Reasignación de doxiciclina para sinucleinopatías: remodelación de

oligómeros de sinucleína α hacia especies estructuradas paralelas de

hoja-beta no tóxicas
Informes científicos volumen7 , Número de artículo: 41755 (2017) |

Abstracto

Las sinucleinofatías son trastornos neurodegenerativos progresivos sin cura hasta

la fecha. Una estrategia atractiva para abordar este problema es reutilizar fármacos
ya probados contra nuevos objetivos. De esta forma, la doxiciclina evita la
neurodegeneración en los modelos de Parkinson al modular la
neuroinflamación. Sin embargo, la terapia antiinflamatoria per sees insuficiente
para explicar la neuroprotección. Aquí caracterizamos nuevos objetivos de
doxiciclina que describen el fondo estructural que respalda su efectividad como
neuroprotector a dosis subantibióticas. Nuestros resultados muestran que la
doxiciclina transforma los oligómeros de α-sinucleína en especies fuera de camino,
de alto peso molecular, que no evolucionan hacia fibrillas. Las especies fuera de
camino presentan una superficie menos hidrófoba que los oligómeros en el camino
y muestran una disposición estructural de hoja β diferente. Estos cambios
estructurales afectan la capacidad de la α-sinucleína para desestabilizar las
membranas biológicas, la viabilidad celular y la formación de especies tóxicas
adicionales. En conjunto, estos mecanismos podrían actuar sinérgicamente dando
nuevos objetivos para reutilizar este medicamento.

Introducción

La acumulación anormal de agregados de α-sinucleína amiloide en células

neuronales o gliales es el evento común en trastornos neurodegenerativos conocidos
como sinucleinopatías. Abarca patologías con un pronóstico clínico devastador
como la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy y la
atrofia multisistémica. Si bien la base de la neurotoxicidad de la α-sinucleína sigue
siendo controvertida, ahora se acepta que ciertas especies oligoméricas generadas
durante el autoensamblaje de α-sinucleína amiloide son, con toda probabilidad,
actores clave en la iniciación 5 y la diseminación de la patología 6. Además, el
estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la neuroinflamación también se han
firmado como responsables de la muerte celular neuronal. Sin embargo, la
evidencia convincente muestra que la agregación de α-sinucleína puede
desencadenar todos estos eventos y, a veces, viceversa, lo que sugiere que estos
procesos podrían entrelazarse fomentando un círculo vicioso con consecuencias
fatales para las neuronas.

Un número significativo de moléculas firmadas como inhibidores eficientes de la

neuroinflamación, el autoensamblaje de α-sinucleína amiloide, el estrés oxidativo
o la disfunción mitocondrial in vitro no han logrado proporcionar una
neuroprotección efectiva in vivo . Además, los fármacos desarrollados para
bloquear un componente del proceso de muerte a la vez han demostrado ser
ineficaces en los ensayos clínicos y, por lo tanto, en la actualidad el desafío debe
dirigirse a la búsqueda de moléculas con objetivos múltiples para alcanzar un efecto
neuroprotector eficiente. Por el contrario, se ha informado que la doxiciclina, un
antibiótico que pertenece a la familia de las tetraciclinas, exhibe actividad
neuroprotectora tanto en MPTP como en 6-OHDA modelos animales de PD. De
hecho, este antibiótico fue capaz de mitigar la pérdida de neuronas dopaminérgicas
en la sustancia nigra pars compacta y los terminales nerviosos en el cuerpo
estriado. Se ha propuesto que el mecanismo que subyace a este efecto es la
capacidad de la doxiciclina para disminuir la neuroinflamación. Dado que el
tratamiento con compuestos antiinflamatorios solos no ha demostrado ser suficiente
para prevenir la neurodegeneración , proponemos que la doxiciclina tenga un
objetivo adicional. De hecho, se ha demostrado que la doxiciclina inhibe la
formación de fibrillas de proteínas amiloidogénicas tales como el péptido Aβ , el
péptido PrP y la β-microglobulina .. Sin embargo, hasta donde sabemos, no existen
estudios mecanísticos sobre el efecto de la doxiciclina sobre la agregación o la
siembra de α-sinucleína.

En el presente documento, mostramos la capacidad de la doxiciclina para interferir

por primera vez con el ciclo patológico involucrado en las sinucleinopatías en el
nivel de agregación. Demostramos que la doxiciclina interactúa con los intermedios
de agregación temprana de α-sinucleína que conducen a la formación de especies
fuera de ruta, con un contenido paralelo de hojas β, que no evolucionan hacia la
formación de fibrillas. A diferencia de los oligómeros en ruta, estos agregados no
son citotóxicos para las líneas celulares dopaminérgicas ni capaces de alterar la
integridad de la membrana de los liposomas. Además, la doxiciclina también puede
bloquear la capacidad de siembra de los agregados preformados de α-
sinucleína. Tomados en conjunto, nuestros resultados arrojan luz sobre el
mecanismo por el cual la doxiciclina afecta la agregación de α-sinucleína y la
siembra de nuevos oligómeros.in vivo . Además, de acuerdo con nuestros datos, las
dosis subantibióticas de doxiciclina serían lo suficientemente altas como para
interferir con la producción de especies tóxicas de α-sinucleína. Los resultados
presentados en este documento colocan a la doxiciclina como un fármaco
pleiotrópico convirtiéndose en una estrategia terapéutica atractiva contra las
sinucleinopatías.
Resultados

La doxiciclina inhibe la agregación de α-sinucleína a través de la formación

de oligómeros fuera de ruta
Para analizar la capacidad de la doxiciclina para interferir con el proceso de
ensamblaje de fibrillas de α-sinucleína, se incubó α-sinucleína 70 μM en ausencia
o en presencia de 100 μM de doxiciclina a 37 ° C bajo agitación orbital. Auto-
asociación cinética de α-sinucleína se controló como un aumento en la emisión de
fluorescencia de tioflavina T (ThT) a 482 nm (λ exc 450 nm) a la unión de esta sonda
a los agregados ricos en cruz-β estructura . De acuerdo con informes anteriores, la
agregación cinética de α-sinucleína en ausencia de doxiciclina muestra una fase de
latencia de 18 h seguida de un crecimiento exponencial para finalmente alcanzar
una meseta a las 48 h ( figura 1a).) Por el contrario, en presencia de doxiciclina, la
cinética de agregación de α-sinucleína se ve gravemente afectada. De acuerdo con
la sonda fluorescente, cuando se agrega doxiciclina al comienzo de la incubación,
la formación de agregados con estructura β cruzada disminuye drásticamente. Sin
embargo, una vez que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial, la adición
de doxiciclina no tiene un efecto observable sobre la cinética de agregación de la
α-sinucleína ( figura 1a ).

Figura 1: Efectos de la doxiciclina en la agregación y siembra de a-sinucleína.

