2.3.

Evaluación de organismos marinos con

potencial bioactivo
2.3.4. Cultivo optimizado de aislados de microalgas con potencial uso
en la industria

Imágenes microorganismos aislados y trabajo en laboratorio.

INFORME TÉCNICO FINAL –BPIN 2017

Investigación básica y aplicada de los recursos naturales renovables y del medio
ambiente en los litorales y ecosistemas marinos y oceánicos de interés nacional

Santa Marta D.T.C.H., Enero de 2018

Directivos de INVEMAR  Preparado por: 
Francisco Armando Arias Isaza  Programa Valoración y Aprovechamiento de 
Director General  Recursos Marinos y Costeros ‐ VAR 
   
Jesús Antonio Garay Tinoco  Línea de Bioprospección Marina ‐ BIM 
Subdirector Coordinación   Javier Gómez‐León. PhD. Biólogo Marino 
Científica ‐ SCI  Lina Marcela Blandón. PhD. Ingeniera Biológica 
  Marisol Santos‐Acevedo. MSc. Bióloga 
Sandra Rincón Cabal  Eylin Jiménez‐Vergara. MSc. Química 
Subdirectora Administrativa ‐ SRA  Laura Jutinico. MSc. Química 
  Katerine Carreño. MSc. Bióloga Marina 
Coordinadores área misional.  Marynes Quintero. Microbióloga 
  Anyela Velásquez. Microbióloga 
David Alonso Carvajal  Diana García. Microbióloga 
Coordinador Programa Biodiversidad y  Mayra Ávila. Bióloga 
Ecosistemas Marinos – BEM  Miguel Antonio Sánchez. Auxiliar de laboratorio
  Juan Manjarrez. Auxiliar de laboratorio 
Constanza Ricaurte Villota  Christian Cortes. Auxiliar de laboratorio 
Coordinadora Programa Geociencias   
Marinas ‐ GEO 
 
Mario Rueda Hernández 
Coordinador Programa Valoración y 
Aprovechamiento de Recursos Marinos ‐ 
VAR 
 
Luisa Fernanda Espinosa  
Coordinadora Programa Calidad  
Ambiental Marina ‐ CAM 
 
Paula Cristina Sierra Correa 
Coordinadora de Investigación e 
Información para Gestión Marina y 
Costera ‐GEZ 
 
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Científicos ‐  CSC 

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
Informe Técnico Final BPIN-2017

TABLA DE CONTENIDO

2.3.4. Cultivo optimizado de aislados de microalgas con potencial uso en la industria ...................... 1 
-  -Resumen........................................................................................................................ 1 
-  Introducción ................................................................................................................... 1 
-  Objetivo general ............................................................................................................ 2 
-  Objetivos específicos ...................................................................................................... 2 
-  Marco conceptual .......................................................................................................... 2 
Microalgas ......................................................................................................................... 2 
Metabolitos secundarios y su actividad biológica................................................................. 3 
Medio de cultivo F/2 de Guillard........................................................................................ 4 
-  Metodología.................................................................................................................. 5 
Limpieza, desinfección y organización del cepario de microalgas ......................................... 5 
Preparación de medio F/2 de Guillard ................................................................................ 6 
Preparación placas de agar ................................................................................................. 6 
Métodos de aislamiento de microalgas ............................................................................... 7 
Aislamiento por rayado en agar por agotamiento ........................................................... 8 
Aislamiento por dilución ................................................................................................ 8 
Aislamiento por pipeteo................................................................................................. 9 
Purificación de las cepas microalgales............................................................................. 10 
-  Resultados y discusión .................................................................................................... 11 
Métodos de aislamiento .....................................................................................................11 
Rayado en agar por agotamiento ...................................................................................11 
Aislamiento por pipeteo................................................................................................ 14 
Aislamiento por dilución ............................................................................................... 16 
Purificación de las cepas ................................................................................................ 16 
-  Conclusiones ................................................................................................................. 17 
-  Perspectivas .................................................................................................................. 17 
-  Bibliografía ................................................................................................................... 18 
 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
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2.3.4. Cultivo optimizado de aislados de microalgas con potencial uso

