvas muestran que a tiempos cortos la velocidad de
la reacción es igual a la velocidad inicial. A tiempos largos, la cantidad de producto
formada se mantiene constante, es decir, se llegó al equilibrio.

El primer objetivo que debe cumplirse en la caracterización de una enzima

es asegurarnos que existe una relación lineal entre la concentración de enzima
presente en una muestra y la velocidad de la reacción catalizada por la misma, a
una concentración de sustrato dada. Esta relación lineal entre concentración de
enzima y velocidad inicial se observa en el gráfico hasta llegar a una
concentración de enzima tal que el sustrato comienza a transformarse en reactivo
limitante y se pierde la proporcionalidad.
 b) Tiempo de incubación:

En la siguiente figura se muestran las variaciones de las concentraciones

de S, P, E y ES con el tiempo.

Inicialmente existe un estado pre-estacionario, período muy corto en

donde se observa un aumento de la concentración de ES. Un estado
estacionario donde ES se mantiene constante con el tiempo. Finalmente un
estado de equilibrio donde la velocidad de interconversión entre S y P se hace
constante.

Por lo tanto, la siguiente consigna es determinar el tiempo de incubación de

la reacción durante el cual nos encontramos en condiciones de velocidad inicial. Si
bien este tiempo debería coincidir con el tiempo correspondiente al del estado
estacionario, en la práctica es más corto debido a otras variables, como por
ejemplo la inestabilidad térmica de la enzima o el incumplimiento de la ley de
Lambert – Beer cuando se usa un método espectrofotométrico.

c) Efecto del pH:

Cambios moderados de pH afectan el estado iónico de la enzima y con

frecuencia también del sustrato. Muchas de las enzimas presentan actividad
máxima a pH fisiológico (entre 5 y 9), como la tripsina, mientras que otras tienen
un pH óptimo bastante alejado de estos límites, como la pepsina. A valores
extremos de pH se produce desnaturalización de la enzima.
 d) Efecto de la temperatura:

La velocidad de cualquier reacción química depende de la frecuencia de las

colisiones entre las moléculas reaccionantes, que deben hacerlo con una
orientación adecuada. Además, la energía cinética de las moléculas depende de la
temperatura. La energía mínima necesaria para que se produzca la reacción se
llama energía de activación (Ea).

La relación entre Ea y la temperatura se denomina ecuación de Arrhenius, y

es:

k = A exp(-Ea/RT)
donde k es la constante de velocidad, A es una constante, R es la constante
de los gases y T la temperatura absoluta. La forma logarítmica es:

lnk = lnA – Ea/RT

A concentraciones constantes de reactivos, la constante de velocidad
puede sustituirse por velocidad, ya que v es proporcional a k, de manera que
midiendo la velocidad a distintas temperaturas puede determinarse Ea.
 Otro paso importante en la caracterización de una enzima es la determinación
de la temperatura óptima de la reacción que cataliza. Debe tenerse en cuenta que
las enzimas son moléculas proteicas y, si absorben demasiada energía, su
estructura terciaria se rompe y la enzima se desnaturaliza y pierde actividad
catalítica. Así, al aumentar la temperatura, el aumento esperado de v debido al
aumento de las colisiones E + S es contrarrestado por el aumento en la velocidad
de desnaturalización. Por lo tanto, una representación de v frente a T
generalmente muestra un pico denominado temperatura óptima.
 Además de la temperatura de reacción óptima es importante caracterizar la
estabilidad térmica de la enzima preincubándola a distintas temperaturas durante
distintos tiempos y midiendo la velocidad de la reacción a una temperatura
estándar, como por ejemplo, 30ºC.

e) Concentración de sustrato:

Si la enzima se encuentra presente en cantidades catalíticas, es decir,

[S]>>[E], entonces inmediatamente después de mezclar E y S se alcanza un
estado estacionario en el que la concentración de ES permanece constante con el
tiempo. Así, puede deducirse la ecuación de Michaelis Menten:

v = Vmax [S] / (KM + [S])

donde v es la velocidad inicial a una [S] dada; Vmax es la velocidad inicial a una
concentración saturante de S, es decir, cuando toda la enzima se encuentra como
complejo ES y KM es la constante de Michaelis-Menten que es la concentración de
S a la cual v es igual a la mitad de la Vmax y es una medida inversa de la afinidad
de la enzima por el sustrato. Existen varias transformaciones lineales de esta
ecuación que permiten la estimación de los parámetros cinéticos KM y Vmax. Una
de las más útiles es la de Lineweaver-Burk.
Objetivos del TP: Realizar un estudio cinético de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae determinando el efecto de distintas
variables sobre la velocidad inicial de la reacción.