(A) Intensidad de emisión de fluorescencia de 25 μM de tioflavina T en una

solución que contiene 70 μM de α-sinucleína sola (círculo vacío), o con la
adición de 100 μM de doxiciclina a 0 h (círculos completos) o después de 16
horas de incubación (invertido) triángulos) (la adición de doxiciclina está
indicada por una flecha). Una solución que contiene 100 μM de doxiciclina sola
(asterisco) también se muestra como control. ( b ) Microscopía electrónica de
transmisión (TEM) de muestras de a-sinucleína incubadas a 37 ° C bajo
agitación orbital en ausencia (arriba) o en presencia de doxiciclina (abajo), y
cosechadas después de 16 h (izquierda) o 96 h ( derecho). La barra blanca
corresponde a 200 nm a 220000X y 70000X de aumento para la observación
de oligómeros y fibrillas, respectivamente. ( c) Se sembraron soluciones
nuevas de a-sinucleína monomérica con oligómeros preincubados en ausencia
(cuadrado vacío) o en presencia de doxiciclina (cuadrado completo). Las
soluciones resultantes se incubaron a 37ºC bajo agitación orbital y la
agregación se ensayó mediante emisión de fluorescencia ThT. La cinética de
agregación no sembrada se muestra en (círculo vacío).
Para evaluar el impacto de la doxiciclina en la morfología de las especies presentes
a lo largo de la vía de agregación, se realizaron estudios de microscopía electrónica
de transmisión (TEM) en muestras de α-sinucleína monomérica incubada con
doxiciclina o sin esta y recolectada en diferentes momentos ( Fig. 1b).) Después de
16 h de incubación, pudimos detectar especies oligoméricas en ambas condiciones,
que morfológicamente eran indistinguibles por TEM. Sin embargo, solo en
ausencia de doxiciclina, los oligómeros evolucionaron en fibrillas, que se
observaron después de 96 h de incubación. Estos datos sugieren que la doxiciclina
detiene el ensamblaje de oligómeros de α-sinucleína en agregados más grandes ya
que solo se observan oligómeros pero no fibrillas en este momento. De hecho, la
ausencia de fibrillas en las muestras que contenían doxiciclina es consistente con la
falta de β-cruzada observada usando la sonda fluorescente ThT ( figura 1a ).

Para evaluar si los oligómeros de \ alpha - sinucleína formados en presencia de

doxiciclina son intermedios en ruta o fuera de ruta en el proceso de formación de
fibrillas, también llevamos a cabo experimentos de siembra. Para esto, las semillas
se produjeron incubando la solución de α-sinucleína a 37 ° C bajo agitación orbital
durante 16 h en ausencia o presencia de doxiciclina. A continuación, se añadió una
alícuota de la solución que contenía semillas de α-sinucleína a soluciones nuevas
de α-sinucleína monomérica y se incubó adicionalmente durante 72 h ( Fig. 1c).) La
adición de semillas formadas en ausencia de doxiciclina acelera el proceso de
agregación y más especies con estructura β cruzada se autoensamblan a partir de α-
sinucleína nativa tal como se indica mediante una mayor fluorescencia de ThT. Por
el contrario, los oligómeros formados en presencia de doxiciclina no son capaces
de convertirse adicionalmente en fibrillas amiloides. Esto indica que los oligómeros
formados en presencia de doxiciclina no funcionaron como molde para la
conversión de proteínas no polimerizadas en fibrillas de amiloide y que los
denominaremos oligómeros fuera de ruta en todo el documento, en contraste con
los oligómeros de ruta formados en el ausencia de doxiciclina
La inhibición de la fibrilación de a-sinucleína está mediada por la unión de
doxiciclina a especies oligoméricas
La actividad antiamiloide de la doxiciclina nos llevó a explorar los detalles de su
unión a la a-sinucleína por espectroscopía de RMN. Para analizar esta interacción
utilizamos espectros de correlación cuántica múltiple heteronuclear 1 H- 15 N NMR
(HMQC). El 1 H- 15 espectro de N de una muestra de manera uniforme 15 N marcada
con α-sinucleína, reflejando la naturaleza intrínsecamente desordenado de la
proteína, se muestra en la Fig. 2a . Tras la titulación de α-sinucleína enriquecida
en 15 N con concentraciones crecientes de doxiciclina, el 1 H- 15Los espectros N
HMQC conservaron la excelente resolución de la proteína monomérica no
complejada. En particular, no se observaron perturbaciones de ensanchamiento ni
de desplazamiento químico, incluso a elevadas proporciones de ligando: α-
sinucleína (5: 1), lo que indica que la doxiciclina es incapaz de interactuar con la
α-sinucleína monomérica.

Figura 2: Análisis de la unión de doxiciclina a a-sinucleína por RMN.

( a ) Diagramas de contorno superpuestos de H- N SOFAST-HMQC espectros

1 15

de 70 μM monomérica α-sinucleína en ausencia (negro) o presencia (rojo) de

350 μM doxiciclina. ( b ) 1H RMN de 200 μM de doxiciclina sola (línea
Espectros de

negra) o tras la adición de 100 μM de a-sinucleína monomérica (línea

roja). ( C ) H espectros de RMN de 200? M doxiciclina en ausencia (línea de
1
color negro) o presencia de 100? M α-sinucleína envejecido durante 8 h (línea
roja), 24 h (línea azul) o 48 h (línea verde). En los paneles ( b ) y ( c ), el
asterisco denota doxiciclina aislada H señales que se amplían al unirse a
1

estructuras amiloidogénicas de orden superior de α-sinucleína. En el panel

( c ), el símbolo # denota señales de a-sinucleína monoméricas aisladas que
desaparecen como consecuencia de la progresión del proceso de
agregación. Los espectros de RMN se adquirieron a 15 ° C ( a ) y 25 ° C ( b ) y
( c ). Las muestras se disolvieron en HEPES 20 mM suplementado con NaCl 150
mM y 10% D O. 2

