Sunteți pe pagina 1din 14

Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a

plantelor

LENUŢA RAKOSY-TICAN

Universitatea “Babeş-Bolyai”, Facultatea de Biologie şi Geologie, Colectivul de Inginerie


Genetică Vegetală, Cluj-Napoca

Introducere
Transformarea genetică a plantelor a cunoscut un progres spectaculos, de la obţinerea
primelor gene himere, în anii şaptezeci ai secolului trecut, la regenerarea primelor plante
transformate genetic purtând gene străine (Gasser şi Fraley, 1989). In ultimul deceniu, s-a
ajuns la eliberarea în câmp şi cultivarea pe scară largă a plantelor transgenice, de la 1,7 ha în
anul 1996 la 39,9 milioane ha în anul 1999 (http://www.agbioview.org). Metodele utilizate
pentru transferul eficace al alogenelor în organisme vegetale receptoare au cunoscut, de
asemenea, un progres nu mai puţin spectaculos, de la metode simple până la adevărate metode
„războinice“, de împuşcare directă a ADN în ţesuturile ţintă. Odată cu dezvoltarea
metodologiei de izolare şi clonare a genelor, respectiv a metodelor de transfer în celulele
vegetale, un număr tot mai mare de plante au fost supuse transgenozei, incluzând grupele cu o
mare importanţă economică: cerealele, leguminoasele, solanaceele, speciile pomicole sau
forestiere. În literatura de specialitate, s-au publicat o serie de sinteze sau chiar cărţi
referitoare la transformarea genetică a plantelor (Davey şi colab., 1989; Potrykus, 1991;
Songstad şi colab., 1995; Potrykus şi Spangenberg, 1995). De aceea, în această lucrare ne-am
propus o prezentare sintetică a metodelor utilizate actualmente pentru transformarea celulei
vegetale, relevarea importanţei genelor marker şi raportoare, respectiv a progresului
înregistrat în introgresia în genomul vegetal a unor gene cu importanţă economică, insistând
asupra datelor recente, spectaculoase, raportate în literatura acestui efervescent domeniu al
geneticii actuale.

Metode de transformare a celulei vegetale


Sunt relativ puţine lucrări care abordează, în mod critic, problema metodelor utilizate
pentru transformarea genetică a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor
biologice care permit transferul şi integrarea unui fragment de ADN străin într-o celulă
vegetală ţintă. In numeroase laboratoare s-a reuşit transformarea genetică a diferitelor specii
de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul (Nicotiana tabacum) sau petunia (Petunia
hybrida), sau dimpotrivă plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic,
cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumită specie de plante poate fi aplicată eficient o
metodă de transformare genetică, sau mai multe.
Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercetările de
genetică moleculară, al cărui genom a fost deja cartat în întregime, se pot aplica cu succes, în

37
LENUŢA RAKOSY-TICAN

funcţie de scopul urmărit, mai multe metode de transformare genetică: transformarea


seminţelor, a explantelor radiculare sau chiar a inflorescenţelor in planta, cu ajutorul
vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea directă a protoplastelor, metoda
biolistică sau microinjectarea. Din păcate, însă, nu se pot aplica cu aceeaşi eficienţă diferite
metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele ţintă pentru transformare nu sunt
întotdeauna cele care posedă totipotenţialitate şi deci pot regenera plante întregi. Mai mult,
eficienţa transformării este dependentă nu numai de specie, dar chiar şi de genotip. De aceea,
găsirea unei metode general aplicabile care să permită transformarea eficientă şi de rutină a
tuturor genotipurilor şi speciilor de plante dorite de experimentatori, rămâne un obiectiv al
cercetării din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate în metode indirecte,
bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, şi metode directe (figurile 1 şi 2).

Fig. 1. Principalele metode utilizate pentru transformarea celulelor vegetale

 METODE INDIRECTE – TRANSFORMAREA MEDIATA


1. Transformarea mediată de bacterii:
• Agrobacterium tumefaciens
• Agrobacterium rhizogenes
2. Transformarea mediată de virusuri
 METODE DIRECTE
♦ Transformarea protoplastelor
♦ Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule
♦ Electroporarea
♦ Electroforeza
♦ Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu

Metode indirecte de transformare a plantelor

Transformarea mediată de Agrobacterium


Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes realizeză
ceea ce adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să
transfere în ţesutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti
(“tumor inducing”) – în cazul speciei A. tumefaciens – sau Ri (“root inducing”) – în cazul
speciei A. rhizogenes, care se integrează în genomul plantei. Ca urmare bacteria A.
tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (“crown gall disease”) iar A.
rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”). In decursul coevoluţiei plantă –
microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a le exploata
mai bine ca şi surse de energie. ADN –T se transmite prin seminţe după legile Mendeliene, ca
genă dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de transformare genetică are loc
în natură fără intervenţia omului. Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau
două copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvenţe a fost regăsită în genomul
unor plante nemodificate genetic (Potrykus şi Spangenberg, 1995). Celulele vegetale care
poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conţine gene cu efect
oncogen. Deleţia acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul şi integrarea
ADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aşa numitele latură
dreaptă şi stângă constănd din o secvenţă alcătuită din 24 de nucleotide care se repetă,
reprezintă situri de recunoaştere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor din
ADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora în celule vegetale ţintă, celule care
nu mai dobândesc caracter tumoral şi deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de
interes – fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importanţă economică – pot fi
2
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

introduse în plante fie prin lincaj cu regiunea ADN-T dezarmată prin recombinare, obţinându-
se un aşa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între secvenţele repetate laterale
într-un replicon independent, ceea ce se numeşte vector binar. Existenţa mai multor regiuni
T în celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală ţintă cu
eficienţă crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utiliza
secvenţe omoloage ADN vegetal ţintă care induc, cu frecvenţă relativ scăzută, recombinarea
omolagă între ADN-T şi ADN vegetal.
Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar
dacă unele dintre acestea nu formeză tumori (de la Riva şi colab., 1998). Deşi spectrul de
gazde pentru această bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obţinut tulpini
supervirulente, capabile să infecteze eficient şi celulele plantelor monocotiledonate (Potrykus
şi Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor şi prin intermediul
acestui vector bacterian. Eficienţa transformării celulei vegetale de către A. tumefaciens,
variază destul de mult în funcţie de specie, genotip sau chiar de ţesutul ţintă. Este foarte
important, totodată, ca ţesutul supus transformării să fie totipotent şi deci să regenereze plante
transformate genetic. De cele mai multe ori, însă, dintr-un ţesut doar un număr limitat de
celule sunt totipotente şi nu întodeauna acestea sunt şi cele transformate de agrobacterium.
Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficientă
mediată de A. tumefaciens. Ca ţesuturi ţintă pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare,
fragmente de rădăcini, hipocotile, peţiol, cotiledoane sau seminţe întregi. Primele plante
transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate în 1983 (Fraley şi
colab.,1983), succesele iniţiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model
tutunul (Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci şi nouăzeci ai secolului douăzeci, tot mai
multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului A. tumefaciens,
multe dintre ele specii cu o mare importanţă economică, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul,
ovăzul, sorgul, trestia de zahăr, grâul şi multe altele (Potrykus şi Spangenberg, 1995;
Songstad şi colab., 1995; de la Riva şi colab., 1998). Eficienţa transformării variază foarte
mult de la o specie la alta în funcţie de: identificarea metodei optime de cultură a ţesutului
ţintă, condiţiile de cultură a materiallului sursă, sau suşa bacteriană utilizată. Aceşti factori
afectează şi numărul de copii de ADN-T care se integrează în genomul vegetal receptor.
Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-
T. Mai recent, cercetările au vizat descifrarea mecanismelor implicate în colonizarea
ţesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al
virulenţei bacteriene (de la Riva şi colab., 1998).

3
LENUŢA RAKOSY-TICAN

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de
tutun în anul 1977 (Ackermann, 1977). Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri
determină formarea rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta
gene de interes, dacă acestea au fost integrate în ADN-T, respectiv pot regenera plante
transformate genetic. O etapă intermediară, în procesul de transformare mediată de A.
rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi şi ramifica.
Astfel, prin cultura rădăcinilor firoase se pot obţine metaboliţi secundari sau pot fi realizate
studii fundamentale privind creşterea şi dezvoltarea rădăcinilor. Acest sistem experimental
este foarte potrivit şi pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi biochimice mai
simple şi, deci, mai uşor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate uşor, folosind un
echipament simplu şi ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt
stabile din punct de vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A.
rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri şi un vector “binar”, de obicei o
plasmidă mai mică. Aceasta din urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o
genă care conferă rezistenţă la un antibiotic, o genă raportoare - sau marker pentru vizualizare
fenotipică şi o genă cu importanţă economică. Avantajul acestui sistem este acela că cele
două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea rădăcinilor firoase, şi ADN-T de pe
vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiţi în plantele transformate şi deci,
vor segrega independent în descendenţă. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri
este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uşor
identificate şi selectate prin prezenţa fenotipului de rădăcină firoasă.
Sistemul de transformare mediată de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de
specii de plante (în jur de 200 încă în 1989 – Tepfer 1989), dar asemănător sistemului A.
tumefaciens răspunsul optim variază în funcţie de specie, genotip sau suşa bacteriană.
Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpină
de la plante tinere, fragmente de peţiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau
cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau
tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar, formând rădăcini
firoase numai la una din extremele explantului, rădăcini capabile să ignore forţa
gravitaţională. Mai mult, există date experimentale care sugerează efectul de piticire a
plantelor indus de una dintre genele de virulenţă, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu
importanţă practică mai ales pentru unele plante horticole (Curtis şi colab., 1996).