Glucosa-6-Fosfato + NADP+ 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+

Materiales y métodos:

 Pipetas automáticas

 Cubetas de 100 ul

 Recipiente con hielo granizado

 Baño termostatizado

 Espectrofotómetro

 Solución amortiguadora trietanolamina 0,2 M, pH 7,5

 MgCl2 0,1 M

 Glucosa-6-fosfato 40 mM

 NADP+ 50 mM

 Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Candida utilis, solución

saturada en sulfato de amonio

Se trabajará utilizando mezclas de reacción conteniendo en todos los casos

solución amortiguadora trietanolamina 50 mM final, pH 7,5 y MgCl2 5 mM final
como activador y los sustratos glucosa-6-fosfato y NADP+ y la enzima a las
concentraciones que se especifican en cada apartado.

Se utilizará un método espectrofotométrico contínuo cuantificándose la

producción de NADPH en la unidad de tiempo, el cual absorbe a 340 nm (εM =
6220 M-1 cm-1 ).

A) Concentración de enzima:

Se efectuarán medidas de v usando distintos volúmenes de la preparación

enzimática en el ensayo. A partir de estas mediciones se determinará el rango de
linealidad entre la v y la concentración de enzima y el tiempo durante el cual la
variación de absorbancia se mantiene lineal durante el ensayo. Esto permitirá
seleccionar el volumen de enzima adecuado para efectuar las siguientes
mediciones del trabajo práctico.

B) Determinación de los parámetros cinéticos:

Se medirá la velocidad inicial a concentraciones variables de uno de los

sustratos y saturantes del cosustrato y viceversa. A partir de estos valores se
graficará la v en función de la concentración de cada sustrato (gráfico directo de
Michaelis-Menten) y la inversa de v en función de la inversa de la concentración
de cada sustrato (gráfico de Lineweaver-Burk). Determinar los parámetros
cinéticos.

C) Efecto de la temperatura sobre la velocidad:

Se medirá la v inicial a distintas temperaturas de incubación y se

determinará la T óptima. Se estudiará la linealidad de la reacción a temperaturas
elevadas para tener una idea de la estabilidad térmica de la misma. Utilizando la
transformación lineal de la ecuación de Arrhenius determinar la energía de
activación.

Definiciones útiles

Velocidad de una reacción enzimática: Es la cantidad de sustrato (umoles)

convertido en producto en la unidad de tiempo (min), bajo condiciones definidas.
Puede expresarse de diferentes maneras: umoles/min, umoles/min/ml de mezcla
de reacción o en umoles/min/mg de proteína presente en la mezcla de reacción.

Unidad de enzima (U): Es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1

umol de sustrato en producto por minuto, bajo condiciones definidas.

Actividad enzimática (U/ml): Representa las unidades de enzima por ml de

preparación enzimática. Es una medida de la concentración de enzima
catalíticamente activa.

Actividad específica (U/mg): Representa las unidades de enzima por mg de

proteínas presentes en la preparación enzimática. Puede calcularse dividiendo la
actividad enzimática (U/ml) por la concentración de proteínas (mg/ml).

Número de recambio o kcat (min-1 ó seg-1): Es el número de moles de sustrato

transformados en la unidad de tiempo por mol de subunidades enzimáticas (o mol
de centros activos). Es una manera de expresar la Vmax en preparaciones
enzimáticas puras.

Eficiencia catalítica (kcat / KM): Es la relación entre el número de recambio y el

KM.

Modelo de informe

1) Objetivos del trabajo práctico.

2) Plantee la reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

3) Grafique la variación de absorbancia a 340 nm en función del volumen de

enzima utilizada en la medida. Defina el rango de linealidad que puede utilizar y el
tiempo máximo de cada medida.

4) Calcule las velocidades iniciales a las concentraciones variables de cada

sustrato (glucosa-6-fosfato y NADP+). Con estos datos realice el gráfico directo de
Michaelis-Menten y alguno de las representaciones lineales, como por ejemplo, la
de Lineweaver-Burk. Determine los parámetros cinéticos de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae ( Vmax y KM ) respecto de sus
sustratos.

5) ¿Considera que se encuentra en condiciones de velocidad inicial? Considere

que se está en condiciones de velocidad inicial cuando no se ha consumido más
del 5% de cada sustrato.

6) Realice una búsqueda en PUBMED de valores de bibliografía de KM, si es

posible del mismo organismo y de otros organismos relacionados y no
relacionados y compárelos con los valores que usted obtuvo.

7) Realice una curva de velocidad en función de la temperatura y obtenga si fuera

posible la temperatura óptima. ¿Qué puede decir de la estabilidad térmica de la
enzima? Efectúe la representación lineal de la ecuación de Arrhenius y obtenga la
energía de activación.

8) Realice una búsqueda bibliográfica y trate de obtener valores de la energía de

activación del mismo y de otros organismos. ¿Cuál será la energía de activación
de la reacción en ausencia de la enzima?¿Qué efecto tendrá ello sobre la
velocidad de la reacción?

9) Discusión.