Para evaluar adicionalmente la naturaleza de las especies de α-sinucleína

implicadas en la interacción con doxiciclina, llevamos a cabo experimentos de
RMN dirigidos a detectar directamente las señales que pertenecen al compuesto
anti-amiloide. Las especies de α-sinucleína oligómeras o prefibrilares altamente
ordenadas son invisibles para el enfoque de RMN utilizado aquí 24 , 25 , aunque
podrían detectarse incluso ciertos oligómeros que retienen una alta flexibilidad en
la región C-terminal 26 . Por lo tanto, una posible interacción del antibiótico con
esas especies no se hará evidente mediante el uso de una estrategia de RMN basada
en la detección de resonancias de la cadena principal de proteínas. Por el contrario,
el 1D 1El espectro de H NMR de la doxiciclina muestra resonancias bien resueltas
en la región de 6.0-7.0 ppm, que constituye una sonda excelente para explorar las
características de unión del antibiótico a la α-sinucleína. Como era de esperar, la
adición de 0.5 equiv. de muestras monoméricas de α-sinucleína a doxiciclina no
causaron perturbaciones en el espectro 1D 1H NMR del ligando pequeño, lo que
confirma la falta de interacción del compuesto con la forma monomérica de la
proteína ( Figura 2b, c ). Por el contrario, se observó un ensanchamiento sustancial
de las señales de doxiciclina cuando se agregaron alícuotas de muestras de a-
sinucleína envejecida (24-48 h), lo que indica que la doxiciclina puede unirse a las
especies moleculares más grandes formadas durante el evento de agregación ( Fig.
2c) Aunque los cambios en las señales de doxiciclina con la adición de α-sinucleína
envejecida durante 8 h no fueron tan importantes, todavía observamos una pequeña
disminución en las intensidades de la señal, especialmente en el conjunto de
resonancias centradas en alrededor de 6.95 ppm. Estas pequeñas perturbaciones
probablemente se atribuyen al pequeño número de oligómeros presentes en la
muestra en tiempos de agregación cortos. Con el fin de confirmar esta hipótesis, se
analizaron los espectros registrados para la doxiciclina sola o al agregar muestras
de a-sinucleína frescas o envejecidas (16 h) ( Figura Suplementaria S1 ). Aunque
no se pudieron detectar fibrillas en estas muestras (ver Fig. 1a, d), se centrifugaron
para centrifugar y eliminar especies insolubles menores que podrían haberse
formado en nuestras condiciones experimentales. Incluso después de este
tratamiento, la atenuación de la señal en doxiciclina permaneció inalterada (véase
el conjunto de picos centrados en 6.95 ppm y 6.35 ppm), sugiriendo un paisaje de
interacción formado principalmente por oligómeros solubles o protofibrillas
tempranas. Un análisis comparativo entre las intensidades de las resonancias de α-
sinucleína localizadas en las regiones metílica y aromática (solo se consideraron las
señales que no se solapaban con las resonancias de doxiciclina), no muestra
diferencias entre los espectros registrados a las 0 y 16 h, indicando la ausencia de
estructuras voluminosas y muy ordenadas, como fibrillas de amiloide o
protofibrillas grandes de acuerdo con los datos de ThT y TEM. Desde monomérica
α-sinucleína no es capaz de interactuar con doxiciclina (se supone que la atenuación
observada para las señales del compuesto en las condiciones experimentales
descritas anteriormente son un reflejo de un proceso de interacción con baja -
ordenar especies oligoméricas o protofibrilares α-sinucleína que retienen algunos
grados de flexibilidad molecular. En conjunto, estas evidencias indican que la unión
de doxiciclina a α-sinucleína procede inicialmente a través de interacciones con
especies agregadas formadas durante las primeras etapas del proceso de ensamblaje,
un evento molecular que podría proporcionar una base mecánica central para el
proceso inhibidor de doxiciclina en α-sinucleína fibrilación.

Los oligómeros fuera de ruta presentan una disposición estructural

diferente
Con el fin de obtener más información sobre cómo la doxiciclina influye en la
agregación de α-sinucleína que conduce a la formación de especies fuera de ruta,
se emplearon tres técnicas complementarias. Estos fueron la dispersión de rayos X
de ángulo pequeño (SAXS), la fluorescencia de bis-ANS y la espectroscopía
infrarroja transformada de Fourier (FT-IR). SAXS informa cambios en la
morfología de los agregados de proteínas (forma y tamaño), bis-ANS infiere la
cantidad de superficie hidrofóbica expuesta al solvente, mientras que FT-IR da una
idea más profunda de la organización estructural de los oligómeros siendo una
técnica particularmente sensible a los arreglos de estructura de láminas β .

Para las medidas de SAXS, la α-sinucleína se incubó hasta 24 horas a 37 ° C bajo

agitación orbital en ausencia o en presencia de doxiciclina. Los datos SAXS se
adquirieron a partir de alícuotas tomadas a diferentes tiempos transcurridos a lo
largo del proceso de agregación . Tenga en cuenta que justo después de su adición,
la doxiciclina no produce un impacto inmediato en la curva de dispersión de la α-
sinucleína en solución. Sin embargo, su influencia puede detectarse claramente
después de 2 h de incubación a través del aumento en la intensidad de dispersión a
valores q bajos en comparación con la dispersión de a-sinucleína libre de
doxiciclina .Tal comportamiento es una huella dactilar de la formación de
agregados de a-sinucleína más grandes en comparación con los autoensamblados
en ausencia de doxiciclina. Esto se reprodujo sistemáticamente con el tiempo. Por
lo tanto, los datos de SAXS demostraron que los oligómeros de α-sinucleína fuera
de ruta formados en presencia de doxiciclina son más grandes que los oligómeros
en ruta. Curiosamente, las correspondientes funciones de distribución de distancia
de pares, p (r), muestran que los oligómeros en la ruta evolucionan a agregados de
tipo fibrilla a lo largo del tiempo. La frecuencia máxima de distancias (r max dentro
del agregado proteico permanece prácticamente constante a 4 nm, mientras que la
dimensión máxima, Dmax , se alarga de 30 nm a 40 nm durante 24 horas () Por otro
lado, los agregados fuera de la ruta presentan un desplazamiento hacia distancias
mayores tanto en r max (hasta 22 nm) como en D max (hasta 55 nm)). Cabe destacar
que pueden formarse agregados de más de 55 nm, pero dicha dimensión está por
encima del límite superior de detección de SAXS en nuestras condiciones
experimentales. Tomados junto con los resultados de TEM, los cambios en las
funciones de la función p (r) indican que la doxiciclina tiene un impacto sobre la
ruta de agregación de α-sinucleína al desviar los oligómeros tempranos alargados
en la ruta hacia la formación de oligómeros más grandes fuera de la ruta.

figura 3
Análisis SAXS de especies monoméricas y oligoméricas de α-sinucleína ( a )
curvas SAXS a partir de α-sinucleína 175 μM incubadas a 37 ° C en ausencia
(símbolos rojos) o presencia (símbolos negros) de doxiciclina 250 μM a las 0
h ( a ) , 2 h ( b ), 16 h ( c ) y 24 h ( d ). Funciones de distribución de distancia
correspondientes p (r) en ausencia ( e ) o en presencia de doxiciclina ( f ): 0 h
(línea oscura); 2 h (línea roja), 16 h (línea azul) y 24 h (línea magenta).
Los espectros infrarrojos, en la región amida I (1,700-1,600 cm -1 ), son
particularmente sensibles a la conformación de la cadena principal de las proteínas,
lo que permite discriminar la composición relativa de los elementos estructurales
secundarios . Con el fin de realizar un análisis comparativo entre α-sinucleína en
ruta y oligómeros fuera de ruta, la proteína se incubó en presencia o en ausencia de
doxiciclina y se tomaron alícuotas a intervalos regulares para la recolección de
espectros infrarrojos. Al comienzo de la incubación, las muestras son claramente
muy similares y sugieren que el contenido estructural es comparable
independientemente de la presencia de Después del proceso de autodesconvolución
de Fourier, la amida I muestra un contorno centrado en 1.649 cm -1eso es típico de
una proteína desplegada . Sin embargo, después de 2 h de incubación ), los
oligómeros fuera de camino reflejan un mayor contenido de estructura secundaria
ordenada, como lo revela la disminución en la banda FTIR a 1.641 cm -1