4
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

Figura 2. Reprezentarea etapelor de transformare şi regenerare a plantelor transgenice pentru două


metode eficiente: stânga – transformarea mediată de Agrobacterium; dreapta – metoda de împuşcare directă a
ADN.

Transformarea mediată de virusuri


Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor
eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deşi, în 1984 a fost posibil
transferul unei gene de rezistenţa la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson şi colab.,
1984), cercetările ulterioare au demonstrat că genomul viral nu poate accepta şi transfera
fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că virusurile ARN pot genera
ADNc prin transcripţie inversă a generat sperenţa că, mult mai numeroasele virusuri ARN ar
putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au întâmpinat
alte dificultăţi. ADNc viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principala
sursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar
utilizaţi în experimentele de transformare genetică a plantelor.

Metode directe de transformare a plantelor

Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN


Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie a
totipotenţialităţii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate (Takebe şi
colab., 1971) până astăzi numărul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit
posibilă a crescut permanent, ajungând actualmente la aproximativ 400 de specii de plante.
Dacă până în anul 1985 tehnologia protoplastelor se putea aplica cu succes mai ales
Solanaceaelor şi Brassicaceaelor, o dată cu descoperirea totipotenţialităţii protoplastelor
izolate din suspensii celulare embriogene de cereale s-au deschis noi oportunităţi de
modificare genetică a acestui important grup de plante.
Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN şi selecţia
transformanţilor. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii
ADN străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acţionează ca un factor de
stress care induce reacţii de răspuns la rănire – reacţii presupuse a declanşa starea de
competenţă atât de importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de
protoplaste se aseamănă cu o suspensie bacteriană avănd avantaje similare prin posibilitatea
de a cultiva populaţii mari de celule individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile
derivate din protoplaste au în general origine clonală provenind din celule individuale.
Eficienţa selecţiei transformanţilor este, prin urmare, maximă în cazul protoplastelor deoarece
se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru
transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, şi
anume:
• Tratamente chimice cu agenţi permeabilizanţi (mai ales polietilenglicol – PEG): PEG şi
alţi agenţi chimici pot permeabiliza membrana plasmatică permiţând intrarea unor
macromolecule, ADN, în citoplasmă. Mecanismul intim al acestui proces nu este pe
deplin înţeles. Primele date raportate în literatură se referă la transferul ADN-T, provenind
de la Agrobacterium tumefaciens, în protoplaste de petunia în prezenţa PEG (Draper şi
colab., 1982). Primele plante transgenice au fost obţinute la tutun prin această metodă de
către Paszkowski şi colab. (1984). Transformarea protoplastelor prin permeabilizare cu
PEG a fost realizată cu succes pentru multe specii de plante, atât dicotiledonate cât şi

5
LENUŢA RAKOSY-TICAN

monocotiledonate, cheia succesului reprentând-o existenţa unui protocol eficint de


regenerare a plantelor din protoplaste.
• Electroporarea – implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezenţa
unor pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută şi durată foarte scurtă, porii
formaţi în membrană permiţând intrarea ADN străin în citoplasmă (vezi Rakosy-Tican şi
colab., 2000). Electroporarea a devenit o metodă de rutină pentru transformarea
protoplastelor vegetale, dar şi pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante
electroporarea protoplastelor se foloseşte eficient atât pentru analiza expresiei transiente a
transgenelor cât şi pentru transformarea permenetă, pentru numeroase specii de plante
incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină necesitatea
utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condiţiile oponenţei
acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker.
Avantajele electroporării constau în eficienţa crescută a incorporării ADN străin,
reproductibilitatea şi simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării
o reprezintă capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar şi acest dezavantaj a fost
depăşit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau chiar ţesuturilor întregi.
• Sonicarea – permeabilizarea membranei protoplastelor în prezenţa ultrasunetelor s-a
dovedit, de asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale.
Ulterior metoda a fost aplicată şi celulelor sau ţesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară
mai redusă comparativ cu electroporarea (Zhang şi colab., 1991).
• Microinjectarea – constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în
protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale
întregi sau a ţesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct de
vedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent (Kost şi colab., 1995) şi constă
în imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun într-un strat foarte subţire de mediu
solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile
care a permis localizarea şi monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate,
respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.
• Fuziunea cu lipozomi – fuziunea lipozomilor încărcaţi cu ADN cu membrana plasmatică a
protoplastelor şi eliberarea ADN străin în citoplasmă a fost demonstrată în 1990
(Cacboche, 1990). Metoda nu prezintă avantaje deosebite comparativ cu alte metode de
transfer direct, de aceea este mai puţin utilizată. S-a încercat, de asemenea, utilizarea
lipozomilor pentru a transporta ADN în celule sau ţesuturi întregi, în ideea trecerii
lipozomilor prin plasmodesme. S-a demonstrat însă că peretele celular este o barieră de
netrecut pentru lipozomi iar plasmodesmele se închid ca răspuns la rănire. O idee
interesantă a fost aceea a injectării lipozomilor în vacuola unor celule vacuolate. In acest
caz s-a constatat fuziunea lipozomilor cu tonoplastul şi eleiberarea ADN în citoplasmă.
Deşi elegantă această metodă are aplicaţii restrânse deoarece celulele vacuolate nu sunt
totipotente (Potrykus, 1991).

Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule


Metoda biolistică (“biolostics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în
ţesuturi ţintă (Klein şi colab., 1987), este cea mai spectaculoasă metodă de transformare
genetică a plantelor care a declanşat un val de entuziasm în rândul specialiştilor din acest
domeniu. In dezvoltarea acestei tehnici s-a investit foarte mult efort şi bani dar şi rezultatele
obţinute au fost pe măsura aşteptărilor. Metoda constă în accelerarea unor particule foarte
mici (1μm diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în ţesuturi
vegetale ţintă. Această tehnică are numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate
generală: este o metodă uşor de aplicat, printr-o împuşcătură pot fi ţintite mai multe celule,

6
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

celulele supravieţuiesc după împuşcare, genele purtate de particule îşi păstrează activitatea
biologică, particulele pot fi împuşcate în stratele superficiale sau în profunzimea unui organ
vegetal, celulele ţintă pot fi foarte diferite: polen, celule în suspensie, embrioni imaturi, celule
din ţesuturi diferenţiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor sale biolisticul a devenit
metoda favorită în numeroase laboratoare, permiţând transformarea cu succes a unor plante
pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul,
trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicaţie aparte a fost utilizarea împuşcării de
microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea
mediată de Agrobacterium tumefaciens (Bidney şi colab., 1992). Mai mult, s-a reuşit
împuşcarea directă în ţesuturi vegetale a celulelor bacteriene întregi.

Electroforeza
Migrarea ADN printr-un ţesut vegetal ţintă a fost o altă idee interesantă pentru
transferul de gene şi a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacţi de orz (Ahokas,
1989). In aceste experimente s-a demonstrat expresia tranzientă a alogenelor. Ulterior s-a
imaginat un sistem simplu pentru realizarea electroforezei folosind embrioni zigotici
(Songstad şi colab., 1995)(Fig. 3).

Figura 3. Reprezentarea metodei de electroforeză a ADN în ţesuturi vegetale ţintă (după Songstad şi colab.,
1995).

Condiţiile optime pentru electroforeza embrionilor sunt considerate: un curent de 0,5


mA la 25V/embrion, timp de 15 min. In aceste condiţii în jur de 50% din embrioni rămân
viabili. S-a reuşit, de asemenea, transformarea permanentă, folosind genele marker de
rezistenţă la kanamicină şi GUS (β-glucuronidază), a embrionilor unei specii de orhidee
(Griesbach şi Hammond, 1993). Aplicarea acestei tehnici prezintă interes deosebit pentru
acele specii care nu au dat rezultate prin aplicarea unor metode ca biolisticul sau
electroporarea.

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“)


Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin
această tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună
cu ADN şi fibre de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereţii celulari permiţând
ADN să pătrundă în citoplasmă. Metoda a fost aplicată iniţial transformării embrionilor de
insecte, iar ulterior s-a dovedit eficientă şi în transformarea celulelor vegetale (Kaeppler şi
colab., 1990). Cercetările de microscopie electronică au relevat penetrarea peretelui celular de
către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafaţa fibrelor şi este introdus odată cu
7
LENUŢA RAKOSY-TICAN

acestea în celulă. Având proprietăţi fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură de siliciu
sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică tranzientă a fost raportată folosind această
tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun şi Agrostis alba. Transformarea
stabilă a fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb şi tutun. Datele
obţinute au indicat transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la
porumb, de aceea se impun cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda
prezintă avantajul de a fi foarte simplă şi ieftină, dar datorită riscurilor potenţiale pentru
sănătatea umană se caută materiale alternative, eventual biodegradabile (Songstad şi colab.,
1995).
Alte metode de transfer direct al ADN în celulele vegetale: există o serie de alte
metode cu aplicabilitate restrânsă de transformare a celulei vegetale cum ar fi: îmbibarea
ADN în ţesuturi utilizând seminţe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului
polinic, macroinjectarea ADN în ţesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora
peretele celular şi plasmalema. Astfel de metode se află, actualmente, în diferite faze de
experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesită
faze de cultură in vitro. O astfel de metodă, cu potenţial deosebit este transformarea
grăuncioarelor de polen, dar deocamdată rezultatele în acest domeniu sunt relativ modeste
(Potrykus, 1991).