en la industria

- -Resumen
Las microalgas marinas son los principales productores primarios de los ecosistemas
marinos, y por su enorme diversidad taxonómica, representan un reservorio de
moléculas y metabolitos con potencial aplicación biotecnológica. Con el fin de
aislar, identificar, caracterizar y evaluar la actividad de compuestos producidos por
algunas microalgas, se revisaron muestras de fitoplancton y bentos de cinco bahías
de la zona costera de Santa Marta: El Rodadero, Santa Marta, Taganga, Chengue y
Playa Cristal (Neguanje), las dos últimas hacen parte del Parque Nacional Natural
Tayrona (PNNT). Se probaron tres técnicas de aislamiento de microalgas,
obteniendo resultados satisfactorios empleando la técnica de rayado en agar por
agotamiento, a partir de una muestra tomada en Playa Cristal, específicamente, de
Thalassia testudinium. Se aislaron seis especies de microalgas, cinco de ellas
diatomeas de los géneros Neodelphineis, Halamphora, Navicula, Psammodictyon y
una cepa de la Clase Bacillariophyceae, así como una cianofícea del género
Microcystis proveniente de la bahía de Taganga. Se está realizando el proceso de
purificación y completa identificación taxonómica de las cepas.

- Introducción
Las microalgas marinas componen un importante porcentaje de las comunidades
planctónica y bentónica. Son responsables del 45% de la producción primaria neta
anual del planeta y de la oxigenación marina, ubicándose en la base de las redes
tróficas, representando un 1% de la biomasa fotosintética (Velásquez, 1967; Suthers
y Rissik, 2009; Lozano-Duque et al., 2011, Taylor, 1987, Lozano-duque 2011).
Durante décadas, las microalgas han sido utilizadas como modelo biológico en la
investigación, por su flexibilidad metabólica, características fisiológicas y potenciales
aplicaciones que abarcan las áreas ambientales, biológicas y económicas (En
Rodríguez et al., 2015).
Si bien las microalgas han sido cultivadas, principalmente, como alimento en la
producción de crustáceos y peces de importancia comercial en sus estadios
tempranos (Almaguer et al. 2004; Romo 2002), también han sido utilizadas para
purificación de aguas contaminadas (bioremediación), producción de biodiesel,

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
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generación de productos medicinales y cosméticos (González et al., 1995;

Hernández y Labbe, 2014; Aguirre et al. 2011). Los avances en la biotecnología
microalgal han permitido cultivar muchas especies de microalgas e incrementar la
producción de metabolitos secundarios de interés comercial, tales como proteínas,
lípidos, almidón, glicerol, pigmentos naturales y biopolímeros, variando las
condiciones de cultivo (Richmond, 1990; Paniagua-Michel y Sasson, 1995;
Hernández y Labbe 2014).
Si bien se sabe que las microalgas son fuente potencial de metabolitos de alto valor,
son pocos los que han sido descubiertos y que son producidos exitosamente. De
igual manera, existe gran cantidad de especies que no han sido estudias (Band,
2007). Es entonces necesario identificar especies que aún no han sido exploradas, y
determinar las condiciones favorables para su cultivo y la producción de
metabolitos en laboratorio (Dionisi et al., 2012).
Por lo anterior, en este estudio se probaron diferentes métodos de aislamiento,
logrando aislar 6 especies de microalgas nativas del Caribe colombiano, con el fin de
que, en futuras investigaciones, se puedan cultivar e incrementar su biomasa para
extraer, identificar y probar actividad biológica de sus metabolitos secundarios.

- Objetivo general
Aislar microalgas de muestras de fitoplancton y bentos colectadas del Caribe
colombiano, incluyendo las bahías de El Rodadero, Santa Marta, Taganga, Chengue
y Playa Cristal (Neguanje); las dos últimas pertenecientes al PNNT.

- Objetivos específicos
- Ensayar diferentes métodos de aislamiento de microalgas en el laboratorio.
- Purificar las cepas aisladas, por siembras sucesivas de colonias individuales en agar.
- Realizar la identificación hasta el menor nivel taxonómico posible de las
microalgas aisladas.