Figura 4

Espectros FTIR de la región amida I de α-sinucleína 280 μM en tampón

deuterado en ausencia (línea azul) o en presencia (línea roja) de doxiciclina
400 μM después de 0 h ( a ), 2 h ( b ) y 16 h ( c ) incubación a 37 ° C, pD 7 bajo
agitación orbital. Los espectros descondensados (arriba) se realizaron usando
una forma de línea gaussiana / lorentziana mixta de 18 cm y un factor de
-1

mejora de resolución de 2. Los espectros derivados (abajo) se obtuvieron con

una potencia de tres y un punto de rotura de 0.3. Señal de fluorescencia Bis-
ANS de la solución de α-sinucleína (70 μM) incubada a 37 ° C bajo agitación
orbital en ausencia ( d ) o en presencia de doxiciclina 100 μM ( e) Se tomaron
alícuotas de las muestras a lo largo del tiempo. Todos los resultados mostrados
son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.

Tabla 1: evaluación basada en FTIR del contenido de la estructura secundaria

durante el proceso de fibrilación para α-sinucleína humana con doxiciclina
introducida en el momento seleccionado.

El ancho medio a media altura (HWHH) de la banda de Amida I 'refleja el proceso

de estructuración de una proteína y, como se muestra en la figura 4b yc , las
especies fuera de camino parecen estar más estructuradas que las del camino
unos. Además, la cantidad de estructura β y la disposición de las cadenas β también
fueron diferentes en ambas especies. De hecho, los oligómeros de α-sinucleína
fuera de ruta son ricos en estructura de lámina β paralela, como se muestra por la
presencia de una banda a 1.619-1.634 cm -1 y la ausencia de una banda de absorción
a aproximadamente 1.685 cm -1 . Por el contrario, la estructura de lámina β de los
oligómeros en ruta es predominantemente antiparalela, como lo indica una banda a
aproximadamente 1.625 cm -1con un componente de alta frecuencia a
aproximadamente 1.685 cm -1., aproximadamente cinco veces más débil que la
banda a 1.625 cm -1 . Sorprendentemente, la organización diferencial de la
estructura de lámina β en formas paralelas o antiparalelas se ha relacionado
previamente con la citotoxicidad .

Las propiedades fisicoquímicas intrínsecas de las especies oligoméricas, como la

exposición a disolventes hidrófobos, también se han asociado a la toxicidad debido
a su relación con la unión y la perturbación de la membrana, así como a la
disfunción celular. De acuerdo con esto, medimos la hidrofobicidad superficial de
oligómeros de α-sinucleína en ruta y fuera de ruta utilizando bis-ANS, un colorante
conocido por aumentar su rendimiento cuántico de fluorescencia al unirse a bolsas
hidrofóbicas en superficies de proteínas . Los espectros de emisión de bis-ANS
cuando se añaden a las soluciones pre-incubadas de α-sinucleína, revela que hay un
aumento constante de la exposición superficial hidrófoba durante la agregación
( Fig. 4d).), como se refleja en una mejora del 65% en el rendimiento cuántico de
la sonda (calculado a partir de las áreas debajo de la curva). Por el contrario, cuando
estaba presente doxiciclina en la mezcla preincubierta, la intensidad de
fluorescencia permaneció inalterada hasta 16 h ( figura 4e) y alcanzó un aumento
del 10% en la fluorescencia entre 24 y 72 h, lo que indica que oligómeros fuera de
ruta exponen hidrofóbica parches en menor medida.

En general, estos resultados sugieren que la doxiciclina induce cambios

conformacionales diferenciales en oligómeros de α-sinucleína, lo que resulta en la
formación de oligómeros fuera de ruta con características bien distintivas en
términos de forma, tamaño, estructura y exposición hidrofóbica a la superficie.

La doxiciclina transforma la α-sinucleína en oligómeros no tóxicos

La citotoxicidad de la α-sinucleína se ha atribuido a especies transitorias
prefibrilares formadas durante la agregación de proteínas De hecho, la
patogenicidad asociada a estas especies prefibrilares se ha relacionado con la
disposición conformacional de las especies agregadas según lo revelado por los
anticuerpos específicos de conformación así como por los estudios FTIR . Por lo
tanto, evaluamos el impacto de los cambios estructurales inducidos por la
doxiciclina en la patogenicidad de los oligómeros de α-sinucleína. Primero,
llevamos a cabo estudios de viabilidad celular en la línea celular SH-SY5Y usando
el ensayo MTT que informa el número de células viables basado en la actividad
mitocondrial. Para esto, se obtuvieron oligómeros de α-sinucleína en ruta y fuera
de ruta por preincubación de α-sinucleína 140 μM en ausencia o presencia de
doxiciclina 200 μM, respectivamente, durante 16 horas a 37 ° C bajo agitación
orbital. Se añadió una alícuota de 25 μl de cada preparación a las células SH-SY5Y
y se incubó adicionalmente a 37 ° C. Como se describió previamente , las especies
oligoméricas en ruta fueron capaces de disminuir la viabilidad celular como se
refleja por la disminución del 40% en el recambio de MTT Cuando las células se
trataron con oligómeros fuera de ruta, no observamos diferencias significativas con
respecto a los controles en la renovación del MTT. Debería advertirse que la
presencia de doxiciclina en el medio de cultivo no era capaz de prevenir el efecto
perjudicial que ejercían los oligómeros en la vía en las células SH-SY5Y.