Genele marker şi genele raportoare – importanţa lor pentru


cercetările de genetică vegetală
Alogenele sunt introduse experimental în plante cu scopul de a obţine proprietăţi noi
sau a altera caracterele acestora. In cazul plantelor, din păcate, eficienţa transformării stabile
este scăzută, doar o parte din celulele expuse ADN integrează genele străine, iar dintre aceste
numai celulele totipotente regenerează clone transformate. De aceea, este nevoie de sisteme
de selecţie foarte eficiente. In acest scop se folosesc gene marker sau chiar compuşi
fitotoxici. Genele marker sunt acele gene care permit selecţia celulelor care le poartă, iar
genele raportoare sunt gene care codifică proteine uşor de evidenţiat în celule sau extracte
celulare (Fig. 4). Unele gene pot fi considerate atât gene marker cât şi raportoare. In general
ca gene marker se utilizează gene care conferă rezistenţă la antibiotice sau erbicide (Tabelul
1), dar mai recent s-au dezvoltat şi metode de selecţie pozitivă utilizând gene bacteriene ce
permit metabolizarea unui anumit substrat (manoză sau xiloză – Joersbo şi Okkels, 1996)
(figura 4).

PROMOT GENA TERMINATOR


ER (35S) MA (nos)
RKE
R

REZISTENTA LA ANTIBIOTICE
REZISTENTA LA ERBICIDE
 GUS (GLUCURONIDAZA)
NPT II (NEOMICINFOSFOTRANSFERAZA II)
 LUCIFERAZA

8
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

GFP= GREEN FLUORESCENT PROTEIN


 SISTEM DE SELECTIE POZITIVA
(Genele: man A – pentru fosfomanozizomaraza; xylA – pentru xilozizomeraza)

Figura 4. Reprezentarea schematică a unei construcţii genetice de bază şi a principalelor gene marker sau
raportoare utilizate în cercetările de inginerie genetică vegetală; sunt marcate (săgeată) acele gene care pot fi
uşor vizualizate (gene raportoare).

Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizată gena nptII, sau neo, genă izolată din
transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Această genă codifică neomicinfosfotransferaza
– enzima implicată în detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina,
kanamicina, paramomicina sau geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu
gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul – ca să
le amintim pe cele mai importante. Pentru această genă ca agenţi de selecţie se utilizează cel
mai mult kanamicina (50 – 100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales
monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicină, în acest caz geneticina dând
rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat că la unele specii kanamicina poate interfera cu
procesele de organogeneză, afectând eficienţa regenerării plantelor transformate.

Tabelul 1. Principalele gene marker, de selecţie, folosite în transformarea plantelor (după


Schrott, 1995).

Agent de selecţie Gena marker Marker de selecţie


kanamicină, nptII (APH3´II) neomicinfosfotransferaza II
neomicină
geneticină
(GA18)
gentamicină aacC3, aacC4 gentamicin-3-N-acetiltransferaza
higromicină hph, hpt (APH4) higromicin-fosfotransferaza
metotrexat dhfr dihidrofolatreductaza
spectinomicină ADNr16S ARNr 16S
aadA aminoglicozidă-3’-adeniltransferaza
streptomicină SPT streptomicinfosfotransferaza
ADNr 16S ARNr 16S
aadA aminoglicozidă-3’-adeniltransferaza
bleomicină, ble -
fleomicină
blasticidină bsr blasticidin S deaminaza
sulfonamidă sul dihidropteratsintaza
fosfinotricină bar fosfinotricinacetiltransferaza
clorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetază
bromoxinil bxn bromoxinilnitrilaza
glifozat EPSPS 5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza
2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza
atrazină psbA proteina QB
2,2-DCPA dehalogenaza

9
LENUŢA RAKOSY-TICAN

4-metil-triptofan tdc triptofandecarboxilaza


nitrat NR nitratreductaza
S-amonoetil-L- DHPS dihidropicolinatsintetaza
cisteină
lizină/treonină AK aspartatchinaza
aminoetil-cisteină ocs octopinsintetaza