- Marco conceptual

Microalgas
Las microalgas son organismos unicelulares que realizan fotosíntesis de las cuales se
reconocen aproximadamente 50.000 especies que oscilan entre 0,2 y 200 μm

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(Richmond, 2004). Pueden encontrarse unicelulares o aglomeradas, presentando

una amplia variabilidad de nutrición, como la autotrofía (fotosintética), heterótrofia
(depredación), mixotrófia (heterotróficos y autotróficos) y algunos organismos son
simbióticos (parasitismo). Esta variabilidad les permite producir diferentes
compuestos como fosfatos y nitratos que son aprovechados por otras especies
(Sousa et al., 1999).
El fitoplancton marino está conformado por nueve clases (Bacillariophyceae,
Dinophyceae, Cyanophyceae, Raphidophyceae, Dictyochophyceae,
Euglenophyceae, Chlorophyceae, Cryptophyceae y Haptophyceae), que de acuerdo
a la riqueza y abundancia de especies las diatomeas y los dinoflagelados son los
grupos más importantes de esta comunidad (Suthers y Rissik 2009). El crecimiento,
la distribución y la abundancia del fitoplancton están regulados por factores físicos
(temperatura, luz, pH), químicos (sustancias orgánicas e inorgánicas) y biológicos
(competencias intra-especificas e inter-especificas) Suthers y Rissik (2009).

Metabolitos secundarios y su actividad biológica

Los compuestos bioactivos de origen microalgal pueden provenir directamente del
metabolismo primario, tales como proteínas, ácidos grasos, vitaminas y pigmentos,
o pueden ser sintetizados del metabolismo secundario. De acuerdo con Sathasivam
et al. (2017), estos compuestos se dividen en 12 grandes categorías, las cuales están
siendo utilizadas con propósitos comerciales. Estas son aminoácidos, antioxidantes,
carotenoides (pigmentos), glutatión, glicerol, lípidos, polisacáridos, ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA’s por sus siglas en inglés), proteínas, esteroles, toxinas y
vitaminas, la mayoría presentando más de una actividad biológica, entre las que se
destacan actividad antimicrobiana, antioxidante, anticáncer, anti-
fotoenvejecimiento, antifúngica, antiviral, antialgal, antienzimática, antibiótica
antiinflamatoria, hipotensora, antiobesidad, antifibrosis, muchas de ellas con el
potencial de reducir y prevenir enfermedades (Smee et al., 2008; Volk, 2008;
Ibáñez y Cifuentes, 2013). En la actualidad, algunas microalgas están siendo
utilizadas como herramientas experimentales para investigaciones en enfermedades
degenerativas, tales como esquizofrenia y Alzheimer (Chu, 2012; Carballo-Cárdenas
et al., 2003). En la mayoría de las microalgas, los compuestos bioactivos son
acumulados en la biomasa; sin embargo, en algunos casos, estos son excretados al
medio (exometabolitos) (de Morais et al., 2015).

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Informe Técnico Final BPIN-2017

Existen otras aplicaciones de las microalgas a nivel industrial, en donde sobresalen

las diatomeas, siendo los principales componentes de filtros de aguas, explosivos,
material de construcción, abrasivos, cremas exfoliantes, pinturas antideslizantes,
materiales absorbentes para vertidos industriales, insecticidas (Illana, 2008),
medicina forense (test de las diatomeas) (Pollanen, 1998) y en nanotecnología, con
el desarrollo de componentes electrónicos de silicio puro obtenido a partir de
frústulos de diatomeas del género Aulacoseira (Bao et al., 2007).
Las especies de microalgas que se cultivan actualmente, debido a su producción de
metabolitos secundarios de interés comercial pertenecen, principalmente, a los
géneros Dunaliella, Spirulina, Porphyridium, Botryococcus, Isochrysis, Chlorella,
Ankistrodesmus, Chlamydomonas, Botryococcus,, Tetraselmis, Nitzschia,
Phaeodactylum, Chlorococcum, Chaetoceros, Nannochloropsis, Scenedesmus,
Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrotheca, Pavlovla, Navicula y
Hematococcus (Paniagua-Michel y Sasson, 1995; Sathasivam et al., 2017).
Se han desarrollado muchos estudios para investigar los productos del metabolismo
de las microalgas, no sólo para entender su naturaleza, sino para buscar sustancias
con posibles aplicaciones para los humanos en diferentes campos de interés. El
proceso de selección de extractos o aislamiento de metabolitos de diferentes
microalgas es un método común para determinar la actividad biológica de estos
compuestos (Volk y Furkert, 2006).