Figura 5: Modulación de la citotoxicidad de oligómeros de α-sinucleína por

doxiciclina.
( a ) Viabilidad celular, y ( b ) muerte celular de células SH-SY5Y 24 h después
de la adición de HEPES 20 mM, pH 7,4, tampón de NaCl 150 mM (control),
oligómeros de α-sinucleína en ruta, fuera de la vía α- oligómeros de sinucleína,
o oligómeros de α-sinucleína en el camino con doxiciclina añadida al medio de
cultivo. ( c) Cambios en la permeabilidad de la membrana liposomal con la
adición de la misma especie. La señal de fluorescencia se normalizó mediante
la señal observada después de la adición de Triton X-100, que indujo la
interrupción completa de las vesículas. También se usó una solución
monomérica de α-sinucleína como control negativo para la viabilidad celular,
citotoxicidad y ensayos de fuga. Se prepararon oligómeros de α-sinucleína en
ruta y fuera de ruta incubando α-sinucleína 140 μM en ausencia, o en presencia
de 200 μM de doxiciclina, respectivamente, durante 16 h bajo agitación orbital
a 37 ° C.
Curiosamente, uno de los mecanismos propuestos por los cuales los oligómeros de
α-sinucleína producen citotoxicidad es inducir una perturbación en la integridad de
la membrana celular 34 . Por lo tanto, medimos la liberación de la enzima citosólica
lactato deshidrogenasa (LDH) de las células en el medio, que se usa comúnmente
como una medida de citotoxicidad por deterioro de la membrana ( Fig. 5b ). Una
vez más, los oligómeros en ruta mostraron citotoxicidad contra las células SH-
SY5Y como se refleja por el 40% de aumento en la liberación de LDH en el medio
de cultivo. Por el contrario, en presencia de oligómeros fuera de ruta, la integridad
celular está bien conservada. La preservación de la integridad celular no se observa
cuando se agrega doxiciclina al medio de cultivo antes de la adición de oligómeros
en la ruta.

La capacidad diferencial de los oligómeros de α-sinucleína para afectar la

integridad de la membrana, como se demostró por los ensayos de LDH, también se
analizó mediante ensayos de filtración de contenido en membranas sintéticas. Para
hacer esto, se controló la liberación de calceína atrapada en vesículas lipídicas de
cerebro de rata tras la adición de oligómeros de \ alpha - sinucleína ( Fig. 5c).) En
línea con los ensayos de citotoxicidad, los oligómeros de α-sinucleína en la ruta
indujeron la liberación de la sonda fluorescente de los liposomas, confirmando la
capacidad de estas especies para romper la integridad de la membrana; mientras que
los oligómeros fuera de ruta no mostraron efecto desestabilizador sobre las
membranas lipídicas. La adición de doxiciclina a liposomas no evitó la liberación
de calceína inducida por oligómeros en ruta que muestra que el antibiótico no
estabiliza la membrana mediante una interacción directa ni bloquea el efecto
perjudicial de los oligómeros en ruta al unirse a su superficie.

En conjunto, estos resultados sugieren que el efecto protector de la doxiciclina

podría atribuirse a la remodelación de α-sinucleína en oligómeros fuera de ruta que
no pueden dañar la integridad de la membrana y no por un efecto directo del
antibiótico en las células.

Discusión

El consenso actual sugiere que las sinucleinofatías se desarrollan a partir de

complejas interacciones genético-ambientales y, por lo tanto, más de un proceso
causativo subyace en la patogénesis neurodegenerativa. De hecho, la agregación de
proteínas, la neuroinflamación, el estrés oxidativo, la disrupción funcional
mitocondrial y la disfunción lisosómica constituyen un ciclo sin fin con
consecuencias fatales en las neuronas.

A pesar de la larga búsqueda de nuevos fármacos dirigidos a reducir el impacto de

las sinucleinofatías y particularmente de la EP, hoy en día las terapias disponibles
para estas patologías son meramente paliativas. De hecho, los fármacos que pueden
bloquear el proceso in vitro no funcionan correctamente in vivo debido a su
toxicidad o baja biodisponibilidad en el cerebro. Para superar esta falla, se están
explorando estrategias de desarrollo de fármacos alternativos, como la reutilización
de compuestos existentes con nuevos objetivos , es decir,aprovecha el tesoro de
posibles terapias en la farmacopea. Esto podría ahorrar una cantidad considerable
de tiempo y dinero ya que la información sobre la farmacocinética, la
farmacodinamia y los efectos secundarios de los medicamentos ya están
establecidos.

La doxiciclina, una tetraciclina semisintética de segunda generación, se usa

actualmente como un antibiótico típico en humanos con antecedentes clínicos de
seguridad y buena penetración de la barrera hematoencefálica . Además de su
efecto antibiótico bien caracterizado, la doxiciclina ha revelado una serie de
objetivos diferentes centrados principalmente en la influencia reguladora sobre el
sistema inmunitario, la vía inflamatoria y el estrés oxidativo De hecho, al ajustar la
concentración de doxiciclina, es posible seleccionar la actividad antiinflamatoria o
antibiótica. De esta forma, algunos ensayos clínicos demostraron que la
administración de dosis antibióticas (200-400 mg / día) es responsable del efecto
antimicrobiano que puede conducir a desarrollar resistencia bacteriana y
alteraciones de la flora endógena, mientras que las dosis subantibióticas (20-40 mg
/ día) no alterar la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y ejercer
actividades antiinflamatorias . También se informaron propiedades
neuroprotectoras de la doxiciclina en modelos de isquemia cerebral, lesión de la
médula espinal, EP, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y
esclerosis múltiple. Las propiedades antiinflamatorias de la doxiciclina se han
propuesto como el mecanismo implicado en el efecto neuroprotector. Sin embargo,
el tratamiento con fármacos antiinflamatorios convencionales no ha demostrado ser
efectivo en neuroprotección, lo que sugiere que este mecanismo por sí solo no sería
suficiente .

Aquí demostramos un mecanismo adicional por el cual la doxiciclina podría ejercer

una neuroprotección que podría complementar los efectos antiinflamatorios y
antioxidantes antes bien informados . Mostramos por primera vez que la presencia
de doxiciclina induce una remodelación de los oligómeros de α-sinucleína en
especies fuera de la vía no tóxicas y no sembradas. Este proceso de remodelación
solo es eficiente en las primeras especies del proceso de agregación, ya que la
adición de doxiciclina después de 16 horas de incubación no produjo ningún cambio
en la cinética de agregación de α-sinucleína o su citotoxicidad . De acuerdo con los
datos de RMN, la doxiciclina es capaz de unirse a especies oligoméricas de α-
sinucleína, pero no a la proteína monomérica. El galato rojo Congo, lacmoide y
epigalocatequina, también son pequeñas moléculas que inhiben la fibrilación de α -
sinucleína al interactuar con la proteína monomérica . Por el contrario, la
doxiciclina se une solo a especies oligoméricas que conservan la forma monomérica
de la proteína para su función fisiológica .

La microscopía electrónica mostró que los oligómeros remodelados con doxiciclina

no evolucionan a fibrillas. Además, los estudios de fluorescencia muestran que la
formación de la estructura β cruzada se detiene en presencia de
doxiciclina. Además, se detectó una superficie hidrófoba menor, lo que sugiere una
disposición estructural diferente de la especie intermedia. De hecho, los estudios
infrarrojos demostraron la presencia de láminas β paralelas en lugar de la lámina β
antiparalela típica notificada para las especies oligoméricas tóxicas en el
camino 28. El impacto de la doxiciclina en el ensamblaje de los oligómeros de α-
sinucleína también se evidencia por los cambios en el tamaño y la forma de los
agregados, como lo revelan los experimentos de SAXS. En general, la diferente
organización estructural de oligómeros fuera de ruta da como resultado una
capacidad disminuida para alterar la viabilidad celular y la permeabilidad de la
membrana, en comparación con los oligómeros en ruta.