O altă genă marker mult utilizată este gena hpt sau hph, genă izolată tot de la bacteria
E. coli codificând enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Această enzimă detoxifică
antibioticul higromicină B, antibiotic faţă de care majoritatea ţesuturilor vegetale sunt foarte
sensibile. De aceea, această genă marker a fost utilizată pentru transformarea multor specii de
plante, cum ar fi: tutunul, Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina
este îndeosebi foarte potrivită ca agent de selecţie pentru cereale, folosindu-se în concentraţii
de 25-200 mg/l. Secvenţa codantă a genei a fost, de asemenea, modificată pentru o expresie
mai bună în celula vegtală.
Dintre genele care conferă rezistenţă la erbicide cel mai mult a fost utilizată gena bar,
izolată de la bacteria Streptomyces hygroscopicus şi gena pat de la S. viridochromogenes,
ambele codificând enzima fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ
cel mai mult utilizat ca erbicid de selecţie a plantelor transformate genetic, genele amintite
fiind transferate cu succes la plante ca: tutunul, rapiţa, porumbul, orezul, grâul şi altele.
O altă genă marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductază (DHFR),
izolată tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR conferă rezistenţa la un analog al
acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la concentraţii mici ale
acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferată la specii cum ar fi: tutunul,
petunia şi grâul.
Genele raportoare, spre deosebire de markerii de slecţie nu conferă celulelor rezistenţă
faţă de un anumit compus. Ele codifică proteine care pot fi detectate direct sau catalizează
reacţii specifice ai căror produşi pot fi detectaţi prin metode relativ simple. Genele raportoare
permit studiul factorilor de transcripţie cis sau trans, în condiţiile transformării tranziente sau
permanente, precum şi monitorizarea şi optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai
importante gene raportoare sunt:
♦ gena gus (uidA) – codifică β-glucuronidaza (GUS) şi a fost izolată de la E. coli
K12 (Jefferson şi colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizată la
plante. Există pentru această hidrolază compuşi substat pentru evidenţierea prin
metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice – la nivelul ţesuturilor
rezultând un compus de culoare albastră uşor de evidenţiat. La pH-ul utilizat
pentru determinarea GUS nu există activitate β-glucuronidazică detectabilă în nici
un ţesut vegetal. Toate metodele de determinare se aplică însă, numai celulelor
fixate, nonviabile.
♦ gena raportoare luc pentru enzima luciferază foloseşte un sistem substrat-
enzimă care produce bioluminescenţă. Gena luc a fost izolată de la o specie de
licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimată în plante (Ow şi
colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasă din ţesuturi iar activitatea
ei poate fi determinată în prezenţa luciferinei. Dar, există şi o metodă de
determinare non-letală şi neinvazivă direct în ţesuturile şi organele plantelor
transformate, pentru măsurarea bioluminescenţei fiind necesar un luminometru.
♦ gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (GFP) – reprezintă cea mei
nouă genă raportoare şi totodată cea mai spectaculoasă şi avantajoasă. Gena a fost
izolată de la o meduză, Aequarea victoria, fiind transferată la câteva specii de
10
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

plante (Chalfie şi colab., 1994). GFP prezintă o serie de avantaje şi anume: nu


necesită un substrat, proteina se evidenţiază în ţesuturi intacte in vitro şi in vivo,
prin excitarea în UV, proteina poate fi fuzionată cu alte proteine permiţând
monitorizarea traficului proteic şi a metabolismului (vezi Rakosy-Tican şi colab.,
1999; 2000).
♦ gena cat izolată de la E. coli, codifică enzima cloramfenicolacetiltransferaza
(CAT), fiind, de asemenea, mult utilizată ca genă raportoare la plante.
Determinarea sa este mai pretenţioasă bazându-se pe monitorizarea acetilării
cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului,
produşii fiind separaţi prin cromatografie în strat subţire (TLC) şi măsuraţi prin
densitometrie sau prin scintilaţie. Uneori poate exista activitate CAT şi în unele
ţesuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afectează eficienţa acestui
sistem.
♦ antocianii sunt pigmenţi roşii sau purpurii care se acumulează în vacuole în
unele ţesuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlată de gene structurale
şi reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate şi clonate. Astfel de gene pot
fi utilizate ca gene raportoare în ţesuturile şi organele unor genotipuri care conţin
gene structurale dar nu sintetizează antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri
prezintă o serie de avantaje: nu necesită un substrat, se exprimă doar în celulele
viabile şi metabolic active, sunt uşor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat
genele pentru factorii de transcripţie R şi C1 de la porumb (Schrott, 1995).
♦ genele care conferă rezistenţă la streptomicină şi/sau spectinomicină – au fost,
de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care îl au, prin
inactivarea cloroplastelor.

Progrese recente în transferul unor gene cu importanţă economică

De la cercetările fundamentale bazate pe utilizarea markerilor de selecţie sau a genelor


raportoare s-a trecut treptat la utilizarea unor gene cu importanţă economică (figura 5).