Medio de cultivo F/2 de Guillard

Este es un medio marino enriquecido amplia y comúnmente utilizado en el cultivo
de algas marino-costeras, especialmente diatomeas. Recibe este nombre porque la
concentración de la fórmula original, llamada medio “F” (Guillard y Ryther, 1962)
ha sido diluida a la mitad. El modo de preparación se describe a continuación:

Tabla 1. Formulación para la preparación del medio de Guillar F/2 (Modificado de Guillard, 1974;
Lavens y Sorgeloos, 1996; Velasco, 2008).
Ingredientes Fórmula Cantidad (g) Preparación
1.Nutrientes mayores
1.Solución secundaria
Nitrato de sodio
1.1. NaNo3 75 75 g NaNo3 + 5 g
granulado y refinado
NaH2PO4.H2O +llevar a 1L
Fosfato de sodio
1.2. NaH2PO4.H2O 5 de agua destilada
monobásico
Silicato de sodio 30 g Na2SIO3.9N2O +
1.3. Na2SIO3.9N2O* 30
metasoluble* llevar a 1L agua destilada
* Los silicatos se emplean solo cuando se van a cultivar diatomeas

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
Informe Técnico Final BPIN-2017

Ingredientes Fórmula Cantidad (g) Preparación

2. Metales traza
2.1.Soluciones primarias
0.98 g CuSO4.5H2O +
Sulfato cúprico,
2.1.1. CuSO4.5H2O 0,98 llevar a 100 mL agua
cristales finos
destilada
2.20 g ZnSO4.7H2O +
Sulfato de zinc,
2.1.2. ZnSO4.7H2O 2,20 llevar a 100 mL agua
cristales finos
destilada
Cloruro de cobalto, 1 g CoCl2.6H2O + llevar a
2.1.3. CoCl2.6H2O 1
cristales finos 100 mL agua destilada
Cloruro manganoso, 18 g MnCl2.4H2O + llevar
2.1.4. MnCl2.4H2O 18
cristales finos a 100 mL agua destilada
0.63 g Na2MoO4.2H2O +
Molibdato de sodio,
2.1.5. Na2MoO4.2H2O 0,63 llevar a 100 mL agua
cristales finos
destilada
2.2. Solución secundaria
2.2.1 EDTA sódico Na2.EDTA 4,36 1 mL de cada solución
primaria (2.1.1. a 2.1.5.) +
4.35 g Na2.EDTA + 3.15 g
2.2.2 Cloruro férrico FeCl3.6H2O 3,15
FeCl3.6H2O + llevar a 1 L
de agua destilada
3. Vitaminas
3.1. Soluciones primarias
3.1.1. Biotina cristalizada C10H16N2O3S 0,1
0.1 g C10H16N2O3S + 0.1 g
Cianocobalamina
3.1.2. C63H88CoN14O14P 0.1 C63H88CoN14O14P llevar
(B12)
a 100 mL con agua destilada
3.1.3. Tiamina clorhídrica C12H17ClN4OS 2
2 mL de la solución 3.1
llevar a 1L de agua destilada.
3.2. Solución secundaria
Adicionar 0.2 g
C12H17ClN4OS
Preparación del medio de cultivo
Para preparar 1 L de agua de mar enriquecida se mezcla 1 L de agua de mar microfiltrada con 2 mL de las
soluciones 1 y 2.2, esta solución se esteriliza en autoclave a 15 psi por 15 min, luego de enfriar se añade 1
mL de 3.2

Para el cultivo de diatomeas se adicionaron silicatos al medio de cultivo, requerido

para generar la cubierta de sílice, llamada frústula (Round y Crawford, 1990).

- Metodología

Limpieza, desinfección y organización del cepario de microalgas

Se limpiaron superficies (mesones, anaquel, pisos y paredes) con extrán diluido,
cloro 1% con agua destilada y se desinfectó con etanol 70%. La incubadora se
limpió por dentro y por fuera con agua destilada y jabón suave (de manos) y se

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desinfectó con etanol 70%. Se lavó y esterilizó por autoclave el material de uso en
el cepario. Se revisaron al microscopio las muestras de arrastre de fitoplancton que
se encontraban en la incubadora, guardando sólo las que aún tenían organismos
vivos y en buena cantidad y se organizaron los mesones de trabajo, dejando
únicamente el material a utilizar (Figura 1).

Figura 1. Mesones limpios y ordenados, y material de trabajo en el área de microalgas.

Preparación de medio F/2 de Guillard

Se siguió la preparación referenciada en la Tabla 1 y para ello, se empleó agua de
mar colectada en la Bahía de Chengue, a 20 m de profundidad, la cual se filtró por
5 y 1 μM y se esterilizó con UV (AMF+UV). Se probó este medio (F/2) y tres
modificaciones del mismo, las cuales se denominan (F/2)/2 (la mitad de la
concentración de F/2), F/2+silicatos y (F/2)/2+silicatos.

Preparación placas de agar

Se preparó agar-agar (Merck®) a una concentración de 20 g.L-1 y se empleó un
volumen de 15 mL por placa (Barreto y Velasco, 2014). El agar se disolvió en
AMF+UV empleando una plancha de calentamiento a 300 °C y un agitador
magnético a 350 rpm, por cerca de 20 minutos, sin dejar hervir. Se adicionaron los
nutrientes a la misma concentración empleada en la preparación del medio F/2 de
Guillard, a excepción de las vitaminas, y se esterilizó en autoclave. Se dejó enfriar un

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poco, se enriqueció con la solución de vitaminas y se sirvió inmediatamente en cajas

de Petri; se dejó gelificar y se taparon las cajas previamente rotuladas.

Métodos de aislamiento de microalgas

Las muestras de fitoplancton (Figura 2) se obtuvieron de las bahías de Chengue y
Playa Cristal (PNNT) y de las bahías de Santa Marta, El Rodadero, Sisiguaca
(Taganga) y Taganga y provenían de las comunidades bentónicas (Thalassia y rocas)
y planctónicas (arrastre de red). Estas muestras se mantuvieron en frascos de vidrio
rotulados en la incubadora para microalgas del cepario del LABBIM (Figura 3), a
23°C y 12h de luz y 12 de oscuridad (12:12h L:O).

Figura 2. Muestras de microalgas planctónicas y bentónicas colectadas en diferentes zonas del Caribe
colombiano.

Figura 3.Incubadora para microalgas del LABBIM, A) vista exterior y B) vista interior.

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Las muestras se revisaron al microscopio y se inició con el procedimiento de

aislamiento de los individuos. En la literatura se describen tres técnicas para
aislamiento de microalgas (González et al., 1995); todas estas fueron implementadas
en el LABBIM para incrementar la probabilidad de obtener colonias unialgales (una
sola especie) y cultivos axénicos (puros o libres de bacterias). A continuación, se
describen las tres técnicas de aislamiento empleadas en este trabajo.

Aislamiento por rayado en agar por agotamiento 

Se tomó una gota directamente de la muestra de fitoplancton y se rayó suavemente

una placa de agar por agotamiento con un asa bacteriológica. Este procedimiento se
realizó por duplicado y en F/2 y F/2 + silicatos. Las placas se sellaron con Parafilm®
y se incubaron a 23°C y 12/12h L:O durante 6-12 días hasta observar crecimiento de
colonias (Figura 4).

Figura 4. Proceso de aislamiento de microalgas por rayado en agar. Toma de muestra (A), siembra
en zig-zag en agar (B), colonias microalgales creciendo en agar con F/2 (C) y F/2+silicato (D).

Aislamiento por dilución 

Se diluyó 1mL de la muestra de fitoplancton en 9 mL de F/2 y lo mismo en F/2 +

silicatos (1:10-1). De cada dilución se tomó 1 mL y se diluyó de nuevo en 9 mL del

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
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medio correspondiente (1:10-2); este procedimiento se realizó sucesivamente, hasta

llegar a una dilución de 1:10-4 (Figura 5).

Figura 5. Aislamiento de microalgas por dilución seriada en F/2 y F/2+silicatos.

Posteriormente, se tomó una muestra de cada dilución con un asa bacteriológica y

se sembró por rayado en agar en el medio sólido correspondiente. Este
procedimiento se realizó por duplicado. Tanto las placas de agar como los tubos
con las diluciones se incubaron del modo descrito hasta observar crecimiento de
colonias en las placas o cambio de color o turbidez del medio líquido.

Aislamiento por pipeteo 

Se colocó una gota de la muestra de fitoplancton en un portaobjetos excavado

(Figura 6A). En otro portaobjetos se colocaron 5 gotas de F/2 en hileras (Figura 6B).
Se alargó la punta de una pipeta Pasteur con ayuda de pinzas y mechero, con el fin
de obtener un diámetro reducido. Al microscopio (4X) se seleccionó el individuo a
aislar y se succionó suavemente con la pipeta. Se colocó en la primera gota de la
hilera y se pasó de gota a gota con el fin de lavar el individuo y reducir o eliminar
bacterias y material adicional (Figura 6C-E). Finalmente, el individuo se depositó en
un pozo de una placa de 96 pozos (Almazán-Becerril, 2012) con 150 μL de F/2,
(F/2)2, F/2+silicatos y (F/2)2+silicatos (Figura 6F). Además de los pozos, también se
sembraron organismos en viales de vidrio con 1 mL de medio de cultivo (Figura
6G).
La placa se colocó en la incubadora y se revisó periódicamente bajo microscopio
para observar el crecimiento microalgal. Fue necesario colocar la placa dentro de
una bolsa de cierre hermético con un poco de agua destilada, para disminuir la
evaporación del medio dentro de los pozos.

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
Informe Técnico Final BPIN-2017

Figura 6. Proceso de aislamiento por pipeteo. A) Portaobjetos con una gota de muestra de
fitoplancton, B) portaobjetos con gotas de F/2 para lavar los individuos, C-E) lavado de un
organismo del género XXX, F) placa de 96 pozos con diferentes medios de cultivo y D) viales de
vidrio para siembra individual de microalgas. La flecha indica el individuo a aislar.

Purificación de las cepas microalgales 

Una vez se evidenció crecimiento de colonias en la caja con agar sembrada con la
muestra directa, se observaron bajo microscopio y se demarcaron colonias
unialgales sobre la caja de Petri. Bajo campana y con la ayuda de un asa
bacteriológica, se sembró por agotamiento cada colonia en una nueva caja con agar
con el medio correspondiente; las cajas se incubaron del modo descrito durante 8-
12 días. Transcurrido este tiempo, o hasta que se observaron colonias a simple vista,
se repitió el proceso, sembrando una colonia en una nueva caja con agar. Este
proceso se repitió dos o tres veces hasta lograr el cultivo de esta única especie
(Figura 7).

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 Evaluación de organismos marinos con potencial bioactivo
Informe Técnico Final BPIN-2017

Figura 7. Colonias de diatomeas creciendo sobre agar con F/2+silicato sembradas directamente de
una muestra colectada de Thalassia testudinium en Bahía de Chengue. Objetivo de 10X.

Es necesario adicionar antibióticos al medio de cultivo para eliminar las bacterias

que se encuentran en algunas cepas. Para ello, se requiere de ensayos con diferentes
concentraciones de antibióticos y establecer la más adecuada para eliminar las
bacterias, sin afectar la superviviencia de las microalgas.

- Resultados y discusión

Métodos de aislamiento

Rayado en agar por agotamiento 

A los 10 días de la siembra directa de la muestra tomada de Thalassia testudinium en

Neguanje (PPNT) (11°32´24´´N 74°07´66´´O) en placas de agar por agotamiento,
tanto en F/2 como en F/2+silicatos se observó crecimiento de colonias de diferentes
especies de microalgas (Figura 7), así como de abundantes bacterias marinas (Figura
8). Con ayuda de un microscopio se seleccionaron las colonias microalgales más
grandes para iniciar su proceso de purificación, sembrando cada una en una caja de
agar con el respectivo medio. Todas las especies aisladas con este método
correspondieron a diatomeas de tamaño pequeño (5-12 μM), las cuales crecieron
de manera abundante en F/2+silicatos.
Este resultado es congruente con lo expresado por González et al. (1995), quienes
manifiestan que esta técnica es la más apropiada para aislar microalgas menores a 10
μM de diámetro. Es probable que en un medio sólido, los microorganismos de

11