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EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA

SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
CATALASA Y PEROXIDASA EN
ALIMENTOS

CURSO : BIOQUÍMICA
PROFESORA: Blag. Alicia Decheco
Egúsquiza
TURNO: 90G
MESA: 4
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son el producto de expresión de genes; por lo tanto, su actividad puede
verse modulada por el genotipo del individuo. El estudio de la actividad enzimática tiene
importancia en ciencia básica, bioquímica y biotecnología. Asimismo, la presencia de
distintas isoenzimas y su actividad enzimática diferencial puede ser empleada como
marcador bioquímico de normalidad o anormalidad (diagnóstico de enfermedades).
Las enzimas son proteínas (con la excepción de los RNA catalíticos) producidos por los
seres vivos que catalizan con gran eficacia las reacciones biológicas, actuando de forma
específica y regulada. Las anteriores propiedades hacen que las enzimas se puedan
aplicar, de forma muy eficaz, a procesos industriales tales como la obtención de
fármacos, procesado de alimentos y en analítica. La cinética enzimática es la parte de la
enzimología que estudia la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente y el
efecto que diferentes factores físico-químicos sobre dicha velocidad

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PRÁCTICA DE LABORATORIO N°4
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OBJETIVOS
 Determinar la intensidad de reacción de la enzima catalasa de origen animal y
vegetal.
 Determinar el efecto de temperatura, pH y concentración de sales sobre la
actividad catalítica de la catalasa.
 Calcular la velocidad máxima de reacción peroxidasa.
 Determinar la concentración de sustrato necesario para alcanzar ½ de la
velocidad máxima
 Preparar el extracto enzimático de distintos medios biológicos y comprobar su
actividad.
 Emplear un método de continuo para medir la velocidad enzimática.
 Evaluar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

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MARCO TEÓRICO
ENZIMAS

Los enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas


que tienen lugar en la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces
de aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier
catalizador artificial conocido, y además son altamente específicos ya que cada uno de
ellos induce la transformación de un sólo tipo de sustancia y no de otras que se puedan
encontrar en el medio de reacción.

1.CATÁLISIS QUÍMICA

Antes de comenzar a analizar la naturaleza y función de los enzimas, resulta conveniente


enunciar algunos conceptos básicos acerca de la velocidad de las reacciones químicas y
el fenómeno de la catálisis. La teoría cinética química establece que las reacciones
químicas transcurren molécula a molécula de modo que una reacción tal como
R (reactivos) → P (productos)
tiene lugar porque una determinada fracción de la población de moléculas R, en un
instante dado, posee energía suficiente como para alcanzar un estado activado llamado
estado de transición, en el que es muy fácil que se rompan o se formen uno o más
enlaces químicos para formar los productos P. Es frecuente confundir el estado de
transición con un intermediario de reacción; sin embargo, este estado no es ninguna
especie química concreta, sino que podría definirse con más exactitud como un
"momento molecular fugaz", altamente inestable, en el que uno o más enlaces químicos
están muy próximos a romperse o a formarse.

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La velocidad de una reacción química es proporcional al número de moléculas por


unidad de tiempo con energía suficiente para alcanzar el estado de transición. Este
estado de transición posee una energía superior a la de los reactivos y a la de los
productos constituyendo entre ellos una barrera energética que debe superarse para
que la reacción tenga lugar. La diferencia entre la energía de los reactivos y la del estado
de transición recibe el nombre de energía libre de activación (ver Figura 14.1).
Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de
una reacción química. Uno de ellos consiste en la elevación de la temperatura de modo
que al incrementarse el movimiento térmico de las moléculas reaccionantes aumenta la
fracción de moléculas que poseen energía suficiente para alcanzar el estado de
transición. El otro método consiste en usar un catalizador, sustancia que se combina de
un modo transitorio con los reaccionantes de manera que éstos alcanzan un estado de
transición de menor energía de activación; cuando se forman los productos se regenera
el catalizador libre. Así, un catalizador es una sustancia que, sin consumirse en el
proceso, aumenta la velocidad de una reacción química rebajando la barrera de energía
de activación (ver Figura 14.1). Es conveniente resaltar el hecho de que los catalizadores
no alteran los equilibrios de las reacciones químicas, sólo consiguen que dichos
equilibrios se alcancen más rápidamente de lo que lo harían en ausencia de catalizador.

2.ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS: CENTRO ACTIVO

Los enzimas, en cuanto


que proteínas,
presentan todos los
rasgos estructurales y
propiedades químicas
que caracterizan a esta
notable clase de
biomoléculas. En
efecto, se ha podido
comprobar que los
enzimas pierden su
actividad catalítica
cuando sufren
desnaturalización por
efecto de los mismos
agentes que afectan a las demás proteínas; la conformación tridimensional nativa
intacta de la proteína enzimática resulta indispensable para que ésta desempeñe su
función. Además, los enzimas, al igual que otras muchas clases de proteínas, presentan
un centro activo a través del cual interactúan con la(s) molécula(s) de ligando, que en
este caso recibe(n) el nombre de sustrato(s), mediante un acoplamiento espacial (las
superficies moleculares de ambos tienen formas complementarias) y químico (grupos
funcionales complementarios del enzima y el (los) sustrato(s) establecen diferentes
tipos de interacciones débiles entre sí.
Tanto la actividad catalítica como el elevado grado de especificidad química que
presentan los enzimas residen en esta interacción específica entre el enzima y su
sustrato. El centro activo es una cavidad existente en la superficie del enzima que está

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forrada interiormente por una serie de restos de aminoácidos. Por regla general los
aminoácidos que forman parte del centro activo no se encuentran contiguos en la
cadena polipeptídica, sino ocupando posiciones a veces muy alejadas en la misma. El
hecho de que estos aminoácidos coincidan próximos entre sí sobre el centro activo no
es más que una consecuencia del plegamiento característico de la cadena polipeptídica,
es decir, de la conformación tridimensional nativa de la proteína enzimática. Puede
resultar útil, aunque no siempre posible, distinguir entre los aminoácidos que forman
parte del centro activo dos categorías:

a) AMINOÁCIDOS CATALÍTICOS. - Son uno o más aminoácidos cuyas cadenas laterales


R poseen unas 4 peculiaridades químicas tales que los facultan para desarrollar una
función catalítica. Constituyen el verdadero centro catalítico del enzima.

b) AMINOÁCIDOS DE UNIÓN. - Son una serie de aminoácidos cuyas cadenas laterales


R poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones débiles (puentes
de hidrógeno, interacciones iónicas, etc.) con grupos funcionales complementarios
de la molécula de sustrato. Su función consiste en fijar la molécula de sustrato al
centro activo en la posición adecuada para que los aminoácidos catalíticos puedan
actuar (ver Figura 14.2). En cuanto al resto de los aminoácidos de la cadena
polipeptídica del enzima, los que no forman parte del centro activo, podría pensarse
en principio que no desempeñan ninguna función, pero esto no es cierto; tienen la
importante misión de mantener la conformación tridimensional catalíticamente
activa del enzima; sin ella no existiría centro activo y el enzima no podría interactuar
con su sustrato.

3.FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimática.
Destacaremos dos: el pH y la temperatura.

3.1 EFECTO DEL pH. La


mayoría de los enzimas
presentan un pH óptimo para
el cual su actividad es
máxima; por encima o por
debajo de ese pH la actividad
disminuye bruscamente. Este
efecto se debe a que, al ser
los enzimas de naturaleza
proteica, al igual que otras
proteínas, se desnaturalizan
y pierden su actividad si el pH
varía más allá de unos límites
estrechos (Figura 14.8).

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De ahí la conocida importancia biológica de los sistemas tampón. En la mayor parte de


los casos el pH óptimo está próximo a la neutralidad, en consonancia con el pH
intracelular, pero existen enzimas con pH óptimo muy diverso según sea el pH del medio
en el que habitualmente actúan (los enzimas proteolíticos del jugo gástrico tienen pHs
óptimos próximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por último, existen algunos
enzimas a los que el pH no afecta en absoluto.

3.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA.

Al igual que ocurre con la


mayoría de las reacciones
químicas, la velocidad de las
reacciones catalizadas por
enzimas se incrementa con la
temperatura. La variación de la
actividad enzimática con la
temperatura es diferente de
unos enzimas a otros en función
de la barrera de energía de
activación de la reacción
catalizada. Sin embargo, a
diferencia de lo que ocurre en
otras reacciones químicas, en
las reacciones catalizadas por
enzimas se produce un brusco
descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crítica. Este efecto no es
más que un reflejo de la desnaturalización térmica del enzima cuando se alcanza dicha
temperatura. Si representamos gráficamente la variación de la actividad de los enzimas
en función de la temperatura (ver Figura 14.9) da la impresión de que existe una
temperatura "óptima" análoga al pH óptimo estudiado anteriormente; hay que resaltar
que esa aparente temperatura óptima no es más que el resultado de dos procesos
contrapuestos:

1) el incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura


2) la desnaturalización térmica del enzima.

4.INHIBICIÓN ENZIMATICA.
Existen una serie de sustancias, llamadas inhibidores, que inhiben o anulan la acción de
los enzimas sin ser transformados por ellos. Su estudio resulta de gran utilidad a la hora
de comprender los mecanismos de catálisis, la especificidad de los enzimas y otros
aspectos de la actividad enzimática. La inhibición enzimática puede ser irreversible o
reversible, esta última comprende a su vez tres tipos: inhibición competitiva,
acompetitiva y no competitiva.

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4.1. INHIBICIÓN IRREVERSIBLE.

Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima uniéndose


covalentemente a algún grupo funcional esencial para la catálisis con lo que el enzima
queda inactivado irreversiblemente. El estudio de este tipo de inhibidores ha resultado
de gran utilidad para identificar los grupos funcionales esenciales para la catálisis en
aquellos enzimas a los que inactivan. Este tipo de inhibición se conoce también como
"envenenamiento" del enzima.
Por ejemplo, algunos compuestos organofosforados tóxicos llamados venenos
nerviosos, que se utilizan como insecticidas, actúan inhibiendo irreversiblemente al
enzima acetilcolinesterasa, la cual interviene en la actividad del sistema nervioso. Se
sabe que estos compuestos organofosforados inactivan al enzima formando un enlace
éster fosfórico con el grupo hidroxilo de un determinado resto del aminoácido serina, lo
que demuestra que ese grupo funcional es esencial para la catálisis.

4.3 INHIBICIÓN REVERSIBLE.

Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera


parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se
combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato. Se distinguen tres
tipos de inhibición reversible:

A. INHIBICIÓN COMPETITIVA.

El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el


sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo,
pero que no posee ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima.

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El 13 inhibidor forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de


características cinéticas análogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que,
lógicamente, no puede descomponerse a continuación para dar lugar al enzima
libre y a los productos:

E+I EI
B. INHIBICIÓN INCOMPETITIVA.

El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unión al sustrato, sino


que lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo
enzima-sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a
los productos (Figura 14.11). El inhibidor se coloca próximo al centro activo situado
de tal manera que impide físicamente la salida de los productos:

ES + I ESI

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C. INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima
sustrato, interfiriendo en la acción de ambos (Figura 14.12).
Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar del enzima diferente del centro
activo provocando en la una alteración que dificulta bien la formación del complejo
enzima-sustrato o bien la descomposición de éste para dar lugar a los productos. La
unión con el inhibidor produce dos formas inactivas: los complejos EI y ESI, ninguna de
las cuales puede descomponerse para dar lugar a los productos y al enzima libre:

E+I EI
ES + I ESI
Aunque podría pensarse que los distintos tipos de inhibición estudiados pueden
desempeñar algún papel en la regulación de la actividad enzimática, todo parece indicar
que no es así; la regulación de la actividad enzimática se lleva a cabo mediante
mecanismos que no se ajustan a ninguno de los modelos de inhibición estudiados y que
se describirán en el próximo apartado. El interés del estudio de la inhibición enzimática
reside más en su utilidad para comprender la estructura, mecanismos catalíticos y
especificidad de los enzimas, que en una importancia biológica real.

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5.ENZIMAS REGULADORES.

La célula es una máquina química que debe ser capaz de auto ajustarse o regular su
propio funcionamiento para no desperdiciar tiempo ni energía en realizar procesos que
no le son útiles en un momento dado, siguiendo así un principio de máxima economía
molecular. Este autoajuste se lleva a cabo a varios niveles entre los que destaca la
regulación de la propia actividad enzimática. Todos los enzimas presentan propiedades
que los hacen candidatos a constituir elementos reguladores del metabolismo. Estas
propiedades son su sensibilidad a los cambios de pH, a la concentración del sustrato o a
la concentración de otras sustancias accesorias que denominaremos cofactores. Sin
embargo, existen una serie de enzimas que, además de estas propiedades comunes a
todos ellos, poseen otras que les confieren un papel específicamente regulador del
metabolismo: son los enzimas reguladores. Existen dos tipos principales de enzimas
reguladores: los enzimas alostéricos y los enzimas modulados covalentemente. Ambos
tipos son responsables de alteraciones en el estado metabólico de las células en
intervalos cortos de tiempo (los enzimas alostéricos en cuestión de segundos, los
modulados covalentemente en cuestión de minutos).

6.ENZIMAS ALOSTÉRICOS.
Los enzimas alostéricos son aquellos que, además del centro activo mediante el cual
interactúan con el sustrato,
poseen otro centro de unión
llamado centro alostérico
mediante el cual interactúan
con otra molécula
denominada efector o
modulador (la palabra
"alostérico" hace referencia a
la existencia de ese "otro
lugar"). La interacción del
modulador con el centro
alostérico es tan específica
como lo es la interacción del
sustrato con el centro activo
y también está basada en la
complementariedad
estructural (Figura 14.13). Los
enzimas alostéricos
presentan pesos moleculares en general superiores a los de otros enzimas y en la mayor
parte de los casos son proteínas oligoméricas, es decir están formados por varias
subunidades E + I  EI ES + I  ESI (normalmente en número par).

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CATALASA
La catalasa en una enzima que la podemos encontrar en muchos organismos vivos,
y cataliza la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
El peróxido de hidrógeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos
organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima
catalasa.

En la industria, se también se utiliza la enzima catalasa, para diferentes fines. Por


ejemplo, se usa en la industria textil, para eliminar residuos de peróxido de hidrógeno.
Además, la catalasa cumple una función protectora contra determinados
microorganismos patógenos, sobre todo anaerobios. Las bacterias anaerobias, mueren
al estar en contacto con oxígeno, es por esta razón que el oxígeno producido por esta
enzima tiene efecto bactericida sobre estos microorganismos. Tanto es así, que la
ausencia de dicha enzima por defectos genéticos, llamada acatalasemia o enfermedad
de Takahara, causa importantes infecciones en la mucosa bucal, pudiendo llegar a
causar la pérdida de dientes y graves lesiones en los maxilares y tejidos blandos de la
cavidad bucal.
La reacción catalizada por esta enzima, ocurre en dos etapas, en las cuales interviene el
hierro del grupo hemo de la hemoglobina como cofactor.
La presencia de la enzima catalasa en los tejidos de los organismos, se puede demostrar
en un sencillo experimento de laboratorio. Tomamos un trocito de hígado, y lo
colocamos en el fondo de un tubo de ensayo. Luego añadimos 5 ml de agua oxigenada
(que es lo mismo que peróxido de hidrógeno). Inmediatamente observaremos un
intenso burbujeo, que se debe al desprendimiento de oxígeno de la reacción catalizada
por la enzima catalasa.

PEROXIDASA

La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de


hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina)
por medio de peróxidos. El substrato oxidable más usado es el guayacol, que es oxidado
a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa: La velocidad de
formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad
enzimática por lecturas espectrofotométricas de las absorbancias en relación con el
tiempo.

La peroxidasa presenta como grupo prostético un grupo Hem, cuyo átomo central de
hierro forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la
hidroxilamina, inhibiéndose su actividad enzimática. La actividad enzimática depende
del vegetal (los rábanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable que
se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.

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Como la mayoría de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo
una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación.

Posee, además, la propiedad peculiar de la regeneración enzimática. Este fenómeno


consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad
después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica
de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura
terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego una reversión
de la proteína a su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o
sulfhidrílicos. Este efecto del calor sobre la actividad peroxidásica es muy, importante
en la industria de alimentos y la regeneración enzimática de la peroxidasa puede causar
serios problemas en los caracteres organolépticos. Se ha demostrado en el laboratorio
que esta actividad enzimática puede detenerse totalmente, si el calentamiento es
suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneración es muy débil
generalmente.
La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado
o blanqueo de verduras y también en el control de pasteurización de la leche. Así, a la
temperatura de pasteurización, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en
cambio, si la leche es sobrecalentada (más de 80-85°C) la peroxidasa pierde su
actividad en forma definitiva.

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MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales

Gradillas con Tubos de ensayo


Ph metro

Colador
Pipeta

Vaso de vidrio Piseta

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Bowl

Rallador

Reactivos

Bicarbonato de sodio
Cloruro de bario

Vinagre blanco
Agua oxigenada

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NaOH
NaCl

Sal
Cloruro de cobalto

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Muestras

Yacón
Papaya
Zanahoria

Trigo germinado

Hígado de res

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PROCEDIMIENTO
 CONDICIONES ESTANDAR

A cada tubo se agregó 5


ml de muestra, a los
cuales se añadió 2 ml
H2O2

Se debe observar la
Al observar
intensidad de reacción en
escogemos la muestra
el momento a temperatura
que rápidamente tuvo
ambiente. Se debe tener
la reacción
además un tubo blanco y
(zanahoria)
un tubo de control.

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 EFECTO pH

 HIGADO

Se preparó tubos por


separado con 2ml de
la muestra.

Tratamos por 7 Se midió el pH


Medimos el
minutos a las final y
pH inicial de
muestras observamos si la
las seis
agregando limón, reacción fue
muestras.
mandarina, vinagre, completa o
agua, bicarbonato, incompleta.
NaOH

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 EFECTO DE TEMPERATURA

 ZANAHORIA

Se preparó tubos por


separado con 2ml de la
muestra

Observar el tiempo
Se trató las
y tipo de reacción
muestras en baño
en los 30”; 1’; 3’; 6’;
maría (70°C)
y 9’

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 EMPLEO DE ACTIVADOR

Se preparó tubos con 5ml


de muestra a un valor de T°
y pH apropiado

Agregar a las
muestras Observar el tiempo
metales de reacción,
pesados: ClSr; intensidad y si es
ClZn; ClCd; completa
ClBa; ClCo; ClNa incompleta

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RESULTADOS
a) Representar los valores de velocidad enzimática frente a la cantidad de
extracto enzimático presente en las muestras.
BARRIDO
MUESTRA TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN
(2 ml)
Papaya 45 segundos + Incompleta
Yacón 8 minutos ++ Incompleta
Zanahoria 32 segundos +++ Completa
Hígado 2 segundos ++++ Completa
Agua 0 segundos --------- ---------

b) Representar los valores de velocidad enzimática frente al ph.

EFECTO DEL pH DEL HÍGADO


MUESTRA pHi pHf TIEMPO DE INTENSIDAD REACCIÓN
REACCIÓN REACCIÓN

Limón 5 3,5 1 minuto 04 I


seg.

Mandarina 5 4,5 1 segundo C


Vinagre 5 4 4 segundos C
Agua 5 5 3 segundos C
Bicarbonato 5 6 2 segundos C
NaOH 5 9,5 5,1 segundos C

EFECTO DEL pH DE LA ZANAHORIA


MUESTRA pHi pHf TIEMPO DE INTENSIDAD REACCIÓN
REACCIÓN REACCIÓN
Limón 5,5 2,5 - I
Mandarina 5,5 4 - I
Vinagre 5,5 3 - I
Agua 5,5 7 1 minuto 04 ++++ C
segundos
Bicarbonato 5,5 8 45 segundos +++ C
NaOH 5,5 11 2 minutos 08 ++++ C
segundos

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c) Indicar en qué rango de Ph el enzima es activo y el valor del Ph óptimo.

Sabiendo que las enzimas son proteínas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el carácter
iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades
catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y
en consecuencia su inactivación. La fosfatasa ácida es más activa a pH 5,0, mientras que la
fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen máxima actividad cerca de la neutralidad
en un rango de pH de 6 a 8.

El pH per se no afecta la actividad enzimática, sino la concentración de protones. Los protones


además de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la
reacción como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta
directamente la velocidad de la reacción.

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos
pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las
proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación
será la más adecuada para la actividad catalítica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH
óptimo.
La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas
décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad.
Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene
a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la
desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos
complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

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d) Representar los valores de la velocidad enzimática frente a la temperatura de


ensayo. Indicar de la temperatura óptima.

TEMPERATURA HÍGADO
TUBO TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

1 21 segundos +++++ C
(30 segundos)
2 31 segundos ++++ C
(1 minuto)
3 58 segundos +++ C
(3 minutos)
4 1 minuto 32 segundos ++ I
(6 minutos)
5 1 minuto 40 segundos + I
(9 minutos)

TEMPERATURA DE LA ZANAHORIA
TUBO TIEMPO DE REACCIÓN INTENSIDAD REACCIÓN

1 4 segundos ++++ C
(30 segundos)

2 11 segundos +++ C
(1 minuto)
3 15 segundos +++ C
(3 minutos)
4 20 segundos ++ I
(6 minutos)
5 40 segundos + I
(9 minutos)

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e) Representar los valores de velocidad enzimática frente a los metales pesados.

METALES PESADOS DE LA ZANAHORIA


METALES TIEMPO REACCIÓN INTENSIDAD
PESADOS

ClSr 40 segundos I -
ClZn 50 segundos I -
ClCd 37 segundos I +
ClBa 30 segundos I +
ClCo 43 segundos I -
ClNa 20 segundos C ++

METALES PESADOS DEL HÍGADO


METALES TIEMPO REACCIÓN INTENSIDAD
PESADOS

ClSr 05 segundos C +++


ClZn 02 segundos C ++++
ClCd 02 segundos C ++++
ClBa 02 segundos C ++++
ClCo 02 segundos C ++++
ClNa 02 segundos C ++++

f) En todos los casos estudiados, dar una respuesta razonada al por qué de las
variaciones de la velocidad de la reacción (actividad enzimática) observadas
cuando cambiamos el tiempo de la incubación, cantidad de extracto añadido,
Ph, temperatura y concentración de sustrato.
Barrido
Bueno, lo que en realidad quieres es la velocidad de reacción inicial, justo en el momento en
que combinas el sustrato y la enzima, y esta cataliza la reacción tan rápido como puede a esa
concentración particular de sustrato (porque la velocidad de reacción disminuirá a cero
conforme se usa el sustrato). Debido a esto, se observó que la enzima del hígado (catalasa)
reaccionó al instante a diferencia de las demás cuya reacción tardó un poco más.

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Efecto del pH
Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas
de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas
tienen un pH óptimo. El tiempo de reacción del hígado con las muestras fue positiva y al
instante excepto con el limón, ya que no reaccionó aún dejando varios minutos reposar.
El tiempo de reacción de la zanahoria, a diferencia del hígado, fue más largo y solo 3 muestras
reaccionaron las cuales fueron NaOH, bicarbonato y agua. Las que no reaccionaron fueron
limón, mandarina y vinagre.
Efecto de la temperatura
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la
temperatura a la cual se lleva a cabo la reacción. Siendo así, se observó que el tiempo de
reacción de la temperatura del hígado a los 30 segundos fue positivo (completa), pasando los
3 minutos la reacción fue incompleta (se tardó en reaccionar).
El tiempo de reacción de la temperatura de la zanahoria a los 30 segundos fue positivo
(completa), pasando los 3 minutos la reacción fue incompleta.
Metales pesados
Se observó que de los metales pesados en la zanahoria, el único que reaccionó luego de 20
segundos fue el ClNa siendo completa la reacción. Mientras que el resto de metales no
reaccionó.
Los metales pesados en el hígado, a diferencia de la zanahoria, si reaccionaron todos y a los
02 segundos siendo completas las reacciones.

g) Explique cómo actúan los activadores y los venenos enzimáticos.


EFECTOS DE LOS ACTIVADORES ENZIMATICOS

Los activadores son sustancias que por variados mecanismos incrementan la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzimas.

Como activadores enzimáticos se definen a las pequeñas moléculas, generalmente iones


inorgánicos, que son requeridos o al menos estimulan la actividad catalítica de una
enzima, y al contrario de los cofactores, no son participantes explícitos de la reacción.
Aun cuando pueden plantearse diferentes formas de actuar, nos limitaremos a los dos
casos mejor conocidos: la interacción obligatoria con la enzima libre y la interacción
obligatoria con el sustrato libre. En el primer caso se encuentran muchas enzimas que
poseen iones metálicos en su centro activo, como la carboxipeptidasa que contiene Zn 2+;
otras enzimas parecen requerir la presencia de un ion para estabilizar su conformación
de máxima actividad catalítica.

La reacción general puede ser descrita de la forma siguiente:

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donde A representa la concentración del activador.

En el segundo caso se encuentran enzimas que catalizan reacciones en las cuales


intervienen nucleósidos di y trifosfatados, que requieren de la participación simultánea
de un catión divalente (especialmente Mg2+) en cantidades estequiométricas. Las
investigaciones sobre estas reacciones han mostrado que un mecanismo probable para
esta activación es la combinación del ion con el sustrato, previo a su interacción con la
enzima. El verdadero sustrato de la reacción sería el complejo sustrato-catión; el
esquema de reacción sería:

EFECTOS DE LOS VENENOS ENZIMÁTICOS

Los inhibidores son sustancias que por variados mecanismos disminuyen la velocidad de
las reacciones catalizadas por enzimas.

Los inhibidores enzimáticos son sustancias que tienen en común la propiedad de


disminuir la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas. Casi siempre se
distinguen dos tipos generales de inhibición, la reversible y la irreversible, en el primer
caso el inhibidor forma con la enzima un complejo enzima-inhibidor (EI), unido por
fuerzas no covalentes y que, por tanto, puede disociarse; en el segundo se producen
modificaciones covalentes de la enzima que no pueden eliminarse fácilmente. En este
capítulo solo se tratarán los primeros.

Para estudiar el efecto y el tipo de los inhibidores se realiza una experiencia igual a la
determinación del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad, pero ahora
en cada uno de los tubos de ensayo se ha añadido un inhibidor en una concentración
fija. Como en los casos anteriores, los resultados se llevan a una gráfica y de acuerdo
con esta se clasifican los inhibidores; solo se estudiarán los casos más típicos.

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DISCUSIÓN
En la práctica de BARRIDO se pudo observar que el HÍGADO (catalasa) tuvo una
intensidad elevada en un tiempo de 2 segundos llevándolo a ser una reacción
COMPLETA; proseguido de la ZANAHORIA (peroxidasa) en un tiempo de 32 segundos
también llevándolo a una reacción COMPLETA. Es decir, el hígado posee una de las
enzimas con mayor actividad.
En la práctica del pH se observó que a medida agregábamos a la muestra de zanahoria
limón, mandarina, vinagre, agua, bicarbonato y NaOH el pH variaba con respecto al pH
inicial. De esta manera haciendo que la mandarina sea la que obtuvo una rápida reacción
(1 segundo) y COMPLETA.
En la práctica de temperatura (70°C) en baño maría se observó al tubo 1° estando este
durante 30 segundos sumergido en baño maría, un tiempo de reacción 4 segundos
haciendo esta con mayor intensidad y un tipo de reacción COMPLETA; prosiguiendo del
tubo 2° sumergida durante 1 minuto obtuviendose un tiempo de reacción de 15 minutos
y así hasta el tubo 5° que tuvo un tiempo de reacción de 40 segundos con un tipo de
reacción INCOMPLETA.
En la práctica de metales pesados se observó que el ClNa tuvo un tiempo de reacción de
20 segundos con una intensidad moderada y un tipo de reacción COMPLETA.

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CONCLUSIONES
 La velocidad de una reacción enzimática depende de varios factores. Entre éstos
está el pH, cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad enzimática es
óptima. Fuera de este rango la enzima por ser una proteína empieza a
desnaturalizarse por la protonación o desprotonación de sus aminoácidos
constituyentes.

 La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimática. Se puede


decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta que
llega un punto en el que la velocidad disminuye con el aumento en el calor.

 Otro factor fundamental en la velocidad a la que se realiza una reacción es la


concentración de enzima y de sustrato. Esto se sabe teóricamente debido a que
todas las reacciones cumplen con la reacción de Michaelis -Menten, donde si la
concentración de sustrato o de enzima es muy baja, la velocidad aumenta
proporcionalmente al aumento de concentración.

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RECOMENDACIÓN
Se recomienda hacer medidas exactas de la cantidad de muestra que se debe preparar
para que luego no haya inconvenientes. Además, observar minuciosamente cada
reacción ya que estas se efectúan en cortos tiempos ya sea segundos o minutos,
observar también el tipo de reacción (completa o incompleta) y que tipo de intensidad
presenta.
Se recomienda mostrarle a la profesora todo lo que se va realizando en el laboratorio
de esta manera ella corrobore con los análisis y resultados.

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CUESTIONARIO
1. Explique los procesos de separación y purificación de enzimas.
Microfiltración, cromatografía de gel y diafiltración.

MICROFILTRACIÓN
El principio de la microfiltración es un proceso de separación física en el cual el
tamaño de los poros de una membrana determina hasta qué punto son
eliminados los sólidos disueltos, la turbidez y los microorganismos. Las
sustancias de mayor tamaño que los poros de la membrana son retenidas
totalmente. Las sustancias que son más pequeñas que los poros de la membrana
son retenidas parcialmente, dependiendo de la construcción de una capa de
rechazo en la membrana.

Sistemas de microfiltración (SMF)


Separación sólido-líquido para las industrias de transformación de los alimentos
y farmacéuticas. El sistema trabaja con una membrana de Separación de Sólidos.
Una capa delgada del líquido de la estabilización se pone en la superficie de la
membrana para favorecer la separación.
El líquido de la estabilización hace posible el filtrado de hasta 0.1 micras. Los
sólidos quedarán separados del líquido en la capa estabilizada fina.
La máquina rellenará la capa delgada después de este proceso de limpieza y la
filtración puede comenzar otra vez. El líquido de la estabilización puede ser o
consistir en: Celulosa, zeolita, perlita o carbón activado.
Los ejemplos de SMF se pueden encontrar en las industrias farmacéuticas, de
productos químico y del semiconductor para:

 Separación de catalizadores.
 Separación de enzimas y de levaduras.
 Clarificación y extracción de los líquidos.
 Separación de las partículas del corte del cristal y del metal del aceite/líquido.
 El SMF también se utiliza en el proceso del agua y el tratamiento de aguas
residuales.

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Microfiltración en la industria alimentaria


Microfiltración como protección de huevos y leche líquida.
Por consumo de huevos en EEUU. Usualmente para su control se usa la
pasteurización, proceso térmico que elimina los agentes patógenos sensibles al
calor pero algunos microorganismos resistentes a este factor pueden sobrevivir.
El consumidor puede evitar la infección si aplica una adecuada cocción de los
huevos antes de consumirlos, la microfiltración ofrece una nueva posibilidad
para compensar las posibles deficiencias de la pasteurización.

CROMATOGRAFÍA DE GEL
La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar
moléculas en función de su tamaño molecular. La capacidad separadora reside
fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas
porosas microscópicas. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento
que depende del tamaño de sus poros. El objetivo de esta práctica es separar
una mezcla de sustancias de distinto peso molecular por medio de una
cromatografía en una columna de Sephacryl S-200 HR y determinar los
correspondientes parámetros que caracterizan el comportamiento
cromatográfico de cada sustancia.

Principio de la cromatografía de filtración en gel


Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus
diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz
consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están
constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces
químicos para formar una red tridimensional.

DIAFILTRACIÓN
Es una modificación de la Ultrafiltración en la cual se adiciona agua a la
alimentación con el fin de facilitar el permeado de algunos componentes a través
de la membrana (principalmente lactosa y minerales).
El modo de dilución o de diafiltración es una forma de operar en microfiltración
y ultrafiltración, en el que el retenido se diluye con disolvente adicional y
nuevamente es filtrado para continuar la extracción selectiva de los
componentes de bajo peso molecular. Puede realizarse de tres formas
diferentes: discontinua, semicontinua y continua.

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2.- ¿Explique los métodos de determinación y caracterización de las actividades


enzimáticas en microorganismos?
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como
catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las
demás conformaciones posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en
cambios en la actividad catalítica.

CARACTERIZACION
EFECTO DE TEMPERATURA:
Termodinámicamente, la velocidad de una reacción química depende de la relación
entre las energías libres de Gibas de los sustratos y de los complejos de transición.
Mientras mayor sea la diferencia entre la energía libre del complejo se transición con
respeto a los reactivos, es decir mientras menos estable sea el estado de transición, más
lento será el avance de la relación, es decir la velocidad de reacción disminuye conforme
aumenta la energía libre de activos.
Preparar dos tubos por separado con ml de la muestra de origen animal y vegetal donde
la reacción fue intensa a un valor de pH apropiado y repita el experimento anterior
tratando previamente la muestra en baño maría a 70°C por 30”, 1’, 6’, 9’ y 12’.

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EFECTO DEL pH:


Si el sustrato tiene propiedades acido- base es probable que la enzima solo pueda
catalizar la transformación de su forma disociada o de su forma disociada o de su forma
no disociada
Prepare tubos por separado con ml de muestra, a la temperatura del tratamiento
anterior donde fue mayor la actividad de la catalasa.

EMPLEO DE ACTIVADOR
Prepare tubos de 5 ml de muestra a un valor de temperatura y PH apropiado, repita el
experimento tratado previamente la muestra con NaCl o MgCl (por 7 minutos)

3. Explique los métodos de extracción y ensayo de actividades enzimáticas en


vegetales

Muchos organismos pueden descomponer el peróxido de hidrógeno (H2O2) por la


acción de las enzimas. Las enzimas son proteínas globulares responsables de la mayor
parte de la actividad química de los organismos vivos. Actúan como catalizadores, que
son sustancias que aceleran las reacciones químicas sin ser destruidas o alteradas
durante el proceso. Las enzimas son extremadamente eficientes y se pueden utilizar una
y otra vez repetidamente. Una enzima puede catalizar miles de reacciones en cada
segundo. Tanto los valores de pH como de la temperatura a los que trabaja la enzima
son extraordinariamente importantes. La mayoría de los organismos tienen un intervalo
de temperatura preferente en el cual sobreviven y sus enzimas funcionan mejor dentro
de dicho intervalo de temperatura.

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Si el ambiente donde se encuentra la enzima es demasiado ácido o demasiado básico,


la enzima puede desnaturalizarse de forma irreversible o transformarse de modo que
su forma no le permita más realizar su funcionamiento apropiado. El H2O2 es tóxico
para la mayoría de los organismos vivos. Muchos organismos son capaces de destruir el
H2O2 mediante la acción de enzimas antes de que pueda realizar mucho daño. El H2O2
se convierte en oxígeno y agua según la siguiente reacción:

2 H2O2 → 2 H2O + O2
Puede ser determinada por los métodos espectrofotométricos basados en la formación
de compuestos coloreados que ocurre durante la reacción con el hidrógeno y el sustrato
donador. También puede ser estimada por la actividad residual después de un
tratamiento por calentamiento, así como por la composición de las isoenzimas.

Espectofometría:
Es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en
función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en
las investigaciones bioquímicas y síntesis químicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que cuantifica la cantidad de energía absorbida o transmitida por una
solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.

Actividad residual
Las enzimas son proteínas, y por tanto pueden desnaturalizarse por los mismos
mecanismos generales que las demás proteínas. La forma más habitual de controlar la
actividad enzimática en un alimento es mediante su tratamiento térmico.

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Cinética de inactivación
Cuando se representa la actividad de un enzima frente al tiempo de calentamiento, se
obtiene una gráfica como la de la figura:

Teniendo en cuenta que los enzimas se comportándose de el punto de vista cinético de


forma semejante a los microrganismos, el efecto del calentamiento se puede analizar
matemáticamente por los mismos procedimientos.

Representando en forma semilogarítmica la actividad residual de enzima frente al


tiempo, para cada temperatura:

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Se obtienen una serie de rectas, y de cada una de ellas se puede calcular el valor D, que
se define como el tiempo necesario para destruir el 90% de la actividad de un enzima
calentándolo a una temperatura dada. Evidentemente, un enzima tiene distintos valores
de D a distintas temperaturas (y en distintas condiciones del medio).
El valor de D se calcula como la inversa de la pendiente de la recta obtenida
representando el logaritmo de la actividad enzimática en función del tiempo.

Una vez obtenidos los valores de D a distintas temperaturas, se pueden representar los
valores de sus logaritmos frente a las temperaturas correspondientes

La gráfica obtenida permite calcular el valor de Z, como inversa de la pendiente, y que


se define como el número de grados centígrados que es necesario aumentar la
temperatura para que el valor de D se reduzca en un 90%.

Evidentemente, estos valores serán para unas condiciones del medio dadas,
especialmente en lo que respecta al pH y a la fuerza iónica. También pueden influir otros
factores, como la actividad de agua, la presencia de ligandos, cofactores o sustratos,
etc.

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4.Defina: residuos catalíticos, mutasas, inmunoadsorbentes, constante de disociación,


actividad molecular.

Residuos catalíticos:
Son los residuos que participan directamente en la formación y la ruptura de enlaces
químicos
Intervienen en la formación química del sustrato y son capaces de llevar a cabo la
catálisis.

Mutasa:
Es la enzima que cataliza la transferencia intramolecular de un grupo funcional como el
fosforilo. La transferencia no tiene por qué ser directa, sino que puede implicar un
enzima fosforilado intermedio.
Interconvienen isómeros de posición

Inmunoadsorbentes:
Es un preparado de antígenos o anticuerpos en forma insoluble utilizado para captar
respectivamente, el anticuerpo o el antígeno homologo, y extraerlo de una mezcla de
sustancias.
Es utilizado en la técnica ELISA que se basa en la detección de un antígeno inmovilizado
sobre una fase solida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una
reacción cuyo producto, por ejemplo, es un colorante puede ser medido
espectrofotométricamente.

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Constante de disociación:
La constante de equilibrio a menudo denominada constante de disociación se define
como:

Cuanto más grande sea Ka, mayor es la tendencia del asido a disociarse, es decir, más
fuerte es el ácido.

Los ácidos polipróticos son aquellos que, por tener más de un protón, pueden tener
distintos valores de pka.

Actividad molecular:
Se define como el número de moles de sustrato transformándose por minuto por mol
de enzima (unidades por micromol de enzima) en condiciones óptimas. Cuando la
enzima tiene más de un centro de unión para el sustrato, se puede definir una actividad
catalítica por centro como el número de moles de sustrato transformados por minuto
por mol de centro activo bajo condiciones óptimas en realidad, la actividad molecular o
la actividad catalítica por centro son equivalentes a la constante catalítica de velocidad,
K2 .

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5. Aplicación de la biotecnología enzimática y biocatálisis.


La Biocatálisis ha surgido como un área de gran riqueza dentro de la Biotecnología,
y ha permitido la aplicación de las enzimas en un amplio número de industrias
dedicadas a la fabricación de fármacos y otros compuestos químicos, así como
alimentos o biocombustibles. Este sorprendente desarrollo de la Biocatálisis se
debe a nuevas tecnologías como la bioinformática, el cribado de alta resolución, la
evolución dirigida, así como otras técnicas arraigadas como la inmovilización de
enzimas y la ingeniería de proteínas o del medio de reacción. La fabricación
sostenible de productos de consumo es uno de los objetivos principales de la
Biocatálisis, y supondrá muchos desafíos y oportunidades en el futuro.

En la actualidad son numerosos los procesos biotecnológicos que se llevan a cabo


mediante la utilización de células o de sus enzimas aisladas, siendo un campo con
grandes perspectivas de futuro.


El término Biocatálisis se refiere a la utilización de células o sus enzimas aisladas


para catalizar reacciones o transformaciones que conducen a la obtención de
compuestos de interés, que satisfacen numerosas necesidades humanas. La
Biocatálisis se encuentra enmarcada en la denominada Biotecnología Blanca,
subsector de la Biotecnología con importantes perspectivas de crecimiento, clave
para el desarrollo de la denominada bioeconomía.

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BIBLIOGRAFÍA
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menez.pdf

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