Fig. 5. Cateva exemple de plante transgenice purtand gene cu importanţă


economică
♦ Tomatele FLAVR SAVR – gena antisens pentru poligalacuronaza
♦ Garoafe cu viaţă prelungită in vază – modificarea metabolismului etilenei
♦ Garoafe mov – “Moondust”, “Moonshadow”
♦ Petunii portocali (purtand gena dfr de la porumb)
♦ Plante rezistente la erbicide
♦ Plante rezistente la insecte (gena pentru endotoxina Bt)
♦ Plante rezistente la virusuri – gene pentru “coat protein”
♦ Modificări ale metaboliţilor primari
 Proteine
 Uleiuri
 Amidon
 Vitamina A (“golden rice”), vitamina E
♦ Plante bioreactoare (vaccinuri, anticorpi, proteine din lapte uman, proteina
din fibra pânzei de paianjen)
♦ Fitoremediere – plante rezistente sau care acumulează agenţi poluanţi

11
LENUŢA RAKOSY-TICAN

Astfel, în prima generaţie de planbte transformate genetic testate în cultura în câmp,


sunt incluse plantele rezistente la erbicide, la insecte şi virusuri. Pentru rezistenţa la erbicide
s-au utilizat genele de rezistenţa deja descrise ca gene marker. Rezistenţa la insecte s-a
obţinut, în această primă etapă, prin transferul unei gene pentru o endotoxină izolată de la
bacteria Bacillus thuringiensis, aşa numita toxină Bt. Rezistenţa la virusuri a fost obţinută prin
transferul unor gene pentru proteine capsidale virale, care induc rezistenţa la un spectru mai
larg de virusuri. Tot în prima generaţie de plante transgenice pot fi considerate şi tomatele
FLAVR SAVR, tomate care au fost transformate cu o genă antisens pentru enzima
poligalacturonază, implicată în înmuierea fructelor. S-au obţinut, astfel, tomate care se
înmuiau mai greu având totodată calităţi organoleptice îmbunătăţite. Aceste tomate au fost
primele plante transformate genetic introduse în consumul uman. Generaţiile următoare de
plante transgenice cuprind plante având modificate căile metabolice – plante mai bogate în
provitamina A sau E sau îmbogăţite în fier – orezul auriu („golden rice“), plante având uleiuri
de calitate superioară pentru consumul uman sau uleiuri noi pentru uz industrial, plante care
produc noi hidrocarburi, amidon de calitate mai bună, proteine îmbunătăţite sau proteine noi –
de exemplu o proteină cu efect inhibitor asupra bacteriilor care produc carii dentare (cum este
Streptococcus mutans), chiar vaccinuri sau proteine de uz terapeutic, noi strategii pentru a
obţine plante rezistente la boli virale, fungice sau bacteriene sau rezistente faţă de nematode,
plante rezistente la uscăciune şi extreme termice, plante ornamentale având culoarea, mirosul
sau habitusul modificat şi altele (Herbes şi Sonnewald, 1999; http://www.agbioview.org)..
Progresul cercetărilor în acest domeniu este atât de alert încât o prezentare exaustivă
este, actualmente, aproape imposibil de realizat. Deşi, realizările sunt extraordinare iar
perspectivele de aplicare pe scară largă ar rezolva multe probleme de producţie şi calitate a
produselor agricole pentru viitorul apropiat şi îndepărtat, se înregistrează astăzi, din păcate, o
criză în domeniul aplicării biotehnologiilor vegetale cauzată de percepţia publică şi actvitatea
unor organizaţii ecologiste. Problemele etice pe care le ridică aplicarea noilor biotehnologii
trebuie analizate şi rezolvate cu multă chibzuinţă şi deschidere fără a frâna progresul din
acest promiţător domeniu al geneticii (vezi Rakosy-Tican, 1998).

Bibliografie
1. Ackermann C. Pflanzen aus Agrobacterium rhizogenes Tumoren aus Nicotiana tabacum.
Plant Sci. Lett., 8, 23-30 (1977).
2. Ahokas H. Transfection of germinating barley seed electrophoretically with exogenous
DNA. Theor. Appl. Genet., 77, 469-472 (1989).
3. Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile
bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium
tumefaciens. Plant Molec. Biol., 18, 301-313 (1992).
4. Brisson N., Paszkowski J., Penswick J.R., Gronenborn B., Potrykus I., Hohn T. Expression
of a bacterial gene in plants by using a viral vector. Nature, 310, 511-514 (1984).
5. De la Riva G.A., González-Cabrera J., Vásquez-Padrón R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium
tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic Journal of
Biotechnology, 1, 1-16 (1998).
6. Caboche M. Liposome-mediated transfer of nucleic acids into plant cells. Physiol. Plant,
79, 173-176 (1990).