La baicaleína es un flavonoide activo, que también induce la formación de

oligómeros de sinucleína α-sinucleína no tóxicos, pero su uso como neuroprotector
es controvertido ya que el flavonoide desencadena vías apoptóticas intrínsecas y
extrínsecas 44 . De la misma manera, el ácido gálico (ácido 3,4,5-
trihidroxibenzoico) y algunos de sus derivados pueden interactuar con los
oligómeros de α-sinucleína por un mecanismo similar a la doxiciclina, es
decir , detener el proceso de fibrilación mediante la formación de oligonucleótidos
fuera de ruta. oligómeros tóxicos que son incapaces de inducir la siembra en α-
sinucleína monomérica 45 . Sin embargo, no hay datos sobre biodisponibilidad o
farmacocinética o efectos secundarios de este compuesto in vivo .

La curcumina (diferuloilmetano) también reduce significativamente la toxicidad

celular de los agregados de α-Syn al unirse a oligómeros preformados y
fibrillas 46 con una eficacia comparable con la doxiciclina (relación molar 1:
1) 47 . Sin embargo, la inestabilidad, baja solubilidad, poca biodisponibilidad oral
de curcumina limitan sus aplicaciones clínicas y para superar este inconveniente,
se han desarrollado algunos análogos estructurales de curcumina con propiedades
antiagregantes. En este contexto, no se han informado estudios de toxicidad humana
a largo plazo hasta ahora con análogos estructurales de la curcumina 48 . Por el
contrario, la administración oral de doxiciclina demostró ser un fármaco seguro y
eficaz para tratamientos dermatológicos a largo plazo 49 , 50.. Además, también se
informó que las dosis subantibióticas de doxiciclina no tienen ningún efecto sobre
la composición o la resistencia a los antibióticos de diferentes microfloras 51 .

El efecto de siembra sobre la α-sinucleína monomérica, característica de los

oligómeros tóxicos, también se bloqueó en presencia de doxiciclina. Se ha
demostrado que las especies tóxicas de a-sinucleína pueden transmitirse desde
células enfermas a neuronas sanas donde inducen la conversión de a-sinucleína
nativa en especies oligoméricas tóxicas, siguiendo un mecanismo de nucleación de
siembra 52 , 53 . Nuestros resultados sugieren que las especies remodeladas
estructuralmente con doxiciclina anulan el proceso de siembra y, por lo tanto,
interferirían con el proceso de dispersión ( Fig. 6 ).

Figura 6: diagrama esquemático de la relación de retroalimentación entre α-

sinucleína, mitocondrias y células gliales.
Las especies oligoméricas de α-sinucleína provocan la fragmentación de las
mitocondrias y aumenta la producción de ROS. ROS tiene un impacto sobre la
α-sinucleína monomérica que desencadena su agregación. La α-sinucleína
oligomérica liberada a la matriz extracelular que induce la activación de la
glía. La liberación de factores proinflamatorios induce daño mitocondrial en
un ciclo sin fin. La doxiciclina puede interferir con este círculo vicioso
bloqueando ( i ) la nucleación de oligómeros de α-sinucleína y ( ii ) la siembra,
( iii ) la activación de la glia 16 y ( iv ) la actividad de ROS 37 .

Imagen de tamaño completo

Al unir nuestros resultados, la presencia de doxiciclina puede atenuar el ciclo

patológico descrito en la Fig. 6 en cinco puntos diferentes: inhibición de la
agregación y siembra de sinucleína, neuroinflamación en células gliales, disfunción
mitocondrial y daño de ROS.

De acuerdo con nuestros estudios de dosis: respuesta (ver figura complementaria

S2 ), una concentración equimolar de doxiciclina a α-sinucleína sería adecuada para
alcanzar un efecto protector. Mientras que en el líquido cefalorraquídeo la
concentración consigue mediante doxiciclina durante el tratamiento por vía oral
como antimicrobiano (día 200 mg dos veces) es de aproximadamente 3 M
(considerando la penetración principal del antibiótico en 26%) la concentración de
α-sinucleína es aproximadamente 0,12 nM 54 . Estos datos sugieren fuertemente
que la doxiciclina en dosis subantibióticas (20-40 mg / día) sería suficiente para
ejercer la neuroprotección.

Los resultados presentados en este documento revelan posibles efectos secundarios

protectores para la doxiciclina en el ciclo de patogénesis de las sinucleinopatías que
podrían aprovecharse para reutilizar un viejo fármaco seguro.

Métodos
Preparación de α-sinucleína
La expresión y purificación de a-sinucleína humana recombinante se realizó como
se describió previamente 55 . La pureza de la proteína se evaluó mediante SDS-
PAGE. Se prepararon soluciones madre monoméricas de \ alpha - sinucleína en
HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Antes de las mediciones, las soluciones de
proteínas se filtraron y centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x  g . La
concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm
utilizando el coeficiente de extinción ε 275  = 5600 cm -1 M -1 .

Agregación de proteínas
El protocolo de agregación fue adaptado de estudios previos 56 . Las soluciones
monoméricas de α-sinucleína (70 μM) en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4,
se incubaron en un Thermomixer comfort (Eppendorf) a 37 ° C bajo agitación
orbital a 700 rev./min en ausencia o en presencia de 100 μM de doxiciclina.

Prueba de tioflavina T
La formación de la estructura β cruzada durante la agregación fue seguida por la
adición de la sonda fluorescente de tioflavina T (ThT) en alícuotas extraídas de la
mezcla de incubación en diferentes momentos, de acuerdo con LeVine 22 . Los
cambios en los espectros de emisión de fluorescencia con la longitud de onda de
excitación ajustada a 450 nm se controlaron usando un espectrómetro de PC1 ISS
(Champaign, IL).

Microscopio de transmisión por electrones

Las muestras (30 μl) de una solución de α-sinucleína 14 μM se adsorbieron sobre
rejillas de cobre recubiertas con carbón de formvar de malla 200 descargadas con
gas (Electron Microscopy Sciences) y se tiñeron con uranyLess acuoso (Electron
Microscopy Sciences). El exceso de líquido se eliminó y las rejillas se dejaron secar
al aire. Las muestras se vieron usando un microscopio electrónico de transmisión
Hitachi 7700.

Bis-ANS
La α-sinucleína se agregó tal como se describió anteriormente en ausencia o
presencia de doxiciclina. Se tomaron alícuotas a tiempo regular y se añadió bis-
ANS a una concentración final de 5 μM. Bis-ANS se excitó a 395 nm, y la emisión
de fluorescencia se recogió de 410 a 610 nm.

SAXS
Los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) de α-sinucleína 175
μM, en ausencia o presencia de doxiciclina se obtuvieron en la línea de luz SAXS1
en el Laboratorio Nacional de Luz Síncrotron(LNLS, Campinas, Brasil). La
longitud de onda de la radiación se ajustó a 0.148 nm y se usó un detector Pilatus
300 para registrar los patrones de dispersión. La distancia entre la muestra y el
detector se estableció en ~ 1000 mm, lo que nos permitió explorar un vector de
dispersión mínimo de 0,10 nm -1 , donde q es la magnitud de la dispersión q -vector
definido por q  = (4π / λ ) sin θ ( siendo 2θel ángulo de dispersión). De esta forma,
la distancia máxima de partículas accesible desde nuestra configuración
experimental fue de alrededor de 60 nm. Las muestras se establecieron entre dos
ventanas de mica y un espaciador de 1 mm, manipuladas en un portamuestras
líquido colocado perpendicularmente a la viga entrante. Las curvas obtenidas se
normalizaron teniendo en cuenta la disminución de la intensidad del haz de rayos
X durante el experimento. La curva de dispersión de la solución tampón se restó de
las curvas SAXS de la muestra, teniendo en cuenta la atenuación de cada
muestra. Todas las mediciones se tomaron a temperatura ambiente.

Una Transformada de Fourier conecta la intensidad de dispersión, I (q), a la función

de distribución de distancia de par p (r) en ausencia de efectos de interferencia. Tal
función está libre de modelo y representa la frecuencia de distancias dentro del
volumen completo de la partícula de dispersión, dando así información a la
dimensión máxima de la partícula, Dmax , donde p (r) va a cero. En el documento
actual, las funciones p (r) de las curvas SAXS se obtuvieron haciendo uso del
software GNOM 57 .

NMR
Todos los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Avance III Bruker
600 MHz usando un enfriado criogénicamente de triple resonancia 1 H ( 13 C / 15 N)
sonda TCI. Los experimentos 1D 1 H y 2D 1 H- 15 N SOFAST-HMQC (banda
selectiva optimizada del ángulo corto de transición) se registraron a 15 ° C en
muestras disueltas en tampón Hepes 20 mM a pH 7,4 en presencia de NaCl 150 mM
y 10 % D 2 O. Los espectros SOFAST-HMQC se adquirieron con los siguientes
parámetros: 32 escaneos, 30 ms de retraso de reciclado, 1 K y 256 incrementos y
SW de 16 y 26 ppm en las dimensiones 1 H y 15 N, respectivamente. Después de la
adquisición, los espectros fueron llenos a cero a 4 K ( 1 H) y 2 K ( 15N), procesados
con apodización de la campana sinusoidal y corrección de la línea base.

Para caracterizar la interacción entre doxiciclina y α-sinucleína envejecida,

incubamos soluciones de α-sinucleína monomérica (300 μL, 100 μM) a 37 ° C bajo
agitación constante a 280 rpm usando pequeñas barras magnéticas. Las muestras se
disolvieron en tampón Hepes 20 mM a pH 7,4 con NaCl 150 mM y 10% D 2 O. La
formación de fibrillas de amiloide se controló mediante el dibujo 2 alícuotas en
diferentes momentos de cada muestra, diluyendo ellos en 2 ml de disoluciones en
presencia de 10 μM de tioflavina T y midiendo su fluorescencia a 480 nm como se
describió anteriormente 56 . Retiramos las muestras de la incubadora en los
momentos 0, 8, 24 y 48 h, les añadimos 200 μM de doxiciclina de una solución
madre recién preparada de 5 mM y ejecutamos inmediatamente el 1D- 1Espectros
de H NMR. La meseta de fluorescencia de tioflavina-T después de ~ 40 h de
incubación en estas condiciones de agregación. En otro conjunto de experimentos,
las muestras de α-sinucleína envejecidas durante 0 hy 16 h se centrifugaron durante
1 h, a 15000 rpm, 4 ° C para eliminar especies insolubles que podrían haberse
formado en las condiciones experimentales de nuestros experimentos, antes de
agregarlas a la solución de doxiciclina. Los espectros de RMN se registraron
utilizando 8 puntos K, un SW de 16 ppm, 512 exploraciones y un retraso de reciclaje
de 1 segundo. Los espectros se voltearon a 32 K, se procesaron con apodización de
la campana sinusoidal y se corrigió la línea base. Todos los espectros se adquirieron
y procesaron utilizando Topspin 3.2 (Bruker) y se analizaron usando Topspin
(1D 1 H) y Sparky ( 1 H- 15 N SOFAST-HMQC).

Espectroscopia infrarroja
Se recogieron muestras a 280 μM de α-sinucleína en ausencia o presencia de 400
μM de doxiciclina en tampón 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pD 7.0, D 2 O después
de 0, 2 y 16 h de incubación orbital a 37 ° C . Dado que la α-sinucleína monomérica
era más alta que la especie oligomérica, después de la incubación se separó
parcialmente del monómero usando un filtro de corte Amicon Ultra-0.5 de 100 kDa
y se ensambló en una celda termostatizada entre dos ventanas CaF 2 con una
longitud de ruta de 50 nm . Los espectros se registraron en un espectrómetro Nicolet
5700 equipado con un detector DTGS (Thermo Nicolet, Madison, WI) como se
describió previamente 29 . La cámara de muestra se purgó permanentemente con
aire seco. Los espectros se generaron promediando 256 interferogramas recogidos
con una resolución nominal de 2 cm -1 y apodized con una función de Happ-
Genzel. La contribución de D 2 O en la región amida I 'se eliminó restando los
espectros del tampón de la solución a la misma temperatura para obtener una línea
de base plana entre 1.900 y 1.700 cm -1 . La sustracción del disolvente, la
deconvolución, la determinación de la posición de la banda y el ajuste de la curva
de la banda de amida I original se realizaron tal como se describe 29 . El error en la
determinación del análisis estructural de FTIR a partir de la banda de amida I de
diferentes ejecuciones es del 3%.

Cultivo celular de neuroblastoma humano

Las células SH-SY5Y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero
bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (PS), a 37 ° C y 5% de
CO 2. Para la viabilidad celular y el ensayo de citotoxicidad, las células se
sembraron en placas de 96 pocillos a 15,000 células / pocillo y 30,000 células /
pocillo, respectivamente y se mantuvieron en 100 μl de DMEM suplementado con
10% de FBS y 1% de PS durante 24 horas a 37ºC. Posteriormente, las células se
trataron con una alícuota de 25 μl de HEPES 20 mM, tampón de NaCl 150 mM, pH
7,4 (control) o α-sinucleína 140 μM envejecido durante 16 horas a 37 ° C bajo
agitación orbital en ausencia (en camino oligómeros) o la presencia de 200 μM de
doxiciclina (oligómeros fuera de ruta). Alternativamente, también se añadieron
oligómeros en el camino junto con doxiciclina al medio de cultivo (oligómeros en
el camino + doxy). Después del tratamiento, las células se incubaron durante 24 h
a 37 ° C 5% de CO 2 . Para determinar la viabilidad celular, se usó el ensayo de
actividad metabólica MTT colorimétrica como se describió previamente por
Mosmann.33 . Todos los experimentos se realizaron en sextuplicado, y la viabilidad
celular relativa (%) se expresó como un porcentaje relativo al control de células no
tratadas. La citotoxicidad se determinó utilizando el kit de detección de
citotoxicidad (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se basa
en la medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el
medio de cultivo tras la permeabilización o lisis de las células. El porcentaje de
citotoxicidad se refiere a la actividad de LDH liberada de las células después del
tratamiento con Triton X-100 al 1%.

Ensayo de liberación de calceína

La mezcla de lípidos utilizada para este experimento se extrajo de membranas del
cerebro de ratas blancas Wistar por el método de Folch 58. Las ratas fueron
proporcionadas por el "Bioterio" Instituto de Química Biológica (Facultad de
Bioquímica, Química y Farmacia, UNT, Tucumán, Argentina). Las ratas se
obtuvieron por exocria y se mantuvieron bajo temperatura y humedad controladas
en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h. Los animales se mantuvieron y trataron de
acuerdo con los criterios establecidos en la "Guía para el cuidado y uso de animales
de laboratorio", publicado por el "Institute of Laboratory Animal and National
Research (1999)". Después de la extracción, los lípidos se almacenaron en
cloroformo: metanol (2: 1, v / v). Para la preparación de vesículas multilamelares
grandes (MLV), los lípidos se secaron bajo nitrógeno en la pared de un tubo de
vidrio Corex, se colocaron en un horno de vacío para eliminar completamente el
disolvente restante y luego se rehidrataron en Tris 25 mM, calceína 50 mM, pH 7,4
buffer.59 . Brevemente, MLV se sonicaron con sonicador de tipo sonda bajo
nitrógeno y temperatura controlada. Para eliminar restos de titanio, la suspensión
se centrifugó durante 15 minutos a 1100 x g. Para separar el SUV cargado de
Calcein del tinte libre, utilizamos Sephadex G-75. Durante la incubación, los
cambios en la intensidad fluorescente de las diferentes mezclas se controlaron a
λ exc  = 490 nm, λ em = 510 nm en un espectrofluorómetro PC1 ISS (Champaign, IL,
EE. UU.) Como describió previamente Kendall (47). Se añadió α-sinucleína (140
μM) en ausencia (oligómeros en ruta) o en presencia de 200 μM de doxiciclina
(oligómeros fuera de ruta) durante 16 horas a 50 μM de vesículas lipídicas. La
liberación total de colorante se completó mediante la adición de 0,1% en volumen
 de Triton X-100. El porcentaje de liberación de la sonda se calculó de la siguiente
manera:

donde IF, IT e IB son la intensidad de fluorescencia del colorante liberado por la

proteína, el colorante total liberado y el blanco de control.

Información Adicional

Cómo citar este artículo : González-Lizárraga, F. et al . Reasignación de

doxiciclina para sinucleinopatías: remodelación de oligómeros de sinucleína α
hacia especies estructuradas paralelas de hoja beta no tóxicas. Sci. Rep. 7 ,
41755; doi: 10.1038 / srep41755 (2017).

Nota del editor: Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos
jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Huntington: un estudio piloto . Mov Disord 19 , 692-695, doi: 10.1002 /
mds.20018 (2004).

Expresiones de gratitud
Agradecemos al Laboratorio Nacional de Sincrotrón de Luz (Campinas, SP, Brasil)
por el uso de las instalaciones de línea de haz SAXS. También agradecemos al Dr.
Patrick P. Michel y al Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière (ICM) por
permitirnos usar Cell Culture and Cell Image Platforms. Este trabajo fue apoyado
por subvenciones de FAPESP / CONICET (2014 / 50766-2), PIP-CONICET 0183,
PICT-MINCyT 2012-2882 y PIUNT-UNT D542 / 1.FGL recibió una beca del
Programa Bec.Ar de la Jefatura de Gabinete de Ministros de Argentina y CAMPUS
FRANCE. LRSB y RI están patrocinados por becas de investigación brasileñas del
CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Technológico).

Información del autor

Afiliaciones
1. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO), CCT-
Tucumán e Instituto de Química Biológica Dr. Bernabé Bloj (CONICET-
UNT), Chacabuco 461 (T4000ILI) Tucumán, Argentina
o Florencia González-Lizárraga
o , Sergio B. Socías
o , César L. Ávila
o , Clarisa M. Torres-Bugeau
o Y Rosana N. Chehín
2. Institut National De La Santé et De La Recherche Médicale, U 1127,
CNRS, Unité Mixte De Recherche (UMR) 7225, Sorbonne Universités,
UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Institut Du Cerveau Y De La Moelle
Epinière, ICM, París, Francia
o Florencia González-Lizárraga
o , Julia E. Sepúlveda-Díaz
o Y Rita Raisman-Vozari
3. Instituto de Física de la Universidad de São Paulo - IFUSP, Rua do
Matão, Travessa R, 187, São Paulo, Brasil
o Leandro RS Barbosa
o & Rosangela Itri
4. Laboratorio Max Planck de Biología Estructural, Química y Biofísica
Molecular de Rosario (MPLbioR, UNR-MPIbpC) e Instituto de
Investigaciones para el Descubrimiento de Fármacos de Rosario
(IIDEFAR, UNR-CONICET), Universidad Nacional de Rosario, Ocampo
y Esmeralda, S2002LRK Rosario , Argentina
o Andres Binolfi
o Y Claudio O. Fernandez
5. Departamento de Morfología, Fisiología y Estomatología, Facultad de
Odontología de Ribeirão Preto, Universidad de São Paulo, Brasil, Centro
 de Investigación Interdisciplinaria en Neurociencias Aplicadas
(NAPNA), Universidad de São Paulo, Brasil
o Elaine Del-Bel
6. Laboratoire Croissance, Réparation et Régénération Tissulaires
(CRRET), CNRS ERL 9215, Université Paris Est Créteil, Université Paris
Est, F-94000, Créteil, Francia
o Dulce Papy-Garcia

Contribuciones
FGL, SBS y CMTB diseñaron y realizaron técnicas de fluorescencia. AB, CLA y
COF diseñaron y realizaron un experimento de RMN. LRSB, CLA y RI diseñaron
y realizaron el experimento SAXS. FGL y RNCh. realizó experimentos FTIR y
TEM. FGL, SBS y JESD diseñaron y realizaron ensayos de cultivo celular. DPG y
EDB contribuyeron al diseño experimental. RRV y RNCh. concibió y supervisó la
investigación. Todos los autores contribuyeron a la discusión y participaron en la
edición del manuscrito final.

Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Autores correspondientes
Correspondencia con Rita Raisman-Vozari o Rosana N. Chehín .