12
Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor

7. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a
marker for gene expression. Science, 263, 802-805 (1994).
8. Curtis I.S., He C., Power J.B., Mariotti D., de Laat Ad., Davey M.R. The effects of
Agrobacterium rhizogenes rol AB genes in lettuce. Plant Sci., 115, 123-135 (1996).
9. Davey M.R., Rech E.L., Mulligan B.J. Direct DNA transfer to plant cells. Plant Mol. Biol.,
13, 273-285 (1989).
10. Draper J., Davey M.R., Freeman J.P., Cocking E.C., Cox B.J. Ti plasmid homologous
sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia
protoplasts. Plant Cell Physiol., 23, 451-458 (1982).
11. Fraley R.T., Rogers S.C., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Fink C., Hoffman N.,
Sanders P. Expession of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4803-
4807 (1983).
12. Gasser C.S., Fraley R.T. Genetically engineering plants for crop improvement. Science,
244, 1293-1299 (1989).
13. Griesbach R.J., Hammond J. Incorporation of GUS gene into orhids via embryo
electrophoresis. Acta Hort., 336, 165-169 (1993).
14. Herbes K., Sonnewald U. Production of new/modified proteins in transgenic plants.
Current Opinion in Biotechnology, 10,163-168 (1999).
15. http://www.agbioview.org
16. JeffersonR.A., Burgess S.M., Hirsh D. β-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-
fusion marker. Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 8447-8451 (1986).
17. Joersbo M., Okkels T. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive
selection. Plant Cell Rep., 16, 219-221 (1996).
18. Kaeppler H.F., Gu W., Somers D.A., Rines H.W., Cockburn A.F. Silicon carbide fiber-
mediated DNA delivery into plant cells. Plant Cell Rep., 8, 415-418 (1990).
19. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering
nucleic acids into living cells. Nature, 327, 70-73 (1987).
20. Kost B., Galli A., Potrykus I., Neuhaus G. High efficiency transient and stable
transformation by optimized DNA microinjection into Nicotiana tabacum protoplasts.
J. Exp. Bot., 46, 1157-1167 (1995).
21. Ow D.W., Wood K.V., Deluca M., Dewet J.R., Helinski D.R., Howell S.H. Transient and
stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants.
Science, 234, 856-859 (1986).
22. Paszkowski J., Shilito R.D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I. Direct
gene transfer to plants. EMBO J., 3, 2717-2722 (1984).
23. Potrykus I. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42, 205-225 (1991).
24. Potrykus I., Spangenberg G. (eds.). Gene Transfer to Plants. Springer Lab Manual,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York (1995).

13
LENUŢA RAKOSY-TICAN

25. Rakosy-Tican L. Plant genetic manipulation strategies from the point of view of the risks for
man and environment. In: Comisia Naţională UNESCO - Primul Simpozion Naţional (cu
participare internaţională): Implicaţii ştiinţifice şi bioetice în analiza şi manipularea
genomului - texte selectate, Bucureşti, Universitatea Bucureşti Centrul de analize
Genomice şi Citogenetice Moleculare - CENTRAGEN, 119-124 (1998).
26. Rakosy-Tican L., Bancoş S., Ispas G. Utilizarea genei proteinei cu fluorescenţă verde (GFP)
ca marker în experimente de transformare genetică şi hibridare somatică a plantelor. In:
Cachiţă-Cosma D., Ardelean A., Crăciun C. (eds.), Culturi “in vitro” la
cormofite, Risoprint Cluj-Napoca, 201-206 (1999).
27. Rakosy-Tican L., Neamţu S., Turcu I., Lucaciu C.M. Electroporarea şi
electrostimularea, tehnici cu implicaţii în biotehnologia vegetală. In: Actualităţi
şi perspective în biotehnologia vegetală - Lucrările celui de al IX-lea Simpozion
Naţional de Culturi de Tesuturi şi Celule Vegetale - D. Cachiţă-Cosma, A.
Bavaru, A. Brezeanu (eds.), "Ovidius" University Press, Constanţa, 64-79 (2000).
28. Rakosy-Tican L., Aurori A., Aurori C.M. Green fluorescent protein (gfp) – a new
marker gene for plant genetic engineering. In: Eds. Crăciun C., Ardelean A. Current
Problems in Cellular and Molecular Biology. V, Editura RISOPRINT Cluj-Napoca, 532-
537 (2000).
29. Schrott M. Selectable markers and reporter genes. In: Potrykus I., Spangenberg G. (eds.)
Gene Transfer to Plants. Springer Lab Manual, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
New York, 325-336 (1995).
30. Songstad D.D., Somers D.A., Griesbach R.J. Advances in alternative DNA delivery
techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40, 1-15 (1995).
31. Tepfer D. Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having
applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. In:
Kosuge T., Nester E. (eds.), Plant-microbe interactions. McGraw Hill, New York,
294-342 (1989).
32. Zhang L-J., Cheng L-M., Xu N., ZhaoN-M., Li C-G., Yuan J., Jia S-R. Efficient
transformation of tobacco by ultrasonication.Bio/Technology, 9, 350-351 (1991